Introdução: A bronquiolite aguda é a principal causa de internação de lactentes menores de um ano de idade e tem como principal agente etiológico o vírus sincicial respiratório (VSR). O diagnóstico baseia-se na apresentação clínica e epidemiologia. A maioria das medidas terapêuticas é controversa e apesar da etiologia viral, a prescrição de antibióticos sistêmicos é freqüente. Não está claro se a pesquisa etiológica viral pode influenciar na conduta nesses lactentes. Objetivo: Analisar o impacto da realização de pesquisa etiológica viral sobre a conduta terapêutica, em lactentes internados com bronquiolite aguda. Casuística e métodos: Foi realizado estudo de coorte histórica que incluiu lactentes menores de 12 meses, internados no Hospital Universitário da USP durante dois anos, com diagnóstico de alta de bronquiolite aguda e que tiveram coletado aspirado de nasofaringe, para pesquisa viral, por imunofluorescência indireta (IFI), à admissão. Foram excluídos os lactentes com fatores de risco conhecidos para desenvolver doença grave. As informações foram coletadas dos prontuários. As alterações de condutas realizadas até 24 horas após a divulgação do diagnóstico etiológico foram consideradas associadas ao resultado da IFI. Resultados: Dentre 1199 lactentes, menores de 12 meses hospitalizados, 71% apresentaram diagnóstico de doença aguda do aparelho respiratório, sendo que 33% apresentaram bronquiolite. Desses, 33 foram excluídos e 20 não puderam ter a análise concluída. A idade média, dos 230 lactentes estudados, foi de 4 meses (± 2,7) e 56% foram do sexo masculino. Broncodilatadores, corticosteróides e antibióticos foram prescritos, à admissão em 80%, 52% e 55% dos casos, respectivamente. A pesquisa viral foi positiva para algum vírus em 165 casos e negativa em 65. O VSR foi identificado em 146 casos e outros vírus em 19. Os grupos com pesquisa viral negativa e positiva foram semelhantes com relação à prescrição de antibióticos (52% x 56%, respectivamente, p = 0,636), corticosteróide (42% x 56% -p = 0,052) e broncodilatadores (74% x 83%, p = 0,114) à admissão. A suspensão de antibióticos predominou nos pacientes com pesquisa viral positiva (35,6% x 9,2%, p < 0,001). Não houve alteração significante quanto as prescrições de corticosteróides e broncodilatadores. Também na comparação entre pacientes VSR (+) e com resultado negativo para pesquisa viral, o padrão de alterações de conduta foi semelhante. Houve suspensão de antibióticos em 32,2% e 9,2%, respectivamente (p < 0,001). O resultado positivo da pesquisa viral foi o único fator independentemente associado à suspensão de antibióticos, tanto no grupo com pesquisa viral positiva para qualquer vírus (RR = 3,37, p = 0,005) como no grupo VSR(+) (RR = 3,33, p = 0,006) Conclusão: Em lactentes hospitalizados com BA, o resultado positivo da pesquisa viral por IFI, foi determinante da suspensão de antibióticos sistêmicos, prescritos à admissão. / Background: Acute bronchiolitis is the leading cause of infant hospitalization, and it is most commonly caused by respiratory syncytial virus (RSV). Etiological tests are not required for its diagnosis, which can be made clinically. The most prescribed therapeutic measures are controversial, and in spite of the viral etiology, the prescription of systemic antibiotics is frequent. It remains unclear whether viral screening could contribute to therapy adjustment. Objective: To analyze the impact of viral screening on the therapeutic management of hospitalized infants with acute bronchiolitis. Patients and methods: A retrospective cohort was performed to assess the impact of RSV screening on medication prescription. The study included infants up to 1 year of age who were hospitalized at the University Hospital USP for 2 years, with bronchiolitis as discharge diagnosis and who had nasopharyngeal samples collected on admission for virus screening, by indirect immunofluorescence assay (IFA). Infants were excluded if they had a known risk factors for developing severe disease. Clinical information was obtained from the patients medical records. Therapeutic changes were considered to be associated with viral screening when made within 24 hours of the release of IFA results. Result: Among 1199 hospitalized infants younger than 12 months, 71% were diagnosed with acute lower respiratory disease, of which 33% had bronchiolitis. Of these, 33 were excluded and 20 could not have the analysis completed. The average age of the 230 infants studied was 4 months (+/- 2.7) and 56% were male. Bronchodilators, steroids and antibiotics were prescribed on admission for 80%, 52%, and 55% of cases, respectively. The viral test was positive for some virus in 165 cases and negative in 65. RSV was identified in 146 cases and other viruses in the 19. At admission, the groups with negative or positive viral test were similar regarding the prescription of antibiotics (52% vs 56% respectively, p=0.636), corticosteroids (42% vs 56%, p=0.052) and bronchodilators (74% vs 83%, p=0.114). The discontinuation of antibiotics predominated in patients who tested positive for virus (35.6% vs 9.2%, p<0.001). There were no significant changes regarding the prescription of corticosteroids and bronchodilators. Also, when comparing patients with viral test positive for RSV or negative for any virus the patterns were similar. There was discontinuation of antibiotics in 32.2 % and 9.2%, respectively (p=0.001). The positive result of viral test was the only independent factor associated with the discontinuation of antibiotics, both in the group with positive viral test for any virus (RR=3.37, p=0.005) and in the RVS (+) group (RR=3.33, p=0.006). Conclusion: In hospitalized infants with acute bronchiolitis, the positive result for virus screening, by IFA was an independent factor associated to the discontinuation of systemic antibiotics prescribed at admission.

Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-08-30T19:28:55Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final Gabriela Fabiano de Souza.pdf: 1295606 bytes, checksum: 81a673082dab9c871a133af1f8517135 (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-09-03T12:11:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final Gabriela Fabiano de Souza.pdf: 1295606 bytes, checksum: 81a673082dab9c871a133af1f8517135 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-03T12:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Final Gabriela Fabiano de Souza.pdf: 1295606 bytes, checksum: 81a673082dab9c871a133af1f8517135 (MD5) Previous issue date: 2018-03-19 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Respiratory syncytial virus (RSV) is the major cause of infection in children up to five years of age. Reinfection is very common among patients, causing symptoms such as cold or allergy. However, in children, immunosuppressed patients and elderly infection is exacerbated leading to hospitalization and in some case, even death. The number of hospitalizations each year is alarming, even more so because up to now there is still no vaccine for RSV. Tissue damage in the lung caused by RSV leads to an immune response, where infected cells signal activation of signaling pathways, production of reactive oxygen species (ROS), and massive production of inflammatory mediators. Among this production is the macrophage migration inhibitory factor (MIF), which is a pro-inflammatory cytokine, which has been shown to play an important role in the immune response. Knowing this importance, we evaluated MIF expression macrophages from BALB/c mice. The cells were infected with different concentrations of RSV and analyzed by western blot, real-time PCR and Cytometric Bead Array (CBA). After confirmation of MIF expression by the infection, different inhibitors of signaling pathways and ROS were used to evaluate its importance for the expression of MIF. From the results obtained, we showed the dependence of ROS, 5-lipoxygenase (5-LOX), COX, PI3K and partially of P38 MAPK, for MIF expression, besides the need for viral activity. MIF was shown to be important for the release of cytokines such as TNF?, MCP-1 and IL-10. Based on this information MIF may play an important role in the exacerbation of infection, so it was extremely important to explore mechanisms involved in the expression of MIF in relation to RSV. / O V?rus sincicial respirat?rio (VSR) ? a maior causa de infec??o em crian?as at? os cinco anos de idade. A reinfec??o ? muito comum entre os pacientes, causando sintomas como de uma gripe ou alergia, no entanto, em crian?as, pacientes imunossuprimidos e idosos a infec??o ? muito mais exacerbada, o que acaba levando a necessidade de interna??o, podendo levar o paciente a ?bito. O n?mero de interna??es a cada ano ? alarmante, ainda mais que at? os dias atuais ainda n?o se tem uma vacina para o VSR. O dano tecidual no pulm?o, causado por VSR leva a uma resposta imune, onde c?lulas infectadas sinalizam para que ocorra a ativa??o de vias de sinaliza??o, produ??o de esp?cies reativas de oxig?nio (EROs) e tamb?m uma produ??o massiva de mediadores inflamat?rios. Dentre essa produ??o, est? o fator inibidor de migra??o de macr?fagos (MIF), que ? uma citocina pr?-inflamat?ria, que tem demonstrado um importante papel na resposta imune. Sabendo dessa import?ncia, avaliamos a express?o de MIF em macr?fagos de camundongos BALB/c. As c?lulas foram infectadas com diferentes concentra??es de VSR e analisadas por western blot, PCR em tempo real e Cytometric Bead Array (CBA). Ap?s a confirma??o da express?o de MIF pela infec??o, foram utilizados diferentes inibidores de vias de sinaliza??o e de EROs, para que fosse poss?vel avaliar sua import?ncia para a express?o de MIF. A partir dos resultados obtidos mostramos a depend?ncia de EROS, 5-lipoxigenase (5-LOX), COX, PI3K e parcialmente de P38 MAPK, para a express?o de MIF, al?m da necessidade de atividade viral. MIF se mostrou importante para a libera??o de citocinas como TNF ?, MCP-1 e IL-10. Baseado nessas informa??es MIF pode desempenhar um papel importante na exacerba??o da infec??o, sendo assim, foi de extrema import?ncia explorar mecanismos envolvidos na express?o de MIF em rela??o ao VSR.