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Immundiagnostische Charakterisierung der bovinen ProtothekenmastitisRösler, Uwe 28 November 2004 (has links) (PDF)
Die Protothekenmastitis des Rindes ist eine therapieresistente, weltweit vorkommende Infektionskrankheit. Das ätiologische Agens, die farblose Alge Prototheca (P.) zopfii, kommt ubiquitär in feuchten Habitaten vor und verursacht fakultativ akute bis chronische Entzündungen des Rindereuters. Es gibt Hinweise auf das Vorkommen eines speziellen, Mastitis-assoziierten Biotyps von P. zopfii, der sogenannten Variante II. Durch die oft zu beobachtende endemische Ausbreitung in Milchviehbeständen sowie durch die nachhaltige Therapieresistenz, welche oft zum wirtschaftlichen Totalverlust der betroffenen Milchkühe führt, stellen Protothekenmastitiden beim Rind ein großes ökonomisches Problem für den betroffenen Betrieb dar. Da bisher nur sehr beschränkte Erkenntnisse zur lokalen und systemischen Immunantwort sowie zur Erregerausscheidung im Verlaufe der Protothekenmastitis des Rindes vorlagen, wurden die verschiedenen klinischen Stadien dieser Infektion serologisch, kulturell sowie durch Bestimmung der Zahl der somatischen Zellen in der Milch charakterisiert. Zu diesem Zwecke wurden drei verschiedene ELISA-Systeme entwickelt, die anschließend auch auf ihren möglichen Einsatz bei der Diagnostik der Protothekenmastitis hin untersucht wurden. Dies geschah in einem hochgradig an Protothekenmastitis erkrankten Milchviehbestand. Darüber hinaus wurden verschiedene Isolate von P. zopfii auxanographisch, biochemisch, serologisch und genetisch untersucht, um eine Differenzierung innerhalb der Algenspezies P. zopfii vornehmen zu können. Anhand der auxanographischen, biochemischen, serologischen und genetischen Untersuchungen war eine eindeutige Differenzierung von drei verschiedenen Bio-, Sero- und Genotypen innerhalb der Algenspezies P. zopfii möglich. Alle untersuchten Mastitisisolate konnten eindeutig der Variante II von P. zopfii zugeordnet werden, womit dieser Variante eine besondere epidemiologische Bedeutung bei der Entstehung der Protothekenmastitis des Rindes zu zukommen scheint. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass akut infizierte Tiere sowohl die höchsten Antikörperaktivitäten an IgG im Blutserum sowie an IgA und IgG1 im Milchserum als auch die höchsten Gehalte an somatischen Zellen in der Milch aufweisen. Chronisch infizierte Milchkühe weisen zum Teil sehr hohe Antikörperaktivitäten in der Milch auf und unterschieden sich nicht signifikant von akut infizierten Tieren. Demgegenüber weisen diese chronisch infizierten Tiere signifikant höhere IgG-Aktivitäten im Blutserum sowie IgA- und IgG1-Aktivitäten in der Milch auf als nicht infizierte Tiere. Somit ist eine eindeutige Differenzierung zwischen infizierten und nichtinfizierten Kühen möglich. Die ELISAs zum Nachweis von spezifischem IgA und IgG1 im Milchserum erwiesen sich als besonders geeignet, um infizierte Kühe zu identifizieren. Beide serologischen Testsysteme wiesen Sensitivitäten von 96,3 % für IgA sowie 92,6 % für IgG1 und Spezifitäten von 94,4 % (IgA) und 96,3 % (IgG1) auf. Demgegenüber wies der ELISA zum Nachweis von spezifischem IgG im Blutserum bei einer Spezifität von 100 % nur eine Sensitivität von 81,5 % auf. Die sehr gute Reproduzierbarkeit der Tests wurde durch Intra-Assay-Variationen von 6,08 % für den Nachweis von IgA im Milchserum und 7,20 % für IgG1 sowie durch die geringe Inter-Assay-Variation von 6,32 % (IgA) und 9,74 % (IgG1) belegt. Der Einsatz dieser Testsysteme bei der Sanierung eines hochgradig mit P. zopfii infizierten Milchviehbestandes zeigte, dass die serologische Diagnostik dem bisher gebräuchlichen kulturellen Erregernachweis bei der Identifikation intermittierender Erregerausscheider überlegen ist. Es wurde deutlich, dass 70,5% der infizierten Tiere die Erreger über einen Zeitraum von 12 Monaten permanent ausschieden und mindestens weitere 4,9 %, wahrscheinlich jedoch wesentlich mehr, dieser infizierten Tiere intermittierende Erregerausscheider waren. Somit scheint der serologische Erregernachweis für die Diagnostik der Protothekenmastitis des Rindes besser geeignet zu sein als die kulturelle Diagnostik. Dabei wurde die höchste Sensitivität durch die Kombination des Nachweises von spezifischem IgA und IgG1 im Milchserum erzielt. / Protothecosis is a severe, often endemic mastitis in cattle caused by colorless algae of the genus Prototheca. Only little and insufficient knowledge about the organism itself, and the host immune response to this infection existed. Therefore, the aim of this thesis was to characterize the local and systemic immune response and the possible elimination or persistence of the pathogen in the host. To gain more information on the specific immune response, different clinical stages of infection were characterized serologically, culturally, and by determination of the number of the somatic cells in milk. Three different ELISA systems were developed, which were also examined for their diagnostic application potential. For the investigations, a dairy herd highly infected with Prototheca zopfii and severe clinical manifestation of