Notre laboratoire a montré précédemment que le facteur NGF est produit par les cellules de cancer du sein et non par les cellules épithéliales mammaires normales. De plus, le NGF est un puissant facteur mitogène et anti-apoptotique pour les cellules de cancer du sein. Dans le cadre de ce travail, nous avons voulu déterminer l’implication du NGF dans l’angiogenèse tumorale ainsi que les mécanismes mis en jeu. Nous avons montré que le NGF est un puissant facteur angiogénique ayant un rôle essentiel dans la vascularisation tumorale dans des modèles expérimentaux chez la souris SCID. De plus, le NGF exerce des effets pléiotropiques sur les cellules endothéliales in vitro avec une intensité similaire au VEGF, le facteur angiogénique prototypique. Par ailleurs, l’effet stimulateur du NGF sur l’invasion des cellules endothéliales dépend de l’activation de son récepteur à activité tyrosine kinase TrkA et des voies de signalisation en aval telles que les voies PI3K/Akt et NO synthase. Enfin, nous avons montré que l’effet angiogénique du NGF est dévolu en partie à une activité du VEGF, puisque la neutralisation du VEGF à l’aide d’un anticorps conduit à une diminution de l’angiogenèse induite par le NGF. Ceci peut s’expliquer par le faite que le NGF augmente la sécrétion du VEGF par les cellules endothéliales et les cellules de cancer du sein. De façon intéressante, nous avons montré que la neurotrophine NT-4/5 exerce également un effet angiogénique in vitro. / Our laboratory has previously shown that the neurotrophic factor NGF (Nerve Growth Factor) is specifically produced by breast cancer cells and not by normal mammary epithelial cells. Furthermore, NGF is a powerful mitogenic and anti-apoptotic factor for breast cancer cells. To investigate the implication of NGF in breast cancer development, we wanted to determine its possible role in tumor angiogenesis and the underlying mechanisms. First, we showed that NGF is a powerful angiogenic factor playing an essential role in tumor vascularization in experimental models performed using SCID mice. Furthermore, NGF exerts pleiotropic effects on endothelial cells in vitro with intensity similar to VEGF. Moreover, NGF-stimulated invasion of endothelial cells depends on the activation of its receptor tyrosine kinase receptor TrkA and the downstream signaling pathways such as PI3K / Akt and NO synthase. Interestingly, we showed that angiogenic effect of NGF is partially due to VEGF, as NGF can increase secretion of VEGF by both endothelial cells and breast cancer cells; furthermore, neutralizing antibody against VEGF strongly reduces NGF-induced angiogenesis. In addition, we showed that neurotrophin factor NT-4/5 also exerts an angiogenic effect in vitro.

Le métabolisme des phosphoinositides constitue un processus crucial parmi les systèmes permettant la terminaison de la transmission intracellulaire d’un stimulus extracellulaire. En effet, l’une de principales voies de signalisation intracellulaire engendrée en réponse à la liaison d’hormones ou de facteurs de croissance sur leurs récepteurs spécifiques fait intervenir la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 par une PI 3-kinase. Les enzymes responsables du métabolisme de ce second messager sont donc essentielles à la fonction normale de la cellule. L’ADNc de la 5-phosphatase SHIP2 a été cloné dans notre laboratoire. Cette enzyme présente au sein de sa structure primaire, en plus d’un domaine catalytique 5-phosphatase, un grand nombre de motifs permettant des interactions spécifiques avec d’autres protéines : un domaine SH2 N-terminal, des séquences riches en prolines, un motif NPXY et un domaine SAM. SHIP2 joue un rôle de régulateur négatif dans la voie