[ES] La presente tesis doctoral titulada "La terapia senolítica como nuevo enfoque terapéutico para la prevención de la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina" se centra en explorar la eliminación de células senescentes (senolisis) in vitro e in vivo mediante la administración del fármaco senolítico, navitoclax, como opción terapéutica para prevenir la cardiotoxicidad asociada al tratamiento antitumoral con doxorrubicina. La exposición a doxorrubicina afecta gravemente a la población de células cardíacas tanto en ratones como en corazones humanos al inducir senescencia prematura y navitoclax es uno de los senolíticos más potentes y ampliamente conocido en el campo de la senescencia celular pero su administración está asociada a la aparición de efectos adversos, principalmente trombocitopenia. Con el objetivo de mejorar el perfil terapéutico del fármaco, se han desarrollado dos estrategias específicamente dirigidas a células senescentes que incluyen la encapsulación y el desarrollo de un profármaco basado en navitoclax. En la primera sección experimental, abordamos la inducción de senescencia en un modelo in vitro de cardiomiocitos y evaluamos la terapia senolítica como estrategia terapéutica. Desarrollamos y caracterizamos, así mismo, las nanopartículas y la prodroga basada en navitoclax. Este nanodispositivo senolítico se basa en MSNs cargadas con navitoclax y funcionalizadas con un hexa-galacto-oligosacárido (galactán). Por su parte, la prodroga se obtiene tras la conjugación del navitoclax a una molécula de galactosa acetilada. En ambos casos, el mecanismo de la terapia dirigida radica en la presencia de la enzima lisosomal ß-galactosidasa, la cual presenta mayor expresión en las células senescentes. Al entrar en el lisosoma de células senescentes, los enlaces glicosídicos se hidrolizan por acción de la enzima, liberando el fármaco para su función. Los resultados muestran un aumento del efecto terapéutico del fármaco libre. A continuación, ponemos a punto un modelo murino de cardiotoxicidad donde demostramos que la administración sistémica de doxorrubicina induce la expresión de marcadores de cardiotoxicidad y senescencia en el corazón de ratones tratados y contribuye al deterioro de la función cardíaca de los animales seguido por ecografía. En este modelo preclínico, el tratamiento combinado de doxorrubicina con el senolítico navitoclax, en las diferentes formulaciones descritas, conduce a la disminución significativa de los marcadores de senescencia y cardiotoxicidad junto con el restablecimiento de la función cardíaca y, se observa, de manera similar con las tres estrategias mencionadas: fármaco libre, fármaco encapsulado y fármaco en formulación de prodroga. Los resultados científicos presentados en esta tesis resaltan el papel de la senescencia en la progresión de cardiotoxicidad por la administración de doxorrubicina y se concluye que los sistemas senolíticos aquí evaluados podrían ser una herramienta importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en el campo de la prevención de efectos secundarios asociados a terapia. / [CA] La present tesi doctoral titulada "La teràpia senolítica com a nou enfocament terapèutic per a la prevenció de la cardiotoxicitat induïda per la doxorrubicina" se centra en explorar l'eliminació de cèl·lules senescents (senolisis) in vitro i in vivo mitjançant l'administració del fàrmac senolític, navitoclax, com a opció terapèutica per a previndre la cardiotoxicitat associada al tractament antitumoral amb doxorrubicina. L'exposició a doxorrubicina afecta greument a la població de cèl·lules cardíaques tant en ratolins com en cors humans en induir senescència prematura y navitoclax és un dels senolítics més potents i àmpliament conegut en el camp de la senescència cel·lular però la seua administració està associada a l'aparició d'efectes adversos, principalment trombocitopenia. Amb l'objectiu de millorar el perfil terapèutic del fàrmac, s'han desenvolupat dues estratègies específicament dirigides a cèl·lules senescents que inclouen l'encapsulació i el desenvolupament d'un profàrmac basat en navitoclax. En la primera secció experimental, abordem la inducció de senescència en un model in vitro de cardiomiòcits i avaluem la teràpia senolítica com a estratègia terapèutica. Desenvolupem i caracteritzem, així mateix, les nanopartícules i la prodroga basada en navitoclax. Aquest nanodispositiu senolític es basa en MSNs carregades amb navitoclax i modificades amb un hexa-galacto-oligosacàrid (galactán). Per part seua, la prodroga s'obté després de la conjugació del navitoclax a una molècula de galactosa acetilada. En tots dos casos, el mecanisme de la teràpia dirigida radica en la presència de l'enzim lisosòmic ß-galactosidasa, la qual presenta major expressió en les cèl·lules senescents. En entrar en el lisosoma de cèl·lules senescents, els enllaços glicosídics s'hidrolitzen per acció de l'enzim, alliberant el fàrmac per a la seua funció. Els resultats mostren un augment de l'efecte terapèutic del fàrmac lliure. A continuació, posem a punt un model de ratolí on vam demostrar que l'administració sistèmica de doxorrubicina indueix l'expressió de marcadors de cardiotoxicitat i senescència en el cor de ratolins tractats i contribueix a la deterioració de la funció cardíaca dels animals seguit per ecografia. En aquest model preclínic, el tractament combinat de doxorrubicina amb el senolític navitoclax, en les diferents formulacions descrites, condueix a la disminució significativa dels marcadors de senescència i cardiotoxicitat juntament amb el restabliment de la funció cardíaca i, s'observa, de manera similar amb les tres estratègies esmentades: fàrmac lliure, fàrmac encapsulat i fàrmac en formulació de prodroga. Els resultats científics presentats en aquesta tesi ressalten el paper de la senescència en la progressió de cardiotoxicitat per l'administració de doxorrubicina i es conclou que