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Thesis (Ph.D. in Cell Biology, Stem Cells, & Development) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 138-155). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2006. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains x, 202 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Resumo: Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to in... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-04T17:57:27Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Ie_Rolando_Final[3220].pdf: 2455707 bytes, checksum: 3f68750eb72fdc030f1392cc3293f665 (MD5) / Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Boa tarde. Fazer as seguintes modificações: - Alterar o título do arquivo para o nome do trabalho, ou seja, o arquivo deverá ter o título da dissertação; - Incluir a folha de aprovação com data e assinada pela banca; - Acertar a formatação da ficha catalográfica; - Corrigir a palavras chave "veneno serpente" que estão separadas, para "venenos de serpentes" como consta no seu trabalho. Qualquer dúvida, entre em contato. abs. Disleide Silvia Valerio Gounella Bibliotecária CLP - São Vicente Fone: (13)3569-7154 Mailto: disleide@clp.unesp.br skype: disleidesilviavaleriogounella on 2018-04-04T19:13:48Z (GMT) / Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-11T17:36:23Z No. of bitstreams: 1 Avaliação da ação protetora de extratos de Laguncularia racemosa na evolução da atividade farmacológica de sPLA2 Danos moleculares e resposta antioxidante durante o processo inflamatório..pdf: 3375211 bytes, checksum: 47ae3733003877ba3ff44a4417474111 (MD5) / Approved for entry into archive by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br) on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Outra / Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em biomoléculas efetuados por EROs e ERNse a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de serpentes. Recentemente demonstramos que a administração de extratos de Laguncularia racemosa (mangue branco) capazes de inibir a ação da trombina, entretanto não foram efetuadas avaliações se a aplicação do extrato de L. racemosa frente a Cdt sPLA2. Também e importante salientar que apesar de existir inúmeros trabalhos de caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de sPLA2 de serpentes até o presente momento poucos trabalhos tiveram como objetivo sua produção de forma recombinante. Este ponto é importante pois a manipulação gênica destas proteínas, através de mutações sitio dirigidas, podem auxiliar a identificar resíduos envolvidos na catálise, levando a uma melhor compreensão dos mecanismos funcionais, abrindo caminho para novas abordagens terapêuticas para o tratamento do envenenamento por serpentes. Adicionalmente, a enzima sPLA2 de origem animal é utilizada em processos biotecnológicos e possui importância econômica. Este trabalho teve dois grandes objetivos: 1) investigar a existência de danos oxidativos, a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), bem com avaliar possíveis efeitos protetores da administração de extratos butanólico e de acetato de etila extraídos de folhas de L. racemosa após a inoculação da Cdt sPLA2 na fase tardia da edemaciação; 2) Obtenção de sPLA2 recombinante de Cdt (Cdt sPLA2r) visando fornecer subsídios para sua manipulação genética e maior entendimento de seu funcionamento. Com relação ao primeiro objetivo nossos resultados indicam que os extratos de L. racemosa não são capazes de inibir o processo de edemaciação induzido por Cdt sPLA2. A investigação de processos indicadores de estresse oxidativo como oxidação de sulfidrilas, carbonilação proteica e peroxidação lipídica não idicaram a existência de estresse oxidativo na fase tardia do processo de edemaciação ocasionado por Cdt sPLA2. Tambem avaliamos os níveis de expressão e modificação das proteínas antioxidantes Sod, Cat e Prx2 por western blot, e os resultados também revelaram que os níveis da enzima foram muito similares independente da administração de Cdt sPLA2 ou Cdt sPLA2 com extratos de L. racemosa. Em conjunto os resultados indicam fortemente que não ocorre estresse oxidativo na fase tardia do processo da edemaciação por Cdt sPLA2.No caso do segundo objetivo foi possível clonar, expressar e purificar a enzima recombinante Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Análises da atividade de fosfolipase revelaram que Cdt sPLA2r possuipadrão de atividade Michaeliana ao passo que a enzima purificada do veneno possui perfil alostérico. Adicionalmente a velocidade inicial (V0) de Cdt sPLA2r(10.8 × 10-1 µM/s) foi maior que para a enzima nativa (7.1 × 10-1 