protothecal mastitis was used. The ELISA was evaluated using serum and whey from animals with different clinical stages of infection. As antibody isotypes, IgG in serum, and IgA and IgG1 in whey were used. In addition, different isolates of P. zopfii were biochemically, serologically, and genetically examined in order to allow a differentiation of individual isolates within the species P. zopfii. The biochemical, serological and genetic investigations allowed a clear differentiation of the three known Variants of P. zopfii. All examined mastitis isolates could be assigned to variant II of P. zopfii. Therefore, it can be concluded that this variant has a particular epidemiological significance in the etiology of bovine protothecal mastitis. The serological investigations showed high antibody activities during acute and chronic stage of infection. The antibody activity was low in chronically infected, but presently cultural negative animals and also in uninfected animals. A strong correlation was observed between whey IgA and whey IgG1 antibody activity and the count of somatic cells in milk. Whereas, only a weak correlation exists to the number of algae cells excreted with the milk. A sensitivity of 96 % and a specificity of 94 % were calculated for the ELISA based on IgA levels. The ELISA for detection of specific IgG1 in whey shows a sensitivity of 92,6 % and a specificity of 96,3 %. Intra-assay and interassay variations were calculated to be at 6.08 % and 6.32 %, respectively. Based on these data, these ELISAs are suitable for discrimination between infected and uninfected animals, and might therefore be used for the screening of affected herds. When used in the remediation of a high-grade infected dairy herd the serological showed clear advantages in the identification of intermittent shedders. By culturing of Prototheca from milk, it was shown that 70.5% of the infected animals were permanent shedders, whereas 4.9 % were intermittent shedders. Since intermittent shedders could be clearly identified serologically, but might not be recognized by culturing, it can be assumed that serological diagnostics is more suitable for the identification of inapparently infected, intermittent shedders.
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Untersuchungen zum Vorkommen von Toxoplasma gondii in Wild in BrandenburgStollberg, Kaya Christina 16 June 2023 (has links)
Die Toxoplasmose, nach ihrem Verursacher, dem Parasiten Toxoplasma gondii (T. gondii) benannt, ist eine weltweit häufig auftretende Zoonose. Einen wichtigen Infektionsweg stellt der Verzehr von nicht ausreichend erhitztem oder rohem Fleisch, welches Gewebezysten enthält, dar.
In Deutschland hat der Konsum von Wildbret in den letzten 10 Jahren zugenommen. Schwarzwild (Sus scrofa), Rehwild (Capreolus capreolus), Damwild (Dama dama) und Rotwild (Cervus elaphus) sind das am häufigsten gejagte Schalenwild in Deutschland. Dennoch gibt es nur wenige Informationen über das Vorkommen
von T. gondii in Wildtieren in Deutschland, so dass die Bedeutung von Wild als Quelle für eine Infektion des Menschen mit T. gondii weitgehend unbekannt ist.
Ziel dieser Studie war es, die Datenlage zum Vorkommen von T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Deutschland zu verbessern und eine fundierte Bewertung des von dem Verzehr von Wildtieren ausgehenden potenziellen Risikos zu ermöglichen.
Neben dem indirekten serologischen Nachweis soll der Nachweis mittels direkter Nachweisverfahren einen Einblick in die tatsächliche Anwesenheit von T. gondii im Muskelgewebe und einen potenziellen Zusammenhang von Seropositivität und der Anwesenheit von T. gondii im Gewebe geben.
In den Jahren 2017-2020 wurden in Brandenburg 306 Stück Schwarzwild, 184 Stück Rehwild, 80 Stück Damwild und 65 Stück Rotwild beprobt. Den 635 Wildtieren wurden Blutproben und Proben von Herz- und Vorderlaufmuskulatur entnommen.
Das aus den Blutproben gewonnene Serum wurde mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA untersucht.
Zum direkten Nachweis von T. gondii wurde zur Analyse der aus den Muskelproben gewonnenen DNA eine real-time PCR (qPCR) eingesetzt, die auf das 529-bp-repetitive Element abzielt.
Die DNA wurde auf drei unterschiedliche Arten gewonnen: direkt aus 5 g Muskelgewebe extrahiert, aus einem Pellet nach saurem Pepsinverdau von 50 g Muskelgewebe extrahiert, und die Ziel-DNA durch Magnetic Capture aus weiteren 50 g Muskelgewebe angereichert.
Die Übereinstimmung der Ergebnisse des molekularen Nachweises und ihre Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen wurde ermittelt. Der molekulare Nachweis wurde bei 23 Proben von einem Maus-Bioassay begleitet. Zusätzlich wurde eine PCR-RFLP zur Genotypisierung bei qPCR-positiven Proben durchgeführt. Fisher’s exact Test, Cohen’s kappa (κ) und Odds Ratio wurden für die
statistische Analyse genutzt.
T. gondii-spezifische Antikörper wurden in 20,3 % der Schwarzwildproben, 10,9 % der Rehwildproben und 6,2 % der Rotwildproben nachgewiesen. Bei allen untersuchten Wildarten wurde ein Anstieg der Seroprävalenz mit zunehmendem Alter festgestellt, welcher bei Schwarzwild und Rehwild statistisch signifikant war (p = 0,004 und < 0,001).