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:11:25Z : No. of bitstreams: 1 souza_avg_me_botfm.pdf: 5208360 bytes, checksum: d0caf95e74fc05f32950a4bbcec4f765 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Vírus Sincicial Respiratório humano (VSR) é o principal agente causal das Infecções Respiratórias Agudas (IRAs) em lactantes e pré-escolares. Apresenta dois subgrupos – A e B – sendo o primeiro responsável por quadros clínicos mais graves. Os RNA mensageiros virais codificam 11 proteínas conhecidas, das quais a proteína F é responsável pela fusão viral à célula e se apresenta na forma de F0 com peso molecular de 67kDa, podendo ser clivada em duas unidades: F2 de 20kDa e a F1 de 47kDa. A proteína F recombinante (Fr), expressa em E.coli (BL21A no vetor pET28a), foi cedida por pesquisadores da UNESP de São José do Rio Preto. Com intuito de produzir anticorpos monoclonais contra a proteína Fr para fins de diagnóstico laboratorial, inoculamo-la em camundongos isogênicos Balb/c. Durante o desenvolvimento do monoclonal, foi necessário a eliminação da contaminação de cultura por Mycoplasma ssp. Após ajuste de dose de inoculação e descontaminação do antígeno (hipótese: contaminação com endotoxinas provenientes de E.coli), seis clones secretores de anticorpos monoclonais foram produzidos (5 do tipo IgM e 1 do tipo IgG2a) e testados, simultâneamente, contra toxina bacteriana e proteína Fr (40μg/mL) por técnica de ELISA indireto. Paralelamente, testes por citometria de fluxo foram realizados, incubando-se os clones obtidos com E.coli (bactéria com membrana permeabilizada e in natura). Os clones (VIRSV2-87A74 e VIRSV2-87A80) apresentam um reconhecimento inespecífico de proteínas da E. coli e não foi possível caracterizar os clones obtidos em função da dificuldade de se obter novas amostras de proteína Fr. Para o futuro, os anticorpos obtidos deverão ser marcados com isotiocinato de fluoroceína e comporem um amplo teste epidemiológico em paralelo com o kit disponível em mercado respeitando a sazonalidade da doença. Novos ensaios para caracterização... / The Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) is the main cause of Acute Respiratory Insufficiency in suckling child and children below 5 years old. It has 2 subgroups – A and B – being the first one responsible for more dangerous clinical situations. The viral messenger RNA codifies 11 known proteins, which the F protein is responsible for the viral fusion and it is presented as F0 with molecular weight of 67kDa, but once is broke it generates two units: F2 with 20kDa and F1 with 47kDa. The recombinant F (Fr) protein were expressed on E.coli (BL21A, on vector pET28a), and it was given to us by researches from UNESP of São José do Rio Preto. Wishing to produce monoclonal antibodies (Mab) against Fr protein to laboratorial diagnosis, mice (Balb/c) were inoculated with de antigen (Fr protein). During the development of the Mab, it was necessary to eliminate, from the culture, Mycoplasma spp. After we adjusted the necessary amount to inoculate on the mice and eradicated the contamination of the antigen (hypotheses: there were endotoxins from the E.coli), six clones that secrete Mab were produced (5 of the kind IgM, and 1 of the kind IgG2a) and they were tested, simultaneously, against bacterium toxin and Fr protein (40μg/mL) using ELISA technique. Together, flow cytometry test were performed when we incubated the clones with E. coli (bacterium with permeable membrane and in natura). The clones (VIRSV2-87A74 and VIRSV2-87A80) presented an unspecific recognition for the proteins from E.coli and it was not possible to characterize the cells because we couldn´t get more samples of Fr protein. For the future, the Mab should be conjugated with FITC and then, they must be part of a wide epidemiologic test side by side from the commercial kit, always respecting the seasonal disease. New assays to characterize antibodies (like Western blotting and imunepreciptation) are already being done... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:06:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Spilki_FernandoRosado_D.pdf: 6085947 bytes, checksum: 7f34cc6e57c39e7467bfe62caa231676 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é uma causa importante de doença respiratória em bovinos. O BRSV é um membro da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, pertencendo ao gênero Pneumovirus. Nos últimos quinze anos, evidências sorológicas e de isolamento do vírus revelaram que o BRSV está circulando no Brasil, causando doença clinicamente evidente ou formas subclínicas da infecção. Na primeira parte do presente trabalho, seis diferentes linhagens celulares foram examinadas quanto a sua susceptibilidade à infecção pelo BRSV, levando em conta a variabilidade entre diferentes isolados e características de crescimento do vírus. Chicken embryo related cells (CER), e células CRIB (MDBK-resistentes à infecção pelo Vírus da Diarréia Viral Bovina, BVDV) foram as mais apropriadas à multiplicação do vírus. Ambas as linhagens permitiram o cultivo do vírus em títulos de até 105,5 DICC50 (Doses Infectantes para 50% dos Cultivos Celulares por 100 IlL)...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) is a major cause of respiratory disease in young cattle. The virus is a member of the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, belonging to the Pneumovirus genus. During the last fifteen years, serological evidence and isolation of the virus revealed that BRSV is circulating in Brazil, causing clinically evident respiratory disease or subclinical fonns of the infection. In the first part of the present work, susceptibility of six different cell lines to BRSV'"li infection in regard to viral isolate variability and growth characteristics of the virus were examined. Chicken embryo related cells (CER), and bovine CRIB cells (a bovine viral diarrhea virus-resistant clone ofMDBK cells) showed to be the most appropriate for virus multiplication. Both cells provided infectious virus titres ofup to 105,5 TCID50 (50% tissue culture infective doses per 100 flL)...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martini_MatheusCavalheiro_M.pdf: 571995 bytes, checksum: 52ec8a0bed8fa3efd4434ec2a2e6a100 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para avaliar a atividade antiviral dos extratos de plantas brasileiras foram eleitos o Metapneumovirus aviário (aMPV) e o vírus Respiratório sincicial bovino (BRSV) pertences à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gêneros Metapneumovirus e Pneumovirus respectivamente. Tanto o aMPV quanto o BRSV são vírus semelhantes aos que causam doenças em humanos como o vírus respiratório sincicial humano (HRSV) e metapneumovírus humano (hMPV). O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade antiviral de 12 diferentes espécies de plantas: Pterodon emarginatus Vogel.; Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch.; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaifera langsdorffii Desf; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke (Lin 3). Para realizar os estudos antivirais foi utilizada concentrações máximas não tóxicas para as diferentes linhagens celulares utilizadas frente aos dois vírus. Para os ensaios antivirais foram utilizadas a linhagens CER (Chicken embryo related cells) e CRIB (bovine viral diarrhea virus-resistant clone of MDBK cells) para o aMPV e BRSV respectivamente. Os extratos brutos com atividade antiviral foram submetidos a uma curva concentração resposta com diferentes concentrações de extrato na presença de 100 DICC/mL de cada amostra viral através do ensaio colorimétrico MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-z-yl)-2,5 difeniltertrazolim brometo] determinando assim a concentração antiviral 50% (EC50). Para determinar o mecanismo de ação dos extratos e os vírus nas células foram utilizados três diferentes tratamentos: (i) Pré-tratamento (célula tratada com extrato e posterior inoculação com a amostra viral); (ii) Pós-tratamento (célula inoculada com a amostra viral e depois tratada com o extrato); (iii) Virucida (extrato e vírus mantidos juntos e posterior inoculação na cultura celular). O extrato foi considerado ativo quando houve diminuição do título viral em 1,5 log em relação ao titulo viral controle. Os resultados mostraram que todos os extratos testados obtiveram concentrações não tóxicas para as diferentes linhagens celulares. Em relação à atividade antiviral o extrato da espécie Aspidosperma tomentosum apresentou atividade frente ao BRSV e aMPV, ambos no pré-tratamento. Os extratos das espécies Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis e Anniba rosaeodora apresentaram atividade antiviral para o aMPV no pós-tratamento. Nenhum extrato bruto apresentou atividade de "vírus-inativação" em relação aos vírus avaliados. Os demais