PKB et MAPK in vitro dans plusieurs modèles cellulaires. De plus, l’affinité de SHIP2 pour le cytosquelette a été mise en évidence notamment dans les plaquettes sanguines. Notre travail de thèse s’intègre dans le cadre de l’étude biochimique de SHIP2 et plus particulièrement dans la recherche de ses partenaires protéiques. La Vinexine, protéine du cytosquelette impliquée dans l’adhérence cellulaire, avait été identifiée comme une protéine interagissant avec SHIP2 par la technique du double hybride. Nous avons confirmé cette association par des expériences d’immunoprécipitation en système transfecté (cellules COS-7) ainsi qu’en système natif (cellules HeLa et MEF). Nous avons montré que cette interaction n’était ni modulée par une stimulation à l’EGF (dans des cellules COS-7) ni par le sérum (dans des cellules MEF). Nous avons démontré une colocalisation de SHIP2 avec la Vinexine  à la périphérie des cellules COS-7 stimulées à l’EGF. Par la suite, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de cette interaction dans l’adhérence cellulaire. Nous avons montré que la surexpression de SHIP2 ou de la Vinexine  augmente l’adhérence des cellules COS-7 sur un substrat de collagène I. L’adhérence à ce même substrat est diminuée dans les cellules MEF issues des souris déficientes en SHIP2 comparées à des cellules contrôles SHIP2 +/+. De plus, il apparaît que la partie carboxy-terminale de SHIP2 ainsi que son activité catalytique sont importantes pour l’adhérence des cellules au substrat. Ces résultats suggèrent un rôle important de SHIP2 dans l’adhérence cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine faisant intervenir un mécanisme probable de déphosphorylation du PtdInsP3.

Depuis plusieurs années, le tissu adipeux est reconnu comme un organe complexe et extrêmement important au maintien de l'homéostasie chez les mammifères. En effet, une dérégulation de sa taille et/ou de ses fonctions endocrines peut mener à l'apparition de nombreuses pathologies potentiellement mortelles, telles que le diabète de type II, l'hypertension ou encore des troubles cardiovasculaires. Ainsi, il est d'une importance capitale de bien comprendre les phénomènes moléculaires qui entourent la différenciation des cellules graisseuses afin de mieux réagir en clinique lors de l'apparition de telles conditions. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle d'une protéine kinase appelée dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) dans la formation du tissu graisseux en utilisant un modèle cellulaire murin à différenciation inductible, les 3T3-L1. À l'aide d'approches pharmacologiques et d'ARN interférence, j'ai pu démontrer que cette protéine est essentielle à l'adipogenèse. En effet, une diminution de l'expression de DLK dans les cellules 3T3-L1 bloque la différenciation à un stade précoce, i.e. entre la liaison du facteur de transcription C/EBP[béta] à l'ADN et l'expression de ses gènes cibles, tels que C/EBP[alpha] et PPAR[gamma]. L'étude plus poussée des voies de signalisation des MAPKs à l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques dans des cellules où l'expression de DLK a été diminuée a révélé que l'action bénéfique de DLK lors de la différenciation se situe au niveau de la voie ERK. En effet, l'induction de DLK au cours de l'adipogenèse résulte en une diminution de l'association des protéines KSR-1, Mek et ERK, ce qui mène à une diminution temporaire de l'activité de ERK et de la phosphorylation inhibitrice sur la sérine 82 du régulateur central de la différenciation des adipocytes, PPAR[gamma]. Finalement, nous avons pu déterminer que l'induction de DLK au cours de la différenciation des cellules graisseuses est modulée par PPAR[gamma].