Bei der Untersuchung von Herzmuskulatur wurde T. gondii-DNA mit mindestens einer direkten Nachweismethode in 11,8 % der Schwarzwildproben, 5,5 % der Rehwildproben, 2 % der Damwildproben und 1,9 % der Rotwildproben nachgewiesen. Der höchste Anteil an Tieren, die positiv auf T. gondii-DNA getestet wurden, wurde durch die qPCR-Analyse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture nachgewiesen (10 %). Die Ergebnisse der Methoden zeigten
insgesamt eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,47-0,59). Die höchste Übereinstimmung zeigten die Ergebnisse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Pepsin-Verdau und DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture (κ = 0,59). Insgesamt ergab die Untersuchung von 50 g Herzmuskulatur einen signifikant höheren Anteil an positiven qPCR-Ergebnissen als die Analyse von
5 g Herzmuskulatur (p = 0,048).
Die qPCR-Ergebnisse von Herz- und Vorderlaufmuskelgewebe zeigten beim Schwarzwild eine beachtliche und bei der gemeinsamen Betrachtung aller untersuchten Wildarten eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,62 bzw. 0,46).
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Seropositivität und direktem Nachweis war bei Schwarzwild und Rehwild erkennbar (p < 0,001).
In allen T. gondii-DNA-positiven Proben, bei denen zusätzlich ein Bioassay durchgeführt wurde, konnte Infektiosität bestätigt werden (4/4).
Sowohl in den T. gondii-DNA-positiven Schwarzwildproben als auch in den positiven Rehwildproben waren die spezifischen Allele von T. gondii-Typ II am weitesten verbreitet.
Die durch diese Arbeit generierten Daten zeigen, dass T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Brandenburg vorkommt und Wild eine relevante Quelle für T. gondii-Infektionen beim Menschen darstellen könnte.
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Virologische Untersuchungen an Stieleichen (Quercus robur L.) zum verursachenden Pathogen der pfropfübertragbaren chlorotischen RingfleckenHahn, Sabine 07 April 2006 (has links)
Regelmäßige Bonituren haben gezeigt, dass virusverdächtige Symptome an Stieleichen, die zu etwa 90 % als chlorotische Ringflecken auftreten, im nord- und mitteldeutschen Raum weit verbreitet sind. In der vorliegenden Arbeit sollte der Erreger dieser Symptome isoliert und näher charakterisiert werden. Aus zwei Blattproben mit chlorotischen Ringflecken konnten stäbchenförmige Viruspartikeln mit einer Länge von ca. 450 nm isoliert und auf krautige Indikatoren übertragen werden. In einer RT-PCR mit Hüllprotein bzw. Transportprotein-sequenzspezifischen Primern wurden diese als Tobacco mosaic virus (TMV)- bzw. Tomato mosaic virus (ToMV)- Isolate identifiziert. Eine Infektion der Stieleichen mit weiteren bekannten Viren von Gehölzen, wie dem Cherry leaf roll virus (CLRV) oder dem Erreger der Ebereschenringfleckigkeit konnte mittels ELISA und RT-PCR ausgeschlossen werden. DsRNAs der Größen 1.5 und 1.6 kb sowie 1.8 und 2.0 kb konnten symptomunabhängig aus Rindengewebe, Knospen und Blättern von Stieleichen isoliert werden. Mit Hilfe der RT-DOP-PCR und der cDNA-Klonierung gelang es, Teile des 1.5/1.6 kb dsRNA-Moleküls zu charakterisieren. Die Sequenz von 479 Aminosäuren (1437 Nukleotiden) wies eine Identität von 56 % zur RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) des Beet cryptic virus 3 (BCV 3) auf. Der spezifische Nachweis dieser Sequenz gelang mittels RT-PCR sowohl in dsRNA-Proben, als auch in angereicherten Nukleokapsiden symptomloser und symptomatischer Stieleichen. In Nested-PCR-Analysen konnte das Fragment jedoch nicht nur in Gesamt-RNA von Stieleichen, sondern auch in Gesamt-RNA und DNA verschiedenster gesunder Pflanzen amplifiziert werden. Phylogenetische Vergleiche mit ausgewählten RdRps viralen und pflanzlichen Ursprungs zeigten die engste Verwandtschaft der Stieleichen-dsRNA-Sequenz zu den Partitiviren, zu denen sich neben BCV 3 auch die endogene dsRNA aus Pyrus und aus Chloroplasten von Bryopsis gruppiert. Diese Erkenntnisse lassen in der charakteristischen Doppelbande von 1.5/1.6 kb das Vorliegen einer endogenen dsRNA vermuten. Hiermit ist in dieser Arbeit das Auftreten verschiedener Viren in Eichen nachgewiesen worden, von denen die meisten höchstwahrscheinlich nicht im direkten ursächlichen Zusammenhang mit der chlorotischen Ringfleckigkeit der Eiche stehen. / Ratings of oak populations revealed that around 90 % of all oak trees affected by viruslike symptoms showed chlorotic ringspots and that these symptoms are widely spread in oaks in north and central Germany. In this study the putative agent of these symptoms should be isolated and specified. Rod-shaped particles with a length of 450 nm were recovered from two different samples of leaves displaying chlorotic ringspots by mechanical inoculation of herbaceous indicator plants. These particles were identified to be Tobacco mosaic virus (TMV)- and Tomato mosaic virus (ToMV)- isolates by RT-PCR analyses of the coat- and movement protein genes. Infections with other well known viruses of forest trees, like Cherry leaf roll virus (CLRV) and the agent causing ringspots in European mountain ash, were excluded by ELISA and RT-PCR. DsRNA fragments of 1.5 and 1.6 kb as well as 1.8 and 2.0 kb were extracted from leaves, inner bark and bulbs of all symptomatic and asymptomatic samples of common oak. The nucleotide sequence of the 1.5 and 1.6 kb dsRNA fragment was partially characterised by reverse transcription degenerated oligonucleotide primed (DOP)-PCR and cDNA cloning. The obtained nucleotide sequence of 1437 nt encoding a putative protein of 479 amino acids revealed an identity of 56 % with the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Beet cryptic virus 3 (BCV 3). PCR amplification of the RdRp coding nucleotide sequence was possible using a number of different dsRNA samples as well as concentrated nucleocapside preparations. The same sequence was also amplified successfully by Nested-PCR not only in total RNA extracted from symptomatic and asymptomatic oak samples but also from total RNA and DNA of diverse plants. Phylogenetic analysis revealed further similarities to RdRp´s of endogenous dsRNA of Pyrus and chloroplasts of Bryopsis, both members of the Partitiviridae as well as BCV 3. These results strongly indicate that the 1.5/1.6 kb dsRNA of oak is endogenous dsRNA. In summary, it has been shown that oaks in Germany are commonly infected by a variety of different viruses most of them possibly unrelated to the wide-spread ringspot symptoms of oaks.