els sistemes senolítics ací avaluats podrien ser una eina important per al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques en el camp de la prevenció d'efectes secundaris associats a teràpia. / [EN] The present PhD thesis entitled " Pharmacological senolysis as a new therapeutic approach for the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity" focuses on exploring the elimination of senescent cells (senolysis) in vitro and in vivo by administration of the senolytic drug, navitoclax, as a therapeutic option to prevent cardiotoxicity associated with antitumor treatment with doxorubicin. Doxorubicin exposure severely affects the cardiac cell population in both mouse and human hearts by inducing premature senescence and navitoclax is one of the most potent and widely known senolytics in the field of cellular senescence, but its administration is associated with the occurrence of adverse effects, mainly thrombocytopenia. In the first experimental section, we addressed the induction of senescence in an in vitro cardiomyocyte model and evaluated senolytic therapy as a therapeutic strategy. We also developed and characterized the nanoparticles targeting senescent cells and the navitoclax-based prodrug. The senolytic nanodevice is based on MSNs loaded with navitoclax and functionalized with a hexa-galacto-oligosaccharide (galactan). The prodrug is obtained after conjugation of navitoclax to an acetylated galactose molecule. In both cases, the mechanism of targeted therapy lies in the presence of the lysosomal enzyme ß-galactosidase, which is highly expressed in senescent cells. Upon entering the lysosome of senescent cells, the glycosidic bonds are hydrolyzed by the action of the enzyme, releasing the drug. The results show an increase in the therapeutic effect of the free drug. Next, we developed a murine model of cardiotoxicity in which we demonstrated that systemic administration of doxorubicin induces the expression of markers of cardiotoxicity and senescence in the heart of treated mice and contributes to the deterioration of the cardiac function of the animals followed by echocardiography. In this preclinical model, the combined treatment of doxorubicin with the senolytic navitoclax, in the different formulations described above, leads to significant decrease in senescence and cardiotoxicity markers along with restoration of cardiac function. Similar results were observed with the three strategies mentioned: free drug, encapsulated drug, and prodrug formulation. The scientific results presented in this thesis highlight the role of senescence in the progression of cardiotoxicity by doxorubicin administration and it is concluded that the senolytic systems evaluated here could be an important tool for the development of new therapeutic strategies in the field of prevention of therapy-associated side effects and represent an alternative to the limitations of current treatments. / Lérida Viso, A. (2023). Pharmacological Senolysis as a New Therapeutic Approach for the Prevention of Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/194709

Cellular senescence a specialized form of growth arrest that contributes to the pathogenesis of several aging-related disorders including cancer. While by definition tumor cells are considered immortalized, they can undergo senescence when exposed to conventional and targeted cancer therapy. Therapy-Induced Senescence (TIS) represents a fundamental response to therapy and impacts its outcomes. However, TIS has been considered a positive therapeutic goal since senescent tumor cells are expected to enter a state of permanent growth abrogation. In this work we examined the hypothesis that a subpopulation of senescent cells can re-acquire proliferative potential after a state of senescent dormancy, indicating that senescence is not obligatorily an irreversible process. Our observations indicate that H460 non-small cell lung cancer cells induced into senescence by exposure to etoposide, and enriched based on β-galactosidase staining and size, were shown to recover reproductive capacity, which was accompanied by resolution of the DNA-damage-response (downregulation of p53 and p21Cip1 induction), attenuation of the Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP). To overcome the reservation that the newly dividing cells may not have been derived from the senescent population and in an effort to establish that escape from TIS is feasible, tumor cells induced into senescence by chemotherapy were enriched for senescence by flow cytometry; the subsequent division of senescent cells was demonstrable utilizing both real-time, live microscopy and High Speed Live Cell Interferometry (HSLCI). Furthermore, sorted senescent cells were observed to form tumors when implanted in immune deficient mice and with a significant delay in immunecompetent mice. As chemotherapy induced senescent cells have been identified in patient tumors, it is reasonable to propose that tumor cells that escape from senescence could contribute to disease recurrence. In addition, therapy-induced senescence could prove to reflect one form of tumor dormancy. Recently, ABT263 has been used as a senolytic drug, effectively eliminating senescent cells from aging-related animal models. Here, we utilize ABT263 in a two-hit approach to eliminate senescent tumor cells that persistent after exposure to chemotherapy. ABT263 results in the killing of senescent tumor cells in a concentration-dependent manner and shifts the response towards apoptotic cell death. Furthermore, sequential administration of ABT263 interferes with the ability of senescent tumor cells to recover growth potential. These results indicate that senescent tumor cells can contribute to cancer relapse by acquiring proliferative properties and that senolytic therapy allows for the clearance of dormant senescent tumor cells and will potentially decrease cancer recurrence rates.