extratos não apresentaram atividade antiviral significativa para nenhum destas espécies virais. O ensaio antiviral deste estudo poderá continuar sendo utilizado como triagem para outras espécies em busca de substâncias com potencial medicinal. As diferentes atividades de ação dos extratos sugerem a ocorrência de mecanismo de ação distinto entre os vírus avaliados / Abstract: To evaluate the antiviral activity of extracts from Brazilian plants two different viruses were elected Avian metapneumovirus (aMPV) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV) members of the family Paramyxoviridae, subfamily Pneumovirinae, Pneumovirus and Metapneumovirus genera respectively. Both viruses are similar to those that cause humans diseases such as respiratory syncytial virus (HRSV) and human metapneumovirus (hMPV). The purpose of this study was to assess the antiviral activity of 12 different plant species: Pterodon emarginatus Vogel; Kielmeyera coriácea Mart. & Zucc.; Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen; Virola sebifera Aubl.; Gaylussacia brasiliensis (Spreng.) Meisn.; Maytenus ilicifolia (Schrad.) Planch. ex. Reiss; Bursera aloexylon (Schiede ex Schltdl.) Engl.; Aspidosperma tomentosum Mart.; Copaífera langsdorffii Desf.; Baccharis dracunculifolia DC.; Arrabideae chica (Humb. & Bonpl.) B.Verl.; Aniba rosaeodora Ducke. (Lin 3). To perform the antiviral assay we used non toxic maximum concentrations of the plants extracts with different cell lines used against the two viruses. The cell lines used were CER (Chicken embryo related cells) and CRIB (bovine viral diarrhea resistant clone of MDBK cells) for AMPV and BRSV, respectively. The extracts with antiviral activity were subjected to a concentration response curve with varying concentrations of extract in the presence of 100 TCID / mL of each viral sample by colorimetric MTT assay [3 - (4,5- dimethylthiazol-z-yl) -2 , 5-diphenyltetrazolium bromide] to identify the antiviral 50% concentration (EC50). To define the mechanism of action of extracts and viruses in cells three different treatments were used: (i) pre-treatment (cells treated with plants extracts and subsequent inoculation with a viral sample), (ii) Post-treatment (cells inoculated with the viral sample and afterwards treated with the extract), (iii) Virucidal (viruses and plants extracts were kept together and after that inoculated into cell cultures). The extract was considered active when there was a decrease of virus titers by 1.5 log in contrast to the control viral titer. The results revealed that all tested extracts had no toxic concentrations for the different cell lines and detected the antiviral activity of the extract of the species Aspidosperma tomentosum against the BRSV and aMPV, both in the pretreatment conditions. The extracts of the species Virola sebifera; Arrabidaea chica; Gaylussacia brasiliensis and Anniba rosaeodora (Lin 3) exhibited antiviral activity for aMPV after treatment. The other extracts showed no significant antiviral activity for any of these viral species. The antiviral test of this study may still be used as screening for other species in search for substances with medicinal potential. The varied action activities of the extracts suggest that the occurrence of distinct mechanism of action between the viruses evaluated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O vÃrus sincicial respiratÃrio (VSR) destaca-se como patÃgeno importante de infecÃÃes das vias aÃreas inferiores (IVAI) infantis, principalmente no primeiro ano de vida. Este estudo teve como objetivos: determinar a prevalÃncia do VSR em casos de infecÃÃes respiratÃrias agudas (IRAs) em crianÃas atendidas no Hospital Infantil Albert Sabin, em Fortaleza - CE, entre janeiro de 2001 e julho de 2004; descrever o padrÃo de sazonalidade de circulaÃÃo do VSR ao longo do perÃodo de estudo; observar caracterÃsticas clÃnico-epidemiolÃgicas dessas infecÃÃes; caracterizar antigenicamente os VSR circulantes nos perÃodos epidÃmicos de 2003 e 2004 e determinar a taxa de isolamento do VSR em cultura de cÃlulas HEp-2 a partir de amostras coletadas em 2002, 2003 e 2004 e estocadas a â20ÂC. Aspirados de nasofaringe foram coletados de crianÃas com atà sete dias de inÃcio dos sintomas de IRA e submetidos à reaÃÃo de imunofluorescÃncia indireta (IFI). Amostras coletadas em 2002, 2003 e 2004, armazenadas a â20ÂC, foram