Les thérapies ciblées dirigées contre les récepteurs de la famille des HER représentent un progrès majeur en cancérologie. Leur efficacité repose sur leur capacité à inhiber la signalisation oncogénique notamment recrutant les voies RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT. Indépendamment de l'expression de la cible moléculaire, l'activité des thérapies ciblées est tributaire de la présence dans le tissu tumoral d'anomalies génétiques capables de perturber la signalisation cellulaire tumorale en aval des récepteurs. Notre travail a consisté à évaluer l'intérêt de l'évaluation de la fonctionnalité des voies de signalisation par analyse multiplexe des niveaux d'expression des formes phosphorylées des principales kinases intracellulaires en aval des récepteurs HER. La preuve de concept a été tout d'abord apportée sur des modèles cellulaires génétiquement modifiés, en montrant l'impact d'anomalies génétiques tumorales sur la fonctionnalité des voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT et sur la réponse au cétuximab. Dans la seconde partie de ce travail, après validation des techniques utilisées en situation clinique, nous avons montré la pertinence d'une approche de biologie intégrative combinant analyse de génétique moléculaire et analyses fonctionnelles avec analyse en composante principale. Nos résultats, obtenus au cours d'une étude clinique rétrospective dans les cancers colorectaux métastatiques, suggèrent que l'utilisation des données issues de l'évaluation de la fonctionnalité des voies de signalisation en aval des récepteurs HER, pourraient à terme trouver des applications en qualité de marqueurs prédictifs de réponse clinique aux thérapies ciblées anti-HER / Targeted therapies, monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors, directed against the Human Epidermal Growth Factor Receptors (HER) family, represent a major advance in oncology. Their efficacy depends on their ability to inhibit oncogenic signalling, including the RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT signalling pathways. Regardless of the expression of the molecular target, the efficacy of targeted therapies is independent on the genetic abnormalities of the tissue which are able to disrupt tumour cell signalling, and the research of these abnormalities is now included in the prescription criteria. The aim of this work was to evaluate the usefulness of assessing HER downstream signalling functionality using multiplex analysis of the phosphorylated forms of key intracellular kinase signalling. Proof of concept was first introduced with genetically modified cell lines models, showing the consequences of tumour genetic abnormalities on RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT signalling pathways and on response to cetuximab. In the second part of this work, after validation of the techniques used in clinical situation, we demonstrated the relevance of system biology approach, combining molecular biology and functional analysis with principal component analysis. Our results obtained in a retrospective clinical study in metastatic colorectal cancer, suggests that the use of data from the evaluation of HER downstream signalling pathways functionality could eventually find applications as predictive markers of clinical response to anti-HER targeted therapies

Le Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire est impliqué dans un grand nombre de processus biologiques chez toutes les cellules de l’organisme. Chez les cellules non-excitables, les protéines TRPC, pour transient receptor potentiel canonical, situées à la membrane plasmique, sont des canaux calciques impliqués dans l’entrée de calcium. TRPC6 est particulièrement étudiée vu son implication potentielle dans plusieurs problèmes pathologiques. La glomérulosclérose focale et segmentale (FSGS) qui est une maladie dérégulant le système de filtration du rein, l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique (IPAH), caractérisé par une élévation anormale et sporadique de la pression sanguine au niveau des artères pulmonaires, ainsi que dans certains cancers. Ses modes et mécanismes d’activation ainsi que sa régulation sont encore aujourd’hui très peu connus, malgré les nombreuses recherches menées. Le but de la présente étude est d'investiguer la régulation de TRPC6 via son ubiquitination. L’ubiquitination des protéines, processus étudié depuis longtemps, a été démontré pour moduler l’activité de plusieurs protéines et réguler leur localisation cellulaire et membranaire. Nos travaux démontrent, que l’état d'ubiquitination de TRPC6 est modulé et favorisé par une stimulation avec des agonistes du canal TRPC6 , tel que le CCh et la Tg. L’utilisation d’inhibiteurs des différentes voies de dégradation utilisant l’ubiquitine comme moyen de régulation, nous permet de démontrer que l’ubiquitination de TRPC6 se fait suivant son internalisation. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’implication de Rabex-5, un facteur d’échange de nucléotide guanylique (GEF) de Rab5 qui se lie aux protéines membranaire ubiquitinylées. Nous démontrons une interaction entre TRPC6 et Rabex-5. Cette interaction n’a aucune influence sur l’activité de TRPC6. De plus, nous démontrons que l’activité GEF de Rabex-5 n’est pas nécessaire à cette interaction et n’influence pas l’activité du canal TRPC6 . Cette étude a permis de déterminer que TRPC6 est un canal ubiquitinylé, que cette ubiquitination se fait suivant son internalisation et est modulée par certains agonistes, tel que le CCh et la Tg. Sans que cette dernière ne soit impliquée dans l’activité fonctionnelle du canal, nous démontrons également une interaction entre TRPC6 et Rabex-5, une protéine localisée au niveau des endosomes précoces. Cette étude est un premier pas vers la compréhension de la régulation via l’ubiquitination, pour le canal TRPC6.