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Immundiagnostische Charakterisierung der bovinen ProtothekenmastitisRösler, Uwe 28 November 2001 (has links)
Die Protothekenmastitis des Rindes ist eine therapieresistente, weltweit vorkommende Infektionskrankheit. Das ätiologische Agens, die farblose Alge Prototheca (P.) zopfii, kommt ubiquitär in feuchten Habitaten vor und verursacht fakultativ akute bis chronische Entzündungen des Rindereuters. Es gibt Hinweise auf das Vorkommen eines speziellen, Mastitis-assoziierten Biotyps von P. zopfii, der sogenannten Variante II. Durch die oft zu beobachtende endemische Ausbreitung in Milchviehbeständen sowie durch die nachhaltige Therapieresistenz, welche oft zum wirtschaftlichen Totalverlust der betroffenen Milchkühe führt, stellen Protothekenmastitiden beim Rind ein großes ökonomisches Problem für den betroffenen Betrieb dar. Da bisher nur sehr beschränkte Erkenntnisse zur lokalen und systemischen Immunantwort sowie zur Erregerausscheidung im Verlaufe der Protothekenmastitis des Rindes vorlagen, wurden die verschiedenen klinischen Stadien dieser Infektion serologisch, kulturell sowie durch Bestimmung der Zahl der somatischen Zellen in der Milch charakterisiert. Zu diesem Zwecke wurden drei verschiedene ELISA-Systeme entwickelt, die anschließend auch auf ihren möglichen Einsatz bei der Diagnostik der Protothekenmastitis hin untersucht wurden. Dies geschah in einem hochgradig an Protothekenmastitis erkrankten Milchviehbestand. Darüber hinaus wurden verschiedene Isolate von P. zopfii auxanographisch, biochemisch, serologisch und genetisch untersucht, um eine Differenzierung innerhalb der Algenspezies P. zopfii vornehmen zu können. Anhand der auxanographischen, biochemischen, serologischen und genetischen Untersuchungen war eine eindeutige Differenzierung von drei verschiedenen Bio-, Sero- und Genotypen innerhalb der Algenspezies P. zopfii möglich. Alle untersuchten Mastitisisolate konnten eindeutig der Variante II von P. zopfii zugeordnet werden, womit dieser Variante eine besondere epidemiologische Bedeutung bei der Entstehung der Protothekenmastitis des Rindes zu zukommen scheint. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass akut infizierte Tiere sowohl die höchsten Antikörperaktivitäten an IgG im Blutserum sowie an IgA und IgG1 im Milchserum als auch die höchsten Gehalte an somatischen Zellen in der Milch aufweisen. Chronisch infizierte Milchkühe weisen zum Teil sehr hohe Antikörperaktivitäten in der Milch auf und unterschieden sich nicht signifikant von akut infizierten Tieren. Demgegenüber weisen diese chronisch infizierten Tiere signifikant höhere IgG-Aktivitäten im Blutserum sowie IgA- und IgG1-Aktivitäten in der Milch auf als nicht infizierte Tiere. Somit ist eine eindeutige Differenzierung zwischen infizierten und nichtinfizierten Kühen möglich. Die ELISAs zum Nachweis von spezifischem IgA und IgG1 im Milchserum erwiesen sich als besonders geeignet, um infizierte Kühe zu identifizieren. Beide serologischen Testsysteme wiesen Sensitivitäten von 96,3 % für IgA sowie 92,6 % für IgG1 und Spezifitäten von 94,4 % (IgA) und 96,3 % (IgG1) auf. Demgegenüber wies der ELISA zum Nachweis von spezifischem IgG im Blutserum bei einer Spezifität von 100 % nur eine Sensitivität von 81,5 % auf. Die sehr gute Reproduzierbarkeit der Tests wurde durch Intra-Assay-Variationen von 6,08 % für den Nachweis von IgA im Milchserum und 7,20 % für IgG1 sowie durch die geringe Inter-Assay-Variation von 6,32 % (IgA) und 9,74 % (IgG1) belegt. Der Einsatz dieser Testsysteme bei der Sanierung eines hochgradig mit P. zopfii infizierten Milchviehbestandes zeigte, dass die serologische Diagnostik dem bisher gebräuchlichen kulturellen Erregernachweis bei der Identifikation intermittierender Erregerausscheider überlegen ist. Es wurde deutlich, dass 70,5% der infizierten Tiere die Erreger über einen Zeitraum von 12 Monaten permanent ausschieden und mindestens weitere 4,9 %, wahrscheinlich jedoch wesentlich mehr, dieser infizierten Tiere intermittierende Erregerausscheider waren. Somit scheint der serologische Erregernachweis für die Diagnostik der Protothekenmastitis des Rindes besser geeignet zu sein als die kulturelle Diagnostik. Dabei wurde die höchste Sensitivität durch die Kombination des Nachweises von spezifischem IgA und IgG1 im Milchserum erzielt. / Protothecosis is a severe, often endemic mastitis in cattle caused by colorless algae of the genus Prototheca. Only little and insufficient knowledge about the organism itself, and the host immune response to this infection existed. Therefore, the aim of this thesis was to characterize the local and systemic immune response and the possible elimination or persistence of the pathogen in the host. To gain more information on the specific immune response, different clinical stages of infection were characterized serologically, culturally, and by determination of the number of the somatic cells in milk. Three different ELISA systems were developed, which were also examined for their diagnostic application potential. For the investigations, a dairy herd highly infected with Prototheca