Le vieillissement est la conséquence de la dégradation progressive des fonctions de l’organisme menant à la mort. Les altérations accumulées au cours du vieillissement favorisent l’apparition de maladies liées à l’âge dont les maladies cardiovasculaires. La sénescence est le processus cellulaire sous-jacent au vieillissement et à l’origine du déclin de l’organisme. Les cellules sénescentes perdent leur capacité à proliférer mais elles restent métaboliquement actives en sécrétant un cocktail de molécules impliquées dans l’inflammation chronique et la progression des maladies liées à l’âge dont l’athérosclérose. L’angiopoiétine-like 2 (Angptl2) est une protéine pro-inflammatoire et anti-apoptotique directement impliquée dans le développement de l’athérosclérose et sécrétée par les cellules sénescentes. Dans cette optique, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle une inhibition de l’Angptl2 vasculaire serait propice à une atténuation de l’athérogenèse associée à la sénescence endothéliale. L’objectif a donc été d’étudier les effets bénéfiques d’une réduction de l’Angptl2 in vivo dans le développement de l’athérosclérose et la sénescence endothéliale chez des souris sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB100+/+). À l’aide d’un virus adeno-associé de sérotype 1 vecteur d’un petit ARN en épingle à cheveux dirigé contre l’Angptl2 (AAV1-shAngptl2), nous avons montré qu’un blocage de l’expression de l’Angptl2 vasculaire a diminué la taille des plaques d’athérome de 58% dans l’aorte thoracique des souris. Ces résultats s’expliquent par une diminution de la sénescence, du recrutement des monocytes et de l’inflammation dans l’endothélium ainsi qu’une diminution de l’inflammation et de l’infiltration des macrophages dans la média de la paroi artérielle. De plus, nous avons montré que dans les jours qui suivent l’administration du AAV1-shAngptl2, les cellules endothéliales sénescentes sont éliminées par apoptose ce qui favorise le recrutement de cellules endothéliales progénitrices destinées à renouveler l’endothélium, contribuant ainsi à une réduction de l’athérogenèse. Ces résultats démontrant le lien entre l’Angptl2 et la sénescence dans l’athérosclérose ont été validés par des données cliniques qui montrent que les niveaux d’expression vasculaire de l’Angptl2 corrèlent avec ceux du marqueur de sénescence p21 dans les artères mammaires de patients coronariens. Notre étude suggère donc que l’inhibition de l’Angptl2 vasculaire pourrait être une nouvelle approche sénolytique dans le but de réduire l’athérosclérose. / Aging is associated with progressive deterioration of the organism functions leading to death. Accumulated alterations in aging favor the appearance of age-related diseases including cardiovascular diseases. Senescence is the cellular process underlying aging and the cause of organism decline. Senescent cells lose their ability to proliferate but remain metabolically active by secreting a cocktail of molecules involved in chronic inflammation and progression of age-related diseases such as atherosclerosis. Angiopoietin-like 2 (Angptl2) is a pro-inflammatory and an anti-apoptotic protein involved in the development of atherosclerosis and secreted by senescent cells. In this light, we hypothesized that an inhibition of vascular Angpt12 would be conducive to an attenuation of atherogenesis associated to endothelial senescence. The aim of my project was to study the beneficial effects of an in vivo reduction of Angptl2 in the development of atherosclerosis and endothelial senescence in severely dyslipidemic mice (LDLr - / -; hApoB100 + / +). Using a serotype 1 adeno-associated virus containing a short hairpin ARN against Angptl2 (AAV1-shAngptl2), we showed that blocking the expression of vascular Angptl2 decreased plaque size by 58% in the thoracic aorta of mice. These results are explained by a decrease in senescence, recruitment of monocytes and lower inflammation in the endothelium as well as a decrease in inflammation and infiltration of macrophages in the media of arterial wall. In addition, few days after the administration of AAV1-shAngptl2, we showed that senescent endothelial cells are eliminated by apoptosis, which in turn promotes the recruitment of endothelial progenitor cells in order to renew the endothelium, collectively contributing to a reduction of atherogenesis. These results demonstrate a link between Angptl2 and senescence in atherosclerosis, and they were validated by clinical data showing that vascular expression levels of Angptl2 correlates with the expression of the senescence marker p21 in the mammary arteries of patients with coronary artery disease. In conclusion, our study suggests that inhibition of vascular Angptl2 could be a new senolytic pathway to reduce atherosclerosis.