Das zu den Protozoen gehörende Phylum der Apicomplexa umfasst nahezu 6000 Parasitenarten. Die meisten Apicomplexa haben sich an eine obligat intrazelluläre Lebensweise angepasst und infizieren verschiedenste Tiere und den Menschen. Zu den bedeutendsten Vertretern der Apicomplexa zählen Toxoplasma, Plasmodium und Eimeria. In dieser Arbeit lag der Schwerpunkt auf den drei repräsentativen Organismen Toxoplasma gondii, Eimeria falciformis und Plasmodium berghei, welche sich alle in einem etablierten Wirt (der Maus) reproduzieren, sich allerdings hinsichtlich ihrer Wirtszellen, Persistenz sowie in ihrem Reproduktionsverhalten deutlich unterscheiden. Somit ermöglichen die genannten Parasiten eine umfassende Untersuchung der Biologie der Apicomplexa. Die meisten Entwicklungsstufen dieser Pathogene sind sehr eng mit der Wirtszelle assoziiert, was auch metabolische Wechselwirkungen beinhaltet. Das Verständnis dieser Interaktionen ist unerlässlich, um die Evolution von Parasiten zu ergründen. Grundsätzlich war das Ziel dieser Arbeit, die metabolischen Netzwerke der genannten Parasiten zu eruieren und den Einfluss des Metabolismus auf Wachstum, Pathogenese und Adaption in verschiedenen Nährstoffumgebungen zu untersuchen. Unsere Vorgehensweise verband biochemische, revers-genetische, zellbiologische und optogenetische Bottom-Up-Methoden mit Top-Down-Methoden wie Lipidomics, Metabolomics und Transcriptomics um folgende Prämissen anzugehen: • Vergleichender Entwurf der metabolischen Netzwerke in den obengenannten Parasiten • Nährstoff-Plastizität für die Überlebensfähigkeit des Parasiten in verschiedenen Milieus • Umregulierung oder Ausbeutung des Wirtsmetabolismus durch intrazelluläre Parasiten • Stadien-spezifische Regulation des Metabolismus während der asexuellen Reproduktion • Identifizierung und Validierung potentieller anti-parasitischer Wirkstoffe / The protozoan phylum apicomplexa comprises nearly 6000 parasitic species. Most apicomplexans have adapted to obligate intracellular parasitism in a wide range of organisms, including animals and humans. Some notable members of the phylum include Toxoplasma, Plasmodium and Eimeria species. This study focused on three representative parasites, namely Toxoplasma gondii, Eimeria falciformis and Plasmodium berghei, all of which infect a common and well-established model host organism (i.e. mouse), but have diverged from each other considerably with respect to the target host cells, persistence and reproduction behavior. These parasites together therefore enable a fairly inclusive study of the apicomplexan biology. Most developmental stages of these pathogens intimately associate with host cells, involving a metabolic crosstalk between the two entwined entities. A germane understanding of such interactions is vital to appreciate the evolution of parasites. In a nutshell, this work aimed to determine the design of metabolic networks in indicated parasites and the impact of metabolism on growth, pathogenesis and adaptation in discrete nutritional milieus. Our approach blended bottom-up methods of biochemistry, reverse genetics, cell biology and optogenetics with the top-down lipidomics, metabolomics and transcriptomics to address the following major premises: • Comparative design of the selected metabolic networks in aforementioned parasites • Nutritional plasticity underlying the parasite survival in variable environments • Subversion or exploitation of host metabolism by intracellular parasites • Stage-specific rewiring of parasite metabolism during asexual reproduction • Identification and endorsement of potential anti-parasitic drug targets