inoculadas em monocamadas de cÃlulas HEp-2. Nos 43 meses de estudo, o VSR foi identificado em 21,0% (409/1950) dos espÃcimes clÃnicos coletados. A circulaÃÃo do vÃrus foi inicialmente observada nos meses de janeiro ou fevereiro e os Ãltimos casos foram registrados em julho ou agosto de cada ano de estudo. O pico dessas infecÃÃes foi observado nos meses de marÃo a julho, sendo associado à estaÃÃo chuvosa da cidade. As infecÃÃes causadas pelo VSR foram mais freqÃentes em crianÃas de sexo masculino e naquelas com atà dois anos de idade. Bronquiolite e pneumonia foram as sÃndromes clÃnicas mais associadas ao vÃrus. DispnÃia, dor de garganta, coriza, espirros e cianose foram os sinais e sintomas clÃnicos associados significativamente nas IRAs causadas pelo VSR. Cerca de 9,5% (39/409) das crianÃas infectadas apresentaram problemas associados, como prematuridade, cardiopatia e doenÃas pulmonares congÃnitas. Entre os fatores de risco associados a essas infecÃÃes, destacou-se a exposiÃÃo à IRA no domicÃlio. Cepas de VSR A e B co-circularam nos perÃodos epidÃmicos analisados, sem uma predominÃncia significativa de qualquer grupo antigÃnico. Cerca de 29,8% (122/409) das amostras positivas para VSR, estocadas a â20ÂC, foram inoculadas em monocamadas de cÃlulas HEp-2. O percentual de isolamento variou de 0,0%, em amostras coletadas em 2002, a 36,8%, em 2004. Nossos resultados confirmam a importÃncia do VSR como agente etiolÃgico de IRAs, especialmente IVAI, em crianÃas jovens. A ocorrÃncia do VSR na cidade de Fortaleza mostrou um padrÃo sazonal regular associado Ãs chuvas. A conservaÃÃo de amostras a â20ÂC nÃo impossibilitou o isolamento em cultura de cÃlulas atà um ano apÃs seu congelamento. / Respiratory syncytial virus (RSV) is detached as an important pathogen of lower respiratory tract infections (LRTI) in children, mainly in the first year of life. This study had as purposes: to determine the prevalence of RSV in cases of acute respiratory infections (ARIs) in children served in Albert Sabin Children Hospital, in Fortaleza â CE, over the period of January 2001 to July 2004; describe the seasonality pattern of RSV circulation along the study period; observe characteristics clinical-epidemiological of these infections; characterize antigenically the circulating RSV in the epidemic period from 2003 to 2004 and determine the isolation rate of RSV in HEp-2 cells culture from samples collected in 2002, 2003, and 2004 and stored at â20ÂC. Aspirated from nasopharynx were collected from children with up to seven days from the beginning of ARIs symptoms and submitted to the reaction of indirect immunofluorescence (IIF). Samples collected in 2002, 2003, and 2004, and stored at â20ÂC, were inoculated in monolayers of HEp-2 cells. During the 43 months of study, RSV was identified in 21.0% (409/1950) of the clinical specimens collected. Virus circulation was initially observed during the months of January or February and the last cases were recorded in July or August of each year of study. The peak of these infections was observed from March to July, associated with the rainy season of the city. The infections caused by RSV were more frequent in male children and those with up to two years of age. Bronchiolitis and pneumonia were the clinical syndromes more associated with the virus. Dyspnea, throat pain, coryza, sneezes and cyanosis were the significant clinical signs and symptoms in ARIs caused by RSV. About 9.5 % (39/409) of the infected children presented problems associated, such as prematurity, heart diseases and congenital pulmonary diseases. Among the risk factors associated with these infections, was pointed out the exposure to ARIs in the domicile. Strains of RSV A and B co-circulated during the epidemical periods analyzed, without a significant predominance of any antigenical group. About 29.8 % (122/409) of the positive samples for RSV, stored at â20ÂC, were inoculated in monolayers of HEp-2 cells. The isolation percentage varied from 0.0 %, in samples collected in 2002, to 36.8 %, in 2004. Our results confirm the importance of the RSV as etiological agent of ARIs, especially LRTI, in young children. The occurrence of RSV in the city of Fortaleza showed a regular seasonal pattern associated with the rains. The conservation of samples at â20ÂC did not make impossible the isolation in cells culture up to one year after freezing.