µM/s). A expressão de Cdt sPLA2r abre caminhos para investigações envolvendo mutações sítio dirigidas para melhor entendimento da enzima, a qual também possui importância biotecnológica. Em conjunto os resultados apresentados neste trabalho representam avanços na compreensão do processo de toxicológico envolvido na ação de Cdt sPLA2 e de sua expressão recombinante. / Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to inhibit the action of thrombin, however, were not evaluated the action of L. racemosa extractsadministration combat the deleterious effects of the Cdt sPLA2. It is also important to point out that although there are numerous biochemical, pharmacological and structural characterizations of sPLA2 from snakes, at the presene, few studies have aimed at its production by recombinant techniques. This is very important since the genetic manipulation of these proteins through site-directed mutations can help identify residues involved in catalysis, leading to a better understanding of the functional mechanisms, which may in future be reflected in new therapeutic approaches. Additionally, these enzymes are used in biotechnological processes.This work had two main objectives: 1) to investigate the existence of oxidative damages, the expression of antioxidant proteins in response to sPLA2 administration of Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), and to evaluate possible protective effects of the administration of butanolic and acetate extracts of ethylene extracted from L. racemosa leaves after inoculation of the Cdt sPLA2 at the late stage of edema; 2) the production of recombinant Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r) to provide subsidies for its genetic manipulation aiming a better understanding of molecular aspects of the enzyme function as also its applicability in biotechnological processes. Regarding the first objective, our results indicate that extracts of L. racemosawere not able to inhibit the process of the edema induced by Cdt sPLA2. The investigation of oxidative stress markers such as sulfhydryl oxidation, protein carbonylation and lipid peroxidation did not identify the existence of oxidative stress in the late phase of the edemaprocess caused by Cdt sPLA2. We also evaluated levels of expression and modification of the antioxidant proteins Sod, Cat and Prx2 by western blot, and the results also revealed that enzyme levels were very similar regardless of the administration of Cdt sPLA2 or Cdt sPLA2 with extracts of L. racemosa. Together the results strongly indicate that oxidative stress does not occur in the late phase of the edema caused by Cdt sPLA2. In the case of the latter objectives it was possible to clone, express and purify the recombinant enzyme Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Analysis of the phospholipase activity revealed that Cdt sPLA2r has a Michaelian environment activity whereas the enzyme purified from the venom has an allosteric profile. In addition, the initial velocity (V0) of the Cdt sPLA2r (10.8 × 10-1 μM / s) was higher than for the native enzyme (7.1 × 10-1 μM / s). The expression of Cdt sPLA2r opens pathways for investigations involving site directed mutations to a better understanding of the enzyme, which also has biotechnological importance. Together the results presented in this work represent advances in the understanding of the toxicological process involved in the action of Cdt sPLA2 and its recombinant expression.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T09:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cotrim_CamilaAparecida_M.pdf: 24882799 bytes, checksum: f5ac35590f5619d941a17e8aa3f11bb4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nas últimas décadas, o uso de compostos naturais como flavonóides e sapogeninas tem sido largamente difundidos na indústria farmacêutica devido suas atividades antiinflamatórias, prevenção de câncer e de doenças cardiovasculares. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da quercetina (flavonóide) e hecogenina (sapogenina), sobre as atividades catalítica e farmacológicas de uma isoforma de fosfolipase A2 secretória (sPLA2) de Crotalus durissus terrificus em duas situações: pré-incubado e co-incubado. Na préincubação, a sPLA2 pura foi incubada com os compostos e os resultados indicam modificações estruturais na estrutura secundária como evidenciada pelas análise de dicroísmo circular. Os dois compostos foram capazes de diminuir a atividade enzimática, porém, somente a quercetina foi capaz de diminuir a mionecrose. Nenhum dos compostos apresentou efeito sobre a formação de edema. Na co-incubação, três concentrações