zopfii and severe clinical manifestation of protothecal mastitis was used. The ELISA was evaluated using serum and whey from animals with different clinical stages of infection. As antibody isotypes, IgG in serum, and IgA and IgG1 in whey were used. In addition, different isolates of P. zopfii were biochemically, serologically, and genetically examined in order to allow a differentiation of individual isolates within the species P. zopfii. The biochemical, serological and genetic investigations allowed a clear differentiation of the three known Variants of P. zopfii. All examined mastitis isolates could be assigned to variant II of P. zopfii. Therefore, it can be concluded that this variant has a particular epidemiological significance in the etiology of bovine protothecal mastitis. The serological investigations showed high antibody activities during acute and chronic stage of infection. The antibody activity was low in chronically infected, but presently cultural negative animals and also in uninfected animals. A strong correlation was observed between whey IgA and whey IgG1 antibody activity and the count of somatic cells in milk. Whereas, only a weak correlation exists to the number of algae cells excreted with the milk. A sensitivity of 96 % and a specificity of 94 % were calculated for the ELISA based on IgA levels. The ELISA for detection of specific IgG1 in whey shows a sensitivity of 92,6 % and a specificity of 96,3 %. Intra-assay and interassay variations were calculated to be at 6.08 % and 6.32 %, respectively. Based on these data, these ELISAs are suitable for discrimination between infected and uninfected animals, and might therefore be used for the screening of affected herds. When used in the remediation of a high-grade infected dairy herd the serological showed clear advantages in the identification of intermittent shedders. By culturing of Prototheca from milk, it was shown that 70.5% of the infected animals were permanent shedders, whereas 4.9 % were intermittent shedders. Since intermittent shedders could be clearly identified serologically, but might not be recognized by culturing, it can be assumed that serological diagnostics is more suitable for the identification of inapparently infected, intermittent shedders.
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Evaluierung des diagnostischen Potenzials des rekombinanten Coxiella burnetii-Com1 Proteins für den serologischen Nachweis von Q-Fieber bei Schafen, Ziegen und RindernStellfeld, Mareike 02 November 2021 (has links)
- Einleitung -
Coxiella burnetii (C. burnetii) ist der Erreger des Q-Fiebers, einer zoonotischen Erkrankung, welche insbesondere kleine und große Wiederkäuer betrifft. Während Tiere meist asymptomatisch erkranken, kann die Erkrankung beim Menschen von akuten grippeähnlichen Symptomen bis hin zur chronischen Organschädigung führen. Die Diagnostik von Q-Fieber im veterinärmedizinischen Bereich wird durch unspezifische Symptome sowie diagnostische Lücken erschwert: Einerseits ist die direkte Diagnostik aufgrund langer Anzuchtzeiten der Bakterien häufig unpraktikabel. Andererseits weisen die Leistungen der Serodiagnostika in Untersuchungen teilweise inakzeptable Spezifitäten und Sensitivitäten auf.
- Ziel der Untersuchungen -
Ziel war es, das Potential des rekombinant hergestellten C. burnetii Außenmembran-proteins Com1 als diagnostischen Marker zu bestimmen und darauf aufbauend einen indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zu entwickeln, welcher die Grundlage für neue, praxistaugliche und verbesserte Serodiagnostika bieten kann.
- Material und Methoden -
Hierfür wurde die kodierende Sequenz für Com1 von C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 unter Ausschluss der Signalsequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das Amplifikat com1 wurde in ein Expressionsplasmid kloniert und anschließend mittels Transformation in Escherichia coli (E. coli) als Com1 exprimiert. Das Expressionsprodukt wurde nach der Aufreinigung über Nickel-NTA (Nitrilotriessigsäure) mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), Coomassie-Blau-Färbung und Western Blot überprüft. Die 96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 1 µg/Well des rekombinanten Proteins beschichtet und 404 Seren von Schafen (111), Ziegen (100) und Rindern (193) auf ihre Reaktion im rekombinanten Com1-ELISA analysiert. Die Seren stammten sowohl aus definierten Ausbrüchen als auch aus Q-Fieber-freien Beständen, geimpften Herden und von Tieren mit fraglichem Infektionshintergrund. Daneben wurden die Seren mit kommerziellen ELISAs getestet und daraufhin in positive und negative Seren eingeteilt. Die OD450-Werte (optische Dichte bei 450 nm) der Seren aus dem rekombinanten Com1-ELISAs wurden in Pivot-Tabellen angeordnet und anschließend in einer ROC-Kurve (receiver operating characteristic) dargestellt, wodurch das Integral als Area under the curve (AUC) berechnet und hinsichtlich der Diskrimination zwischen positiven und negativen Ergebnissen ausgewertet wurde. Nach Festlegung von tierart-spezifischen Cut-off-Werten wurden Sensitivität und Falsch-Positiv-Rate bestimmt.