Le vieillissement de la population augmentera l’incidence des troubles osseux, notamment les fractures ostéoporotiques, menant ainsi à des pertes osseuses de taille critique. La méthode privilégiée afin de combler ces pertes, l’autogreffe, comporte cependant des limitations. L’une des alternatives étudiées est l’utilisation de matériaux biomimétiques. Afin d’optimiser la régénération osseuse, les biomatériaux doivent interagir avec le tissu environnant. Ainsi, ces matériaux peuvent être fonctionnalisés avec des peptides d’adhésion, le peptide Arg-Gly-Asp (RGD) étant l’une des séquences les plus fréquemment utilisées. De plus, afin de favoriser la différenciation des cellules en ostéoblastes, l’utilisation de facteurs de croissance tels que les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs) s’avère efficace, la BMP-2 et la BMP-7 étant approuvées par la Food and Drug Administration pour des applications commerciales de régénération osseuse. La BMP-9 a montré avoir un potentiel ostéogénique supérieur à ces dernières. Par contre, peu d’études portent sur l’influence des peptides d’adhésion sur la réponse des cellules aux BMPs. Ce projet de maîtrise a donc pour principal objectif d’étudier l’impact d’un film de polycaprolactone (PCL) fonctionnalisé par des peptides d’adhésion dérivés de la sialoprotéine osseuse (PCL-pBSP) ou de la fibronectine (PCL-pFibro) sur la réponse de cellules souches mésenchymateuses (MSCs) C3H10T1/2 à la BMP-9 et à ses peptides dérivés (pBMP-9 et SpBMP-9). En effet, les BMPs étant coûteux à produire et purifier, des peptides dérivés moins dispendieux ont été développés. Le premier volet de ce mémoire consiste en une revue de la littérature qui vient d’être acceptée dans le journal Frontiers in Bioscience. Le tissu osseux, le processus de réparation osseuse et les types d’interactions entre les cellules osseuses et les biomatériaux y sont décrits. Elle présente aussi le processus de différenciation ostéogénique des MSCs afin d’identifier les molécules pouvant être utilisées dans le développement de matériaux biomimétiques en plus de décrire les plus récents matériaux biomimétiques fonctionnalisés par des peptides d’adhésion utilisés conjointement avec des facteurs de croissance. Le deuxième volet décrit les résultats expérimentaux obtenus qui font l’objet d’un article soumis dans le journal Acta Biomaterialia. Il a été démontré que le PCL-pFibro par rapport au PCL-pBSP permettait une meilleure organisation du cytosquelette des C3H10T1/2 et une activation plus rapide de la focal adhesion kinase, protéine impliquée dans l’adhésion cellulaire. De plus, les 2 films de PCL fonctionnalisés ont montré un effet contraire au niveau de la signalisation JNK; le PCL-pFibro l’activait tandis que le PCL-pBSP l’inhibait. Or JNK est indispensable à la différenciation ostéogénique des C3H10T1/2 induite par la BMP-9. Suite à une stimulation des MSCs par la BMP-9 ou ses peptides dérivés, les C3H10T1/2 adhérant sur le PCL-pFibro ont montré une activation et une translocation nucléaire des Smad1/5/8 plus importantes que sur PCL-pBSP. À plus long terme, l’expression de Runx2, marqueur de la différenciation ostéogénique des MSCs, était plus importante sur PCL-pFibro que sur PCL-pBSP. En conclusion, ces travaux ont permis de démontrer le potentiel du PCL-pFibro comme matériau biomimétique capable d’induire une signalisation intracellulaire favorable à l’action de la BMP-9 et de ses peptides dérivés dans un processus de différenciation ostéogénique des MSCs. Ce matériau pourrait donc être prometteur dans une stratégie de réparation des pertes osseuses en combinaison avec le pBMP-9 ou SpBMP-9.