diferentes dos compostos foram misturados com sPLA2 e imediatamente testados. A coincubação mostrou uma menor ação sobre atividade catalítica quando comparado com a préincubação, sugerindo a importância da incubação dos compostos com a proteína. Entretanto, a co-incubação mostrou melhor efeito sobre as atividades farmacológicas (edema e miotoxidade). Os resultados obtidos sugerem a existência de dois sítios farmacológicos distintos, um relacionado com sítio enzimático e outro distinto dessa atividade. Além disso, estudos de docking realizados entre a sPLA2 e a quercetina mostraram a existência de ligações de hidrogênio, interações polares e hidrofóbicas, sugerindo que outros flavonóides com estruturas similares podem se ligar à sPLA2. Além de avaliar o efeito da quercetina sobre a sPLA2 de Crotalus durissus terrificus foi avaliado o efeito sobre uma sPLA2 cataliticamente inativa (Lys49-sPLA2) de Bothrops pirajai. O resultado de dicroísmo circular não apresentou modificações em nível de estrutura secundária, entretanto, estudo de estabilidade mostrou que a quercetina leva a uma maior estabilidade térmica da estrutura proteica frente a altas temperaturas, tornando o processo de desnaturação reversível. Apesar da ausência de atividade catalítica, Lys49-sPLA2 apresentou formação de edema, miotoxidade e uma baixa agregação plaquetária. Entretanto, nenhuma das atividades farmacológicas foi inibida significativamente pela quercetina. Os resultados apresentados mostram que o uso de compostos fenólicos são uma boa iniciativa para estudar e melhor entender as ações de sPLA2 purificadas do veneno de serpente. / Abstract: In the last decades, the use of natural compounds, such as flavonoids and sapogenins has been applied to various pharmaceutical industries due their anti-inflammatory, câncer preventive and cardiovascular protective activities. In this study was evaluated the effect of quercetin (flavonoid) and hecogenin (sapogenin) on the catalytic and pharmacological activity of a secretoy phospholipase A2 from Crotalus durissus terrificus in two different situations: pre-incubated and co-incubated. In the pre-incubation situation, native sPLA2 was incubated with the compounds and the results have shown structural modifications in secondary structure as evidenced through circular dicroism. Both compounds were able to decrease catalytic activity, however, just quercetin was able to decrease myonecrosis. None of the compounds have shown effects on the oedema formation. In the co-incubation, three different concentrations of both compounds were mixed with sPLA2 and immediately tested. Co-incubation has shown lesser effect on catalytic activity than pre-incubation, suggesting an important role of incubation process. Nevertheless, co-incubation presented better effects in pharmacological activities (oedema and myotoxic). These results suggest the existence of two pharmacological sites in the protein, one that is correlated with the enzymatic site and another that is distinct from it. In addition, molecular docking studies between sPLA2 and quercetin showed the existence of hydrogen-bonded, polar interactions and hydrophobic interactions, suggesting that other flavonoids with similar structures could bind to sPLA2. Besides to evaluate the effect of quercetin on a Crotalus durissus terrificus sPLA2, was also evaluated the effect of this compound on a sPLA2 inactive catalytically (Lys49-sPLA2) from Bothrops pirajai. Dicroism circular results did not show modifications in secondary structure, however, thermal stability study have shown that quercetin is able to increase the stability of sPLA2 in high temperatures, in addition to become the denaturation a reversive process. Despite of the lack of catalytic activity, Lys49-sPLA2 has shown oedema formation, myotoxic and a low platelet aggregation. Although none of pharmacological activities was significantly abolish by quercetin. The results have shown that the use of phenolics compounds are a good point to study and better understand the actions of sPLA2 purified from venom snake. / Mestrado / Bioquimica / Mestre Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Copi_Cecilia_M.pdf: 12156283 bytes, checksum: 93ce542963e020dcfb1af6c2bf9d5283 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante a gestação normal em primatas e em roedores observa-se o acúmulo de linfócitos natural killer no ambiente uterino (uNK). A funções comprovadas das células uNK estão relaciondas com o reconhecimento das células trofoblásticas alogênicas e produção de citocinas imunomoduladoras do ambiente uterino que garantem o sucesso da gestação. Além da produção de citocinas