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Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Sich überlappende synthetische Peptide aus dem Bereich der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und dem TLM, sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region interagieren mit dem Nukleokapsid, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf. Rekombinante Proteine ähnlich den synthetischen Peptiden aber mit der vollständigen PreS2-Region, sind nach Internalisierung im Zytosol nachweisbar. Die Sekretion viraler Partikel wurde partiell inhibiert. Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Durch simultane Inhibierung der Signalkaskade so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen. / Assembly of HBV particles and subsequent secretion of mature virus requires the interaction of the nucleocapsid with defined domains of the surface proteins. Overlapping synthetic peptides covering the C-terminal part of the PreS1 domain and the cell permeable domain of PreS2 (TLM) were shown to localize most of all in the nucleus. Based on these peptides aa 101-115 of PreS1 were found to be essential for the interaction with the nucleocapsid, while the PreS2 domain does not interact with the nucleus. Presence of the peptides that compete the nucleocapsid surface protein interaction a block of HBV and antigen secretion was achieved. HBcAg as natural interaction partner of the surface proteins then arises increased in the nucleus. Recombinant proteins similar to the synthetic peptides but with the whole PreS2 domain localize in the cytoplasm and block HBV and antigen secretion. The genome of HBV encodes two transcriptional activators: the HBx protein and the PreS2 activator LHBs. Both trigger activation of c-Raf-1/MEK kinase cascade. To evaluate the importance of both activators for viral replication selective inhibitions of signal transduction cascades were performed and do not result in a decrease of viral replication. Simultaneous inhibition of both activators abolished viral secretion. It is due to a reduced de novo synthesis and not to an accumulation of viral proteins in cells. The relevance of activator function was tested by mutated HBV genome defective for HBx and / or PreS2 activator function. After transfection single mutants show no significant reduced HBV expression whereas at the double mutated HBV genome a strong reduced virus expression could be observed. The HBx protein and the PreS2 activator LHBs are important for viral replication but they can replace each other.

Einen Aspekt dieser Arbeit stellt die Analyse der Stimulation von Ratten-Calvaria-Osteoblasten (RCA) mit den beiden Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 während der Proliferations- sowie Differenzierungs- und Mineralisierungsphase dar. Hierfür soll die Phosphorylierung und Aktivierung von Erk1 und Erk2, sowie von Smad1 und Smad2 mit Hilfe eines Kinase-Aktivitätsassays sowie der Westernblot-Analyse untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit soll weiterhin untersucht werden, welche Bedeutung die Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), einem wichtigen Differenzierungsmarker in Osteoblasten, ausüben. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen und zytochemische Färbung aktiver ALP sollen darüber Aufschluss geben. Weiterhin soll der Gehalt an ALP-mRNA durch PCR bestimmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit ist die Analyse der Bedeutung von Erk1, Erk2, Smad1 und Smad2 auf die Aktivität der ALP. Dafür sollen Inhibitoren eingesetzt werden. Die enzymatische Aktivitätsbestimmung soll darüber aufklären. Außerdem soll mit Hilfe von kurzen, doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) ein knock down der Kinasen herbeigeführt werden und dessen Auswirkung auf die Aktivität der ALP enzymatisch bestimmt werden. Dafür muss zunächst die Wirksamkeit der siRNA auf RNA-Ebene mittels PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot-Analysen überprüft werden. Zusätzlich soll die Bedeutung der Wachstumsfaktoren und der Kinasen Erk1 und Erk2 auf die Mineralisierung der RCA analysiert werden. Dafür wird die Menge des zellassoziierten Kalziums und Phosphats experimentell bestimmt, wodurch der Mineralisationsgrad der Zellen wiedergegeben werden kann.

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Einen Aspekt dieser Arbeit stellt die Analyse der Stimulation von Ratten-Calvaria-Osteoblasten (RCA) mit den beiden Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 während der Proliferations- sowie Differenzierungs- und Mineralisierungsphase dar. Hierfür soll die Phosphorylierung und Aktivierung von Erk1 und Erk2, sowie von Smad1 und Smad2 mit Hilfe eines Kinase-Aktivitätsassays sowie der Westernblot-Analyse untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit soll weiterhin untersucht werden, welche Bedeutung die Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), einem wichtigen Differenzierungsmarker in Osteoblasten, ausüben. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen und zytochemische Färbung aktiver ALP sollen darüber Aufschluss geben. Weiterhin soll der Gehalt an ALP-mRNA durch PCR bestimmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit ist die Analyse der Bedeutung von Erk1, Erk2, Smad1 und Smad2 auf die Aktivität der ALP. Dafür sollen Inhibitoren eingesetzt werden. Die enzymatische Aktivitätsbestimmung soll darüber aufklären. Außerdem soll mit Hilfe von kurzen, doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) ein knock down der Kinasen herbeigeführt werden und dessen Auswirkung auf die Aktivität der ALP enzymatisch bestimmt werden. Dafür muss zunächst die Wirksamkeit der siRNA auf RNA-Ebene mittels PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot-Analysen überprüft werden. Zusätzlich soll die Bedeutung der Wachstumsfaktoren und der Kinasen Erk1 und Erk2 auf die Mineralisierung der RCA analysiert werden. Dafür wird die Menge des zellassoziierten Kalziums und Phosphats experimentell bestimmt, wodurch der Mineralisationsgrad der Zellen wiedergegeben werden kann.