Intracellular Ca[superscript 2+] is involved in many biological processes in all cells throughout the organism. In non excitable cells, TRPC proteins located at the plasma membrane are calcium channels involved in calcium entry. TRPC6 is particularly studied since its implication in many pathologies, as FSGS, IPAH and some cancers. Its activation and regulation modes and mechanisms are yet fully understood, in spite of the intense research. The purpose of the present study is to investigate the regulation of TRPC6 by phosphorylation. For this, we used metabolic labeling and videomicroscopy techniques in order to evaluate direct TRPC6 phosphorylation and activity. We hence identified a basal as well as a PKC-dependent phosphorylation on TRPC6. PKC is known to modulate the activity of TRPC1, TRPC3, TRPC4 and TRPC5. Recent studies also showed that TRPC6 is inhibited by PKC. Our first study confirms that activation of PKC leads to TRPC6 activity inhibition. When using GF1, a specific PKC inhibitor, calcium entry in TRPC6-expressing cells is potentiated. We moreover show that TRPC6 is phosphorylated following PKC activation. We identify the serine at position 448 as being phosphorylated and responsible for the PKC-mediated inhibition. The S448A mutant of TRPC6 is no longer phosphorylated nor inhibited by PKC. This first study thus demonstrates that PKC-dependent phosphorylation of serine 448 of TRPC6 mediates channel inhibition. In the second study, we investigate the basal phosphorylation of TRPC6, which was observed in the first study. Mass spectrometry analysis identified serine 814 as being potentially phosphorylated, a fact confirmed by metabolic labeling assays performed on the S814A mutant of TRPC6. We show that the S814A mutation does not affect TRPC6 activity. Even though the S814 is in a consensus CK2 phosphorylation sequence, we also show that CK2 is not involved in the phosphorylation or the regulation of TRPC6. These studies thus led to the identification of two new phosphorylations on TRPC6, serine 448 and 814. We also characterized the mechanism by which PKC regulates TRPC6.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]

Résumé : La variation de la [Ca2+] intracellulaire participe à nombreux de processus biologiques. Les cellules eucaryotes expriment à la membrane plasmique une variété de canaux par lesquelles le calcium peut entrer. Dans les cellules non excitables, deux mécanismes principaux permettent l'entrée calcique; l'entrée capacitative de Ca2+ via Orai1 (SOCE) et l'entrée calcique activé par un récepteur (ROCE). Plusieurs protéines clés sont impliquées dans la régulation de ces voies d'entrée calcique, ainsi que dans l'homéostasie calcique. TRPC6 est un canal calcique impliquée dans l'entrée calcique dans les cellules à la suite d’une stimulation d’un récepteur hormonal. TRPC6 transloque à la membrane cellulaire et il y demeure jusqu'à ce que le stimulus soit retiré. Les mécanismes qui régulent le trafic et l'activation de TRPC6 sont cependant encore peu connus. Des découvertes récentes ont démontré qu'il y a un rôle potentiel de Rho kinase dans l'activité de TRPC6. Rho kinase est activée par la petite protéine G RhoA qui peut être activée par les protéines G hétérotrimériques Gα12 et Gα13. En plus de Gα12 et Gα13, les protéines de désensibilisation des GPCR β -arrestin 1 et / ou β-arrestin 2 peuvent aussi activer RhoA. Le but de notre étude est d'examiner la participation des protéines Gα12/13 et β-arrestin 1/ β-arrestin 2 dans l'activation de TRPC6 et de la protéine Orai1. Nous avons utilisé des ARN interférant (siRNA) spécifiques pour induire une réduction de l'expression de Gα12/13 ou β-arrestin 1/β-arrestin 2. La conséquence sur l’entrée de Ca2+ dans les cellules a été ensuite déterminée par imagerie calcique en temps réel suite à une stimulation par la vasopressine (AVP), thapsigargin ou carbachol. Nous avons donc identifié que dans des cellules A7r5, une lignée cellulaire de musculaires lisses vasculaires où le canal TRPC6 exprimé