Submitted by ENDRIGO ADONIS BRAGA DE ARAUJO null (adonis.tecvet@yahoo.com.br) on 2016-04-27T02:07:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_BHT_Araujo, EAB.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / FAPESP: 2014/00175-8

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / Abstract: The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / Mestre

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante. / The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs.

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante. / The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-19Bitstream added on 2014-06-13T19:59:04Z : No. of bitstreams: 1 rocha_as_me_botfmvz.pdf: 334752 bytes, checksum: 8483e7af4f994ca7fc71b7f2189b4764 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição da asolctina de soja ou da fosfatidilcolina de soja em diluente à base de gema de ovo sobre os parâmetros espermáticos e índices de fertilidade de sêmen congelado de garanhões. No Experimento I, dezenove ejaculados de três garanhões foram submetidos ao processo de criopreservação utilizando três diluentes de congelação: Botu-Crio® (BC), Botu-Crio® adicionado de asolctina de soja (BC+Ac) e Botu-Crio® adicionado de fosfatidilcolina de soja (BC+Fc), para posterior avaliação dos parâmetros de cinética espermática e integridade de membrana plasmática. No Experimento II, comparou-se a taxa de fertilidade referente aos três meios de congelação por meio de inseminação artificial das éguas com “pool” de espermatozoides dos três garanhões. Não houve diferença significativa no que se refere aos parâmetros espermáticos (P<0,05) de motilidade total (69,16±9,28; 64,63±11,05; 68,47±7,92), motilidade progressiva (25,00±5,43; 23,26±5,63; 26,16±5,50), integridade de membrana plasmática (39,37±8,82; 39,95±9,52; 41,63±9,24) e índice de concepção (46,7%, 13,3%, 37,5%) entre os meios BC, BC+Ac e BC+Fc, respectivamente. Entretanto, existiu uma tendência a maior (P>0,05) taxa de fertilidade do diluente Botu-Crio® quando comparado ao meio adicionado de asolctina de soja. Diante dos resultados encontrados, conclui-se que tanto a adição da asolctina de soja quanto da fosfatidilcolina de soja ao diluente Botu-Crio® apresenta a mesma eficácia que o diluente Botu-Crio® convencional na criopreservação de sêmen equino / The aim of this study was to evaluate the effect of addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine in an egg yolk-based extender on sperm parameters and fertility rates of frozen stallion semen. In Experiment I, nineteen ejaculates from three stallions were submitted to cryopreservation process using three freezing extenders: Botu-Crio™ (BC), Botu-Crio™ with soybean asolectin (BC+Ac) and Botu-Crio™ with soybean phosphatidylcholine (BC+Fc), for further evaluation of kinetic parameters and sperm plasma membrane integrity. In Experiment II, the fertility rates from the three freezing extenders were compared through artificial insemination in mares using a sperm “pool” of three stallions. No significant differences were found on sperm parameters (P<0.05) of total motility (69.16±9.28; 64.63±11.05; 68.47±7.92); progressive motility (25.00±5.43; 23.26±5.63; 26.16±5.50); plasma membrane integrity (39.37±8.82; 39.95±9.52; 41.63±9.24) and fertility rates (46.7%, 13.3%, 37.5%), for the BC, BC+Ac and BC+Fc groups, respectively. However, the tendency toward higher (P>0.05) fertility rates in Botu-Crio™ (BC) freezing extender than the freezing extender containing soybean asolectin (BC + Ac). Based in these results, it is concluded that the both addition of soybean asolectin and phosphatidylcholine to Botu-Crio™ freezing extender has the same effectiveness as the conventional Botu-Crio™ used in the cryopreservation of equine semen

Compared to natural selection, the use of artificial insemination (AI) and other reproductive technologies rapidly increase the rate of genetic change in any population. In order to achieve success with AI, the semen used to inseminate cows must be of the highest possible quality. When semen is frozen, generally only about 50% of the spermatozoa survive the cryopreservation process. Thus, any factors possibly affecting the survival of spermatozoa through the numerous freezing-thawing steps should be studied, in order to identify the optimal conditions for the survival of spermatozoa. The discovery of protective agents within egg yolk and glycerol was a major milestone in sperm cryopreservation. These agents protect bovine spermatozoa during cooling and freezing procedures and result in increased survival rates. Cryopreservation of spermatozoa has become the most common technique for the preservation of male fertility of genetically superior sires even after their death. Using cryopreserved sperm to artificially inseminate females has become standard practice in commercial dairy cattle herds and the application of this reproductive management tool is also expanding to beef herds worldwide. The use of glycerol as a cryoprotectant for bovine spermatozoa is credited as the reason for the success in bovine semen cryopreservation. The purpose of this research was to quantify the effects of different cooling periods, as well as different glycerol equilibration periods on the post-thaw motility percentages and recovery fractions of semen collected from Boran and Nguni bulls. The research was subdivided into two experiments. In each experiment different cooling and glycerol equilibration times were researched. The first experiment involved shorter cooling times (30, 60, 120 and 240 minutes) with each cooling time followed by several longer equilibration times (4, 5, 6, 7 and 8 h). In the second experiment the cooling and equilibration times from the first experiment were reversed. This resulted in longer cooling times (4, 5, 6, 7 and 8 h) with each cooling time having shorter glycerol equilibration times (30, 60, 120 and 240 minutes). An egg yolk-Tris two-step extender was used in both the experiments. The general trend for the glycerol equilibration periods studied in Experiment 1 was that the resulting overall average post-thaw motility percentage and average recovery fraction increased with longer periods. There was a breed difference when comparing the average post-thaw motility percentages after 4, 5, 6 and 8 h (p<0.05), while the average post-thaw motility percentages also tended to differ after 7 h of equilibration. The general trend observed for equilibration periods used in Experiment 2 was that the average post-thaw motility percentage increased as glycerol equilibration period increased up to 120 minutes, but after 240 minutes of glycerol equilibration, there was a slight decline. The differences in average post-thaw motility percentage after the respective glycerol equilibration periods were not statistically significant. The results of each experiment were used to create a matrix that can be used in practice. The matrix using results from Experiment 1 demonstrated that a cooling period glycerol equilibration period combination of 240 minutes and 7 h resulted in the highest (not significantly different from most other combinations) average post-thaw motility rates. The matrix formed from the results of Experiment 2 demonstrated that an 8 h cooling period combined with a 60 minute glycerol equilibration period yielded the highest (not significantly different from most other combinations), average post-thaw motility percentage. / Dissertation (MSc(Agric))--University of Pretoria, 2010. / Animal and Wildlife Sciences / unrestricted

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

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