envolvidas na homeostase do ambiente uterino, as uNK produzem e estocam nos seus grânulos moléculas citotóxicas como a perforina e granzimas. Estas moléculas estão envolvidas na resposta imune inata das células NK, com potencial de promover a lise de células alvo. Porém, se ocorre a ativação desta atividade citolítica, ou mesmo se as uNK promovem a secreção deste arsenal de moléculas citolíticas no ambiente uterino em gestação normal, ou em casos de interrupção da gestação, não são conhecidas. Os conhecimentos nesta área não avançam pelas limitações éticas de estudar experimentalmente o ambiente uterino em gestantes humanos e a falta de modelos experimentais estabelecidos em animais laboratoriais. No presente trabalho, propos-se utilizar o modelo experimental de indução de lesões embrionárias para provocar o desequilíbrio do ambiente uterino e avaliar as alterações nas células uNK. Para tanto, foram utilizados camundongos prenhes no 9° dia de gestação que foram submetidas à procedimentos cirúrgicos de lesão do embrião. Amostras uterinas dos sítios de desenvolvimento embrionários de animais de gestação normal, dos animais com embriões lesionados nos intervalos de 10, 30 e 60 minutos póslesão, e dos animais manipulados cirurgicamente sem a lesão embrionária foram coletados e processados para avaliações através de métodos citoquímicos e imunocitoquímicos em microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os sítios uterinos de embriões lesionados apresentaram reação hiperêmica na região mesometrial já aos 10 minutos pós-lesão, que se acentuava nos períodos mais longos de pós-lesão. As células uNK presentes nesta região apresentaram alteração na reatividade pela citoquimica de lectina DBA e immunocitoquímica com a anti-perforina, sendo evidente a gradual redução na intensidade das reações no decurso do tempo pós-lesão. Na análise ultra-estrutural verificou-se a desestruturação dos grânulos lisossomo-secretores, sendo notória a perda do conteúdo do compartimento secretor evidenciada pela reação com o azul-cuprolínico. O compartimento lisossomal do grânulo embora sofra também uma desestruturação pronunciada, mantêm a reatividade para anti-catepsina D, sugerindo a preservação de parte da sua funcionalidade. A perda do conteúdo do compartimento secretor, notadamente a perforina e os proteoglicanos no período de 10 minutos pós-lesão, sugere a degranulação das uNK e portanto a ativação da atividade citotóxica destas células, numa resposta aguda frente ao desequilíbrio do ambiente uterino afetado pela lesão embrionária. Porém, não foi constatado qualquer indício morfológico da ocorrência da degranulação através do mecanismo exocitose-símile ou ainda, o efeito da ação citolítica sobre as células circunjacentes às uNK ativadas / Abstract: In the uterine environment during normal pregnancy of primates and rodents is seen the accumulation of natural killer lymphocites (uNK). The confirmed functions of uNK cells are related to recognition of allogeneic trophoblast cells and production of immunomodulating cytokines of uterine environment that assure the successful pregnancy. Besides the production of cytokines related to homeostasis of uterine environment, the uNK produce and store citotoxic molecules of perforin and granzymes in their granules. These molecules are involved in the innate immune response of NK cells with potential to promote lysis of target cells. However, whether the lytic activity is triggered or even the uNK promotes the secretion of these sets Df cytolitic molecules into the uterus of normal pregnancy or in the miscarriages are not known. The advances of knowledge in this field are slow down due to ethical limitation of experimental studies with human pregnant uterus and lack of well established experimental models in laboratory animal. In the present work it was proposed to use the experimental model of induction of embryo lesions to promote the unbalance of uterine environment and evaluated the changes in uNK cells. Pregnant mice on 9° gestational day were submitted to surgical procedure of embryo lesion and uterine samples from these embryo lesioned sites were collected after 10, 30 and 60 minutes, as did the normal pregnant and sham operated animais. The samples were processed for cytochemical and immunocytochemical evaluations in light and transmission electron microscopy. The embryo lesioned uterine sites showed hyperemic reaction in the mesometrial region as soon as 10 min after lesion which increased as increased the time lapse after lesion. The uNK cells found in these regions showed reactivity changes with DBA lectin cytochemistry and with anti-perforin