de manière endogène, la diminution de l’expression des protéines Gα12 ou Gα13 ne semble pas modifier l’entrée Ca2+ induit par l’AVP par rapport aux cellules témoins. D'autre part, la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 dans des cellules HEK 293 ainsi que des cellules HEK 293 exprimant de façon stable TRPC6 (cellules T6.11) ont augmenté l’entrée de Ca2+ induite par thapsigargin, un activateur pharmacologique de SOCE. Des études de co-immunoprécipitation démontrent une interaction entre la β-arrestin 1 et STIM1, alors qu'aucune interaction n'a été observée entre les β-arrestin 1 et Orai1. Nous avons de plus montré à l'aide d'analyse en microscopie confocale que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 n’influence pas la quantité d’Orai1 à la périphérie cellulaire. Cependant, des résultats préliminaires indiquent que la diminution de l’expression β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 augmente la quantité de STIM1-YFP dans l'espace intracellulaire et diminue sa quantité à la périphérie cellulaire. En conclusion, nous avons montré que les β-arrestin 1 ou β-arrestin 2 sont impliquées dans l'entrée capacitative de Ca2+ (SOCE) et contrôlent la quantité de STIM1 dans le réticulum endoplasmique. / Abstract : In an organism, intracellular [Ca2+] takes part in many biological processes. Eukaryotic cells express a variety of channels in the plasma membrane through which calcium can enter. In non-excitable cells, two main mechanisms allow calcium entry; the store-operated calcium entry via Orai1 (SOCE) and receptor-operated calcium entry (ROCE). Several key proteins are involved in the regulation of these calcium entry pathways as well as in calcium homeostasis. TRPC6 is a calcium channel implied in calcium entrance into the cells following hormonal stimulation and translocates to the plasma membrane. TRPC6 channel appear to the plasma membrane until the stimulus is present. Although, the mechanisms that regulate the trafficking and activation of TRPC6 are still little known. Recent findings have demonstrated that there is a potential role of Rho kinase in activity of TRPC6. Rho kinase is activated by the small G protein RhoA that itself can be activated by the heterotrimeric G proteins Gα12 and Gα13. In addition to Gα12 and Gα13 proteins, cytosolic GPCR desensitizing proteins β-arrestin 1 and/or β-arrestin 2 could also activate RhoA. The purpose of our study is to investigate the involvement of the proteins Gα12/13 and β-arrestin 1/β-arrestin 2 in the activation of TRPC6 and Orai1 protein. We used siRNA specific to Gα12/13 or β-arrestin 1/β-arrestin 2 to knockdown their endogenous expression. Then, calcium imaging in real time was performed in order to see the quantity of calcium entered into the cell following stimulation by vasopressin (AVP), thapsigargin, or carbachol. We hence identified that in A7r5 cell, vascular smooth muscle cell where TRPC6 channel expressed endogenously; reduced expression of Gα12 or Gα13 proteins does not seem to modify the AVP-induced Ca2+ entry compared to control cells. On the other hand, calcium imaging experiment in knocked down β-arrestin 1 or β-arrestin 2 in HEK 293 cells as well as HEK 293 cells stably transfected with TRPC6 (T6.11 cells) resulted in an increased thapsigargin-induced calcium entry. The co-immunoprecipitation studies demonstrate an interaction between β-arrestin 1 and STIM1, a calcium sensor in SOCE influx, while no interaction was observed between β-arrestin 1 and Orai1.We moreover showed by confocal microscopy that reduced expression of β-arrestin 1/ β-arrestin 2 does not influence the quantity of Orai1 at the cell periphery. Preliminary results showed that reduced expression of β-arrestin 1 or β-arrestin 2 increases the quantity of STIM1-YFP in the intracellular space and less it’s in peri-membrane space. In conclusion, we showed that β-arrestin 1 or β-arrestin 2 are involved in the store-operated calcium entry (SOCE) and control the quantity of STIM1 in the endoplasmic reticulum.