- Ergebnisse -
Die ermittelten tierart-spezifischen OD450-Cut-off-Werte betrugen für Schafe 0,32, für Ziegen 0,23 und für Rinder 0,18. Als Spezifität bzw. Sensitivität ergaben sich für Schafe 85 % bzw. 68 %, für Ziegen 94 % bzw. 77 % und für Rinder 71 % bzw. 70 %. Die Diskrimination wurde bei Schafen als „exzellent“, bei Ziegen als „herausragend“ und bei Rindern als „akzeptabel“ eingeschätzt.
- Schlussfolgerungen -
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das Coxiella-Außenmembranprotein Com1 als Basis für die Entwicklung neuer, sensitiverer und spezifischerer (Schnell)-Diagnostika dienen kann, um weitere Q-Fieber-Epidemien einzudämmen und damit das Risiko einer C. burnetii-Infektion für Mensch und Tier zu minimieren. / - Introduction -
Coxiella burnetii (C. burnetii) is the causative agent of Q fever, a zoonotic disease with small and large ruminants as the target hosts. While an infection in ruminants is often symptomless, the disease in humans can lead from acute flu-like symptoms to chronic organ damage. In addition to the non-specific symptoms in the veterinary field, for which reason it is difficult to directly conclude on a Q fever outbreak, the detection of infections with C. burnetii is in need of improvement. On the one hand, direct diagnosis is often impracticable due to long cultivation periods of the bacteria. On the other hand, the performance of serodiagnostics shows partially unacceptable specificities and sensitivities.
- Objectives -
The aim of the study was to determine the potential of the recombinantly produced C. burnetii outer membrane protein Com1 as a diagnostic marker and, subsequently, to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which can provide the basis for the development of new and improved serodiagnostics.
- Material and methods -
For this purpose, primers for com1 were designed in silico and the open reading frame (ORF) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using phenol-chloroform-isolated DNA (deoxyribonucleic acid) from C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 without signal sequence. After control by gel electrophoresis, the amplified product was cloned into the two-stage gateway system (Invitrogen) and transformed into Escherichia coli (E. coli) TOP10. The expression vector was cloned into E. coli BL21(DE3) and Com1 was expressed. The protein was analyzed after native purification via Nickel-NTA (nitrilotriacetic acid) by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), Coomassie blue staining and Western blot and subsequently concentrated. Microtiter plates were coated with the recombinant protein and 404 sera from sheep (111), goats (100) and cattle (193) were tested for their reaction in the recombinant Com1-ELISA. The sera were derived from 36 different flocks, both from defined outbreaks and from Q fever-free flocks, vaccinated herds and from animals with questionable infection background. In addition, the sera were tested with commercial ELISAs and could thus be divided into positive and negative sera. The OD450 values (optical density at 450 nm) of the sera from the recombinant Com1 ELISAs were arranged in pivot tables and then plotted on a ROC curve (receiver operating characteristic), allowing the integral to be calculated as the area under the curve (AUC) and evaluated regarding the discrimination between positive and negative results. After establishing animal species-specific cut-off values, sensitivity and false positive rate were determined.
- Results -
The animal species-specific OD450 cut-off values determined were 0.32 for sheep, 0.23 for goats and 0.181 for cattle. Specificity and sensitivity were 85 % and 68 % for sheep, 94 % and 77 % for goats and 71 % and 70 % for cattle. Discrimination was assessed as 'excellent' in sheep, 'outstanding' in goats and 'acceptable' in cattle.
- Conclusions -
The results of this study suggest that the Coxiella outer membrane protein Com1, together with other immunogenic marker proteins, may serve as a basis for the development of new more sensitive and specific diagnostic tools to contain further Q fever epidemics and thus minimize the risk of C. burnetii infection for humans and animals. Com1 could also lay the foundation for direct rapid diagnostics.
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Orientierungsstudie zum Einsatz ausgewählter Peptide von Mücken der Gattung Culicoides bei Pferden mit Culicoides-Hypersensitivität und in der SerologieKrosch, Kathrina 29 May 2024 (has links)
Die Therapiemöglichkeiten für Pferde, die an Culicoides-Hypersensitivität (Sommerekzem) leiden, sind heute noch oft unbefriedigend. Sie reduzieren sich größtenteils auf symptomatische Behand-lungen und auf die Vermeidung der allergieauslösenden Allergene.
Es existieren Studien, bei denen rekombinante Proteine in ihrer Wirksamkeit auf die Culicoides-Hypersensitivität beim Pferd untersucht wurden.
Für die spezifische Immuntherapie gibt es in der Veterinärmedizin bislang keine oralen Präparate für eine mögliche sublinguale Therapie.
Am Beispiel der Culicoides-Hypersensitivität soll letztlich ein Verfahren für die spezifische Immuntherapie entwickelt werden, bei dem die Peptide sowohl zur Diagnostik als auch Therapie allergischer Erkrankungen in der Veterinärmedizin genutzt werden können.
In der vorliegenden Studie wurden erste Schritte in diese Richtung unternommen. Dafür wurden eine intrakutan zu applizierende Darreichungsform und eine für das Pferd neuartige, sublingual zu applizierende Arzneiform eingesetzt. Ausgewählte, synthetisch hergestellte Peptide von Mücken der Gattung Culicoides wurden bezüglich ihres Potentials für die spezifische Immuntherapie hinsichtlich der Sicherheit bei ihrer Anwendung im Pferd und Nutzung in der serologischen Diagnostik untersucht.