immunocytochemistry, being noticed the gradual reduction on reaction intensities on course of time after lesion. In the ultrastructural analysis were seen the disruptions of secretory-Iysosomes granules with notorious lost of secretory compartment contents as were evidenced by cuprolinic blue cytochemical reaction. In spite of structural organization of lysosome compartment of the granules was also affected it was maintained the anti-cathepsin D positive reaction which suggest the preservation of part of its functionality. The secretory compartment contents lost, notably the perforin and proteoglycans at 10 min after embryo lesion suggest degranulations of uNK and therefore an acute response of these cells by activation of citotoxic activity, under effects of unbalance of uterine environment affected by embryo lesion. However, it was not detected any morphological evidence of degranulation by exocytosis-like mechanism or even, the cytolitic effect on neighbor cells around the activated uNK cells / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O gene MAS1/GAS2, conhecido como \"Magnaporthe Apressoria Specific\", foi identificado como altamente expresso durante a formação do apressório do fungo filamentoso fito patogênico Magnaporthe grisea. Em Aspergillus fumigatus, fungo patogênico oportunista, o gene masA, ortólogo a MAS1/GAS2 foi identificado como upregulated em uma análise transcriptômica exposto a voriconazole e anidulafungina, antifúngicos que afetam a síntese do ergosterol e a parede celular, respectivamente. Em ambos os ortólogos apresentam uma estrutura na região N-terminal da proteína denominada peptídeo sinal o qual neste trabalho foi determinado em uma análise in silico a presença de peptídeo sinal na região N-terminal da proteína. Na caracterização fenotípica de uma linhagem masA - deletada de A. fumigatus não foi identificado alteração estrutural do conidióforo e no seu aspecto macromorfológico. A linhagem masA-deletada é resistente a voriconazol e farnesol, drogas que inibem a síntese de ergosterol e a uma molécula quorum sensing, respectivamente. Ao avaliar o nível de expressão gênica do masA frente a diferentes classes de drogas, foi observado que o gene esta super expresso quando ocorre dano na parede celular, membrana citoplasmática, DNA, inibições na síntese de lipídeos e ácidos graxos e no estresse oxidativo. Na presença de dano na parede celular fúngica causados por anidulafungina, a proteína MasA está localizado na parede celular próximo a ponta da hifa. Adicionalmente, foi capaz de transferir para o meio extra-celular a proteína fusionada a ele, a GFP. Assim, possivelmente MasA participa da via secretória do fungo principalmente em momentos de estresse como o desarranjo da parede celular. A capacidade de secreção natural dos fungos filamentosos tem sido explorada no contexto industrial há décadas. Indicando para este fim, uma possível aplicabilidade para este peptídeo sinal. / The MAS1/GAS2 gene, known as \"Magnaporthe Apressoria Specific\", was identified as highly expressed during the formation of the appressorium phyto pathogenic filamentous fungus Magnaporthe grisea. In Aspergillus fumigatus, opportunistic saprophytic fungus, masA gene orthologous to MAS1/GAS2 was identified as upregulated in a transcriptomic analysis exposed to voriconazole and anidulafungin, antifungals that affect the synthesis of ergosterol and the cell wall, respectively. In both orthologs have a structure at the N-terminus of the protein called signal peptide. During the phenotypic and functional characterization of masA gene in A. fumigatus, was determined on an in silico analysis the presence of signal peptide at the N-terminal region of the protein. In the phenotypic characterization of a strain masA - deleted, no structural change of conidiophores and its macromorfologic aspect was not identified. The characterization masA-deleted strain is resistant to voriconazol and farnesol drugs which inhibit ergosterol synthesis and a quorum sensing molecule, respectively. When evaluating the level of gene expression masA against different class of drugs was observed the super gene is expressed when damage occurs in the cell wall and membrane DNA, the synthesis of lipids and fatty acids, and oxidative stress. In the presence of damage in the fungal cell wall caused by anidulafungin, MasA protein is located near the cell wall and the tip of the hypha and additionally, was able to transfer the protein to the extracellular the protein fused to GFP. Thus, possibly MasA participates in the secretory pathway of the fungus especially in stress of the cell wall. The natural secretion capability of filamentous fungi has been exploited in the industrial context for decades. Indicating for this purpose, a possible applicability for this signal peptide.