Sieben ausgewählte Peptide, bestehend aus 30-35 Aminosäuren, wurden für in-vitro und in-vivo-Untersuchungen an gesunden (n=6) und an Sommerekzem erkrankten (n=12) Pferden eingesetzt. Nach einer Testphase auf die Verträglichkeit an klinisch gesunden Pferden, wurden die an Culicoides-Hypersensitivität erkrankten Tiere randomisiert in zwei Gruppen (intradermale und sublinguale Arzneiform) eingeteilt. Sie bekamen im Sonner, bei möglicher natürlicher Culicoides-Exposition die jeweilige Arzneiform über 21 Wochen hinweg verabreicht.
Während dieser Zeit fanden in regelmäßigen Abständen Kontrollen des Gesundheitszustandes der Tiere statt, bei denen insbesondere klinische Symptome, Blutbilder und die Bildung spezifischer Antikörper erfasst wurden. Das Hautbild der Tiere wurde in Woche 1, 13 und 25 mithilfe eines Sommerekzem-Scores beurteilt. Die zwölf häufigsten vom Ekzem betroffenen Stellen am Pferde-körper wurden hierbei unabhängig voneinander bewertet.
Die Besitzer der Tiere wurden mithilfe eines Fragebogens nach ihrer Meinung zur Entwicklung bzw. Ausprägung der klinischen Symptome und dem Befinden ihres Pferdes befragt.
Zur Detektion spezifischer Antikörper im Serum der Tiere, unter Verwendung rekombinanter Pepti-de als Antigen, konnten für IgE und die IgG-Isotypen IgG1, IgG3/5 und IgG4/7 direkte bzw. indirekte ELISA etabliert werden. Des Weiteren wurde ein kommerzielles ELISA-Kit verwendet, um den Verlauf der IgE-Gesamtkonzentration während der Studienlaufzeit zu untersuchen.
Aufgrund der geringen Studienteilnehmerzahl und vieler nicht verwendbarer Daten aus den ELISA Untersuchungen wurde die statistische Auswertung auf deskriptive Analysen beschränkt.
Beide Applikationsarten wurden von den Studienteilnehmern gut toleriert und vertragen.
Die Verabreichung der Sublingualtablette konnte durch die zuvor geschulten Pferdebesitzer eigenständig durchgeführt werden.
Zu Beginn der Studie betrug der Dermatitisgrad 14 Punkte in der intradermalen Gruppe bzw. 13,67 Punkte in der sublingualen Gruppe. Am Ende der Studienlaufzeit lag der durchschnittliche Dermatitisgrad bei 40,33 bzw. 38,50 Punkten. Damit verschlechterte er sich während der Studienlaufzeit.
Der Gehalt an gesamtem IgE im Serum der Probanden sank während des Untersuchungszeitraumes über beide Gruppen hinweg von 2,7 U/l auf 2,1 U/l. Bei den Tieren der Intradermalen Applikationsgruppe reduzierte sich das freie IgE dabei um 0,8 U/l und in der Sublingualen Gruppe um 0,3 U/l.
Die Peptid-basierten ELISA zur spezifischen Serologie verschiedener Serum-Antikörperklassen waren nicht valide auswertbar. Die Untersuchungen zu peptidspezifischen IgE ergaben individuelle Verlaufsformen.
Da keine Kontrollgruppe ohne Peptid-Applikation eingeschlossen wurde und die Studie in der Saison mit unkontrollierter, natürlicher Culicoides-Exposition durchgeführt wurde, ist keine Aussage zur Wirksamkeit der Behandlung auf klinische oder serologische Parameter möglich.
Die entwickelte Sublingualtablette war durch ihre Form, Stabilität und Handhabung gut anwendbar und kann als Applikationsmethode in der Veterinärmedizin in Erwägung gezogen werden.
Die synthetischen Peptide waren für den Einsatz in-vivo unschädlich und einsetzbar. Es bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten, ihr diagnostisches und therapeutisches Potential zur An-wendung bei Culicoides-Hypersensitivität und gegebenenfalls weiteren allergisch bedingten Erkrankungen des Pferdes weiter zu evaluieren. Aufgrund von limitierenden Faktoren, wie der sehr kleinen Zahl an Studienteilnehmern, dem Fehlen einer Placebogruppe und der Durchführung während der Expositionszeit hat die vorliegende Arbeit insgesamt präliminären Charakter.:Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Allergie
2.1.1 Allergene
2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen)
2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten
2.1.2 Typ-I-Allergie
2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt
2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt
2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes
2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen
2.2 Das Sommerekzem des Pferdes
2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese
2.2.2 Bedeutende Allergene
2.2.3 Diagnostische Ansätze
2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test)
2.2.3.2 In-vitro-Tests
2.2.3.3 Nachweis von IgE
2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests
2.2.4 Therapeutische Ansätze
2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche
2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT)
2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten
2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie
2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
3.2 Material
3.2.1 Klinikbedarf
3.2.2 Laborbedarf
3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen
3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese
3.2.5 Antikörper
3.3 Tiere
3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe
3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer
3.4 Methoden
3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung
3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen
3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation
3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation
3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden
3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung
3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus
3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten
3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest)
3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen
3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen
3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT
3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome
3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer
3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA)
3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA
3.4.7 Statistik
4 Ergebnisse
4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems
4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest
4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation
4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation
4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT
4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes
4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer
4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT
4.3.1 Differentialblutbild
4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA
4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA
4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score)
5 Diskussion
5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie
5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation
5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd
5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT
5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik
6 Zusammenfassung
7 Summary
7 Literaturverzeichnis
8 Anhang
8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden
8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung
8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung
8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests
8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde
8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie
8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum
9 Danksagung / The treatment options for horses suffering from Culicoides hypersensitivity are still often unsatisfac-tory. They are mainly reduced to symptomatic treatments and avoiding the allergy-triggering aller-gens.