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-13T13:23:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Yanne Sousa Fernandes - 2014.pdf: 4295000 bytes, checksum: 268e48879f51fac0600951230429078e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-13T13:24:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Yanne Sousa Fernandes - 2014.pdf: 4295000 bytes, checksum: 268e48879f51fac0600951230429078e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-13T13:24:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Yanne Sousa Fernandes - 2014.pdf: 4295000 bytes, checksum: 268e48879f51fac0600951230429078e (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Cerrado rupestre is a subtype of arboreal-shrub vegetation that occurs in rupestrian and rocky habitats. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob belongs to the tribe Eupatorieae of the family Asteraceae, and it is endemic to Brazil. Given the scant knowledge of the botanical traits of this species, the present study aimed to describe the morpho-anatomy of leaves and stems, characterize and identify developmental stages of glandular trichomes, detect the presence of metabolites by phytochemical screening, and determine the composition of the essential oil from aerial vegetative and reproductive parts of T. eupatorioides from a cerrado rupestre area. Samples of T. eupatorioides were collected from the Biological Reserve “Prof. José Ângelo Rizzo” of Universidade Federal de Goiás (UFG). Fully expanded leaves, stems, stem apices, flowers and involucral bracts were used for the morpho-anatomical study and to describe glandular trichomes. Aerial vegetative and reproductive organs were used for the phytochemical study. T. eupatorioides shares anatomical traits with other species described in the literature, such as amphistomatic leaves, anomocytic and anisocytic stomata, epidermal cells with sinuous anticlinal walls and thick external periclinal walls, glandular and non-glandular trichomes, endodermis with starch and Casparian strips, fibers associated to the vascular bundle, and secretory ducts. The glandular trichomes secrete essential oils and phenolic compounds and may be uniseriate or biseriate. The differentiation of the glandular trichomes begins with the expansion of a protodermal cell. The first division is anticlinal for biseriate trichomes, and periclinal for uniseriate ones. The phytochemical screening identified flavonoid and cardiac glycosides and coumarins. Twenty components of the essential oil were identified; of these, 95% were sesquiterpenes. The major components were the sesquiterpenes 3,5-muuroladiene (39.56%), butylated hydroxytoluene (13.07%), and (E)-caryophyllene (5.63%). / O Cerrado Rupestre é um subtipo de vegetação arbóreo-arbustiva que ocorre em ambientes rupestres e rochosos. Trichogonia eupatorioides (Gardner) R. M. King & H. Rob é uma Asteraceae, da tribo Eupatorieae e é endêmica do Brasil. Tendo em vista que a espécie é pouco conhecida sob ponto de vista botânico, o presente estudo teve como objetivo descrever a morfoanatomia da folha e caule de T. eupatorioides ocorrente em área de Cerrado Rupestre, caracterizar e identificar etapas do desenvolvimento dos tricomas glandulares, bem como detectar a presença de metabólitos por prospecção fitoquímica e determinar a composição do óleo essencial em seus órgãos reprodutivos e vegetativos aéreos. Amostras de T. eupatorioides foram coletadas na Reserva Biológica da Universidade Federal de Goiás “Prof. José Ângelo Rizzo”. Para o estudo morfoanatômico e para a caracterização dos tricomas glandulares foram utilizadas folhas completamente expandidas, caules, ápices caulinares, flores e brácteas involucrais. O estudo fitoquímico foi realizado em órgãos aéreos vegetativos e reprodutivos. T. eupatorioides apresenta características anatômicas comuns à outras espécies citadas na literatura como folha anfiestomática, estômatos anomocíticos e anisocíticos, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas e periclinais externas espessas, tricomas glandulars e tectores, endoderme com amido e estrias de Caspary, fibras associadas ao feixe vascular, e ductos secretores. Os tricomas glandulares são unisseriados e bisseriados e secretam óleos essenciais e compostos fenólicos. A diferenciação dos tricomas glandulares inicia-se com a expansão de uma célula protodérmica; nos tricomas bisseriados a primeira divisão desta célula é anticlinal e no unisseriado é periclinal. Na prospecção fitoquímica foram identificados heterosídeos flavonóides, heterosídeos cardioativos e cumarinas. Foram identificados vinte componentes do óleo essencial, 95% destes são sesquiterpenos. Os compostos majoritários foram os sesquiterpenos 3,5 -muuroladieno com 39,56%, Hidroxitolueno butilado com 13,07%, e o E-cariofileno com 5,63%.