In various studies recombinant proteins were examined for their effectiveness on Culicoides hyper-sensitivity in horses.
However, there are currently no oral preparations available in veterinary medicine for specific immunotherapy.
Using Culicoides hypersensitivity as an example, a process for specific immunotherapy shall ulti-mately be developed in which the peptides can be used for both, the diagnosis and therapy od allergic diseases in veterinary medicine.
The present study tool the first steps in this direction. For this purpose, an intracutaneously adminis-tered dosage form and a sublingually administered dosage form, which is new for horses, were used. Selected, synthetically produced peptides from mosquitoes of the genus Culicoides were ex-amined regarding their potential for specific immunotherapy in terms of their safety after application in horses in-vivo and their use in serology.
Seven selected peptides, consisting of 30-35 amino acids, were used for in-vitro and in-vivo studies on healthy (n=6) and horses suffering from Culicoides hypersensitivity (n=12).
After a test phase for tolerability in clinically healthy horses, the animals suffering from Culicoides hypersensitivity were randomly divided into two groups (intradermal and sublingual dosage forms). They were administered the respective dosage form for 21 weeks during the summer season with possible natural Culicoides exposure.
During this time, the animals' health status was checked at regular intervals, in particular clinical symptoms, blood counts and the formation of specific antibodies were recorded.
The skin appearance of the animals was assessed at weeks 1, 13 and 25 using a dermatitis score.
The twelve most common areas on the horse's body affected by eczema were evaluated inde-pendently of each other.
The owners of the animals were asked using a questionnaire about their opinion on the development or severity of their horse's clinical symptoms and well-being.
To detect specific antibodies in the serum of the animals, using recombinant peptides as antigen, direct and indirect ELISAs were established for IgE and the IgG isotypes IgG1, IgG3/5 and IgG4/7. Furthermore, a commercial ELISA kit was used to examine the course of the total IgE concentration during the study period.
Due to the small number of study participants and numerous invalid data from the ELISA studies, the statistical analysis was limited to descriptive analyses.
Both types of application were well tolerated by the study participants.
The administration of the sublingual tablet could be carried out by previously trained horse owners.
At the start of the study, the dermatitis score was 14 points in the intradermal group and 13.67 points in the sublingual group. At the end of the study period, the average dermatitis grades were 40.33 and 38.50 points, respectively, and deteriorated during the course of this study.
The owner survey revealed a slight improvement in symptoms compared to previous years.
The level of total, free IgE in the test subjects' serum fell from 2.7 U/l to 2.1 U/l during the study period. In the animals in the intradermal application group, the free IgE was reduced by 0.8 U/l and in the sublingual group by 0.3 U/l. Peptide-based ELISA to determine different serum antibody isotypes binding the peptides could not be evaluated reliably. Peptide-specific IgE revealed individ-ual variations.
Due to the lack of a control group without peptide application and conduction of the study during the season with uncontrolled, natural Culicoides exposure conclusions of effectiveness regarding clinical disease or serological effects cannot be drawn.
The sublingual tablet developed was easy to use due to its shape, stability and handling and can be considered as an application method in veterinary medicine.
The synthetic peptides were harmless and usable for in-vivo application. It remains reserved for future studies to further evaluate its diagnostic and therapeutic potential for use in equine Culicoides hypersensitivity and possibly other allergic diseases in horses.
Due to limiting factors such as the very small number of study participants, the lack of a placebo group and the implementation during the exposure period, the present work is of a preliminary nature.:Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Allergie
2.1.1 Allergene
2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen)
2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten
2.1.2 Typ-I-Allergie
2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt
2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt
2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes
2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen
2.2 Das Sommerekzem des Pferdes
2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese
2.2.2 Bedeutende Allergene
2.2.3 Diagnostische Ansätze
2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test)
2.2.3.2 In-vitro-Tests
2.2.3.3 Nachweis von IgE
2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests
2.2.4 Therapeutische Ansätze
2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche
2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT)
2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten
2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie
2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
3.2 Material
3.2.1 Klinikbedarf
3.2.2 Laborbedarf
3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen
3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese
3.2.5 Antikörper
3.3 Tiere
3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe
3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer
3.4 Methoden
3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung
3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen
3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation
3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation
3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden
3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung
3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus
3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten
3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest)
3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen
3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen
3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT
3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome
3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer
3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA)
3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA
3.4.7 Statistik
4 Ergebnisse
4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems
4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest
4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation
4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation
4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT
4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes
4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer
4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT
4.3.1 Differentialblutbild
4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA
4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA
4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score)
5 Diskussion
5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie
5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation
5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd
5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT
5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik
6 Zusammenfassung
7 Summary
7 Literaturverzeichnis
8 Anhang
8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden
8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung
8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung
8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests
8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde
8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie
8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum
9 Danksagung
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Validierung des Sanierungsfortschrittes in der Paratuberkulosebekämpfung eines ausgewählten Milchviehbestandes bei Einsatz serologischer Diagnostikverfahren. / Surveillance and control of paratuberculosis in a dairy herd based on serological methods.Karapetyan, Artsrun 18 November 2009 (has links)
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