O fator de alcalinização rápida ou RALF (do inglês, Rapid ALkalinization Factor) é um peptídeo hormonal ubíquo que induz a atividade de uma MAP quinase, bem como um aumento rápido do pH extracelular do meio de cultura de células em suspensão. O AtRALF1, uma das 37 isoformas de RALF presentes em Arabidopsis thaliana, é um peptídeo secretado de 5 kDa, que inibe o crescimento radicular e causa uma rápida mobilização de Ca2+ extra e intracelular. Em células eucarióticas, calmodulinas são proteínas bem caracterizadas por mediar a transdução de sinais de Ca2+ intracelular. Entretanto, em várias espécies vegetais incluindo Arabidopsis, também existem relatos de calmodulinas secretadas com funções ainda desconhecidas. Neste trabalho, foi caracterizada a AtCML38, uma proteína de Arabidopsis semelhante a calmodulina e que interage com o peptídeo AtRALF1. Análises in silico e por RT-PCR semi-quantitativo mostram a co-expressão de ambos os genes AtRALF1 e AtCML38 em raízes de plântulas de Arabidopsis. Apesar da ausência de um peptídeo sinal típico na proteína AtCML38, a localização sub-celular demonstra que esta é secretada através da via secretória RE-Golgi. O uso de uma versão truncada da AtCML38, cujos 87 primeiros aminoácidos foram retirados, indicou que o N-terminal é essencial para o seu direcionamento. Por meio de ensaios de complementação fluorescente bimolecular, foi demonstrado que AtCML38 interage com AtRALF1 no apoplasto de folhas de tabaco. Ensaios de pulldown indicam que esta interação é específica e dependente de Ca2+ e do pH. Um mutante por inserção de T-DNA, que não produz a proteína AtCML38 (cml38), mostrou-se insensível ao peptídeo AtRALF1 aplicado exogenamente, e suas raízes cresceram normalmente. Plantas transgênicas de Arabidopsis super-expressando o gene AtRALF1 (35S:AtRALF1) têm um fenótipo semi-anão com pronunciada redução do crescimento radicular. Contudo, quando plantas 35S:AtRALF1 foram cruzadas com o mutante cml38, suas progênies exibiram fenótipo e crescimento radicular normais, apesar do acúmulo do peptídeo AtRALF1. Juntos, os resultados mostram que AtCML38 interage com o peptídeo hormonal AtRALF1, e que a proteína AtCML38 é essencial para inibição do crescimento radicular causado pelo peptídeo. / Rapid alkalinization factor (RALF) is a ubiquitous peptide hormone that induces a MAP kinase and a rapid increase in the pH of the extracellular media of cell suspension cultures. AtRALF1, one of the 37 RALF isoforms of Arabidopsis thaliana, is a secreted peptide of 5 kDa that inhibits root growth and causes a rapid mobilization of extra and intracellular Ca2+. In eukaryotic cells, calmodulin proteins are well-characterized to mediate intracellular Ca2+ signal transduction. Nevertheless, in several plant species including Arabidopsis, there are also reports of calmodulins being secreted with still unknown function. In this work, we characterized the AtCML38, a calmodulin-like protein from Arabidopsis as an AtRALF1-interacting protein. Analyses in silico and semiquantitative RT-PCR show co-expression of both AtCML38 and AtRALF1 genes in roots of Arabidopsis seedlings. Despite the fact that AtCML38 lacks a typical signal peptide, subcellular localization demonstrates that AtCML38 is secreted via the ER-Golgi secretory pathway. A truncated AtCML38, without the first 87 amino acids indicates that the N-terminal is essential for targeting. Through bimolecular fluorescence complementation assays, we showed that AtCML38 protein interacts with AtRALF1 in the apoplast of epidermal cells from tobacco leaves. Pull down assays indicate that this interaction is specific, Ca2+- and pH-dependent. A T-DNA insertion mutant defective in the AtCML38 protein (cml38) was insensitive to exogenously applied AtRALF1 peptide and their roots grow just as the wild type plants. Transgenic Arabidopsis plants overexpressing the AtRALF1 gene (35S:AtRALF1) have a semi-dwarf phenotype with a pronounced reduction in the root growth. However, when 35S:AtRALF1 plants are crossed with the mutant cml38, their progenies are normal looking and exhibit normal root growth in spite of the high accumulation of AtRALF1 peptide. Taken together, the results show that AtCML38 interacts with the peptide hormone AtRALF1 and that the protein AtCML38 is essential for the root growth inhibition caused by the peptide.