O Vírus Respiratório Sincicial Humano, do inglês human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), é uma das maiores causas de doenças respiratórias agudas, principalmente em crianças e bebês entre seis meses e dois anos de idade. Não há drogas eficazes ou vacina aprovada até o momento para esse vírus, apesar das décadas de intensa pesquisa e grande quantidade de dados sobre ele acumulados. O genoma do hRSV codifica onze proteínas e a compreensão das interações entre essas proteínas virais e as proteínas do hospedeiro é essencial para que possíveis alvos terapêuticos contra o hRSV sejam identificados. No laboratório, anteriormente, foi dado enfoque às interações entre as proteínas celulares e as proteínas virais de matriz (M), nucleoproteína (N) e fosfoproteína (P). Neste trabalho, analisamos as interações da proteína viral M2-1 (cofator essencial para a transcrição) através da mesma estratégia utilizada naqueles experimentos, de fusão a FLAG (gerando FLAG-M2-1) e imunoprecipitação com anticorpos contra esse peptídeo. As proteínas co-imunoprecipitadas, identificadas por espectrometria de massas, foram: poly(A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), e Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 é capaz de integrar-se ao complexo chamado de semelhante a corpúsculos de inclusão (IB like, do inglês), formado por N e P, que é similar estruturalmente aos corpúsculos de inclusão encontrados em células infectadas (IBs). Essa propriedade foi usada para analisar que proteínas celulares seriam recrutadas para esse outro nível de organização dessas três proteínas virais, envolvidas na transcrição. O complexo FLAG-N/P/M2-1 co-imunoprecipitou as proteínas celulares: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 e 90), Npm (Nucleophosmin), que podemos agrupar como chaperonas; PABPC1, YBX1, YBX3, ligantes de RNA; e sub-unidade pICIn do metilossomo, associada a modificação pós-tradução. Detalhamos a análise para YBX3, obtendo evidências adicionais de sua interação com M2-1 em ensaios de complementação de proteína fragmentada (Split-NanoLuc), e de co-localização por imunofluorescência indireta. Finalmente, utilizamos a metodologia de expressão em bactérias para demonstrar a interação entre M2-1 e os domínios funcionais de PABPC1, porém esses ensaios não foram conclusivos. / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the leading causes of acute respiratory diseases, especially in children and infants between six months and two years of age. There is no effective drug or vaccine approved so far for this virus, despite decades of intensive research and large amount of data on it. The genome of hRSV encodes 11 proteins and the understanding of the interactions between these viral proteins and host proteins is essential to identify possible therapeutic targets against hRSV. In the lab, previously, was given focus to the interactions between cellular proteins and viral proteins matrix (M), nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P). In this paper, we analyze the viral M2-1 (cofactor essential for transcription) protein interactions through the same strategy used in those experiments: fusion with FLAG (generating FLAG-M2-1) and immunoprecipitation with antibodies against this peptide. The co-immunoprecipitated proteins, identified by mass spectrometry, were: Poly (A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), and Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 is able to integrate the complex called similar to inclusion bodies (IB like), formed by N and P, which is similar structurally to the inclusion bodies found in infected cells (IBs). This property has been used to analyze which cellular proteins would be recruited for this new level of organization of these three viral proteins involved in transcription. The cellular proteins co-immunoprecipitated with the complex FLAG-N/P/M2-1, were: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 and 90), Npm (Nucleophosmin), that we can group as chaperones; PABPC1, YBX1, YBX3, RNA ligands; and the methylosome sub-unit pICIn, post-translational modification-associated. We detailed the analysis for YBX3, obtaining additional evidence of its interaction with M2-1 in fragmented protein complementation tests (Split-NanoLuc), and co-localization by indirect immunofluorescence. Finally, we used the methodology of expression in bacteria to demonstrate the interaction between M2-1 and functional domains of PABPC1, but these tests were not conclusive.

Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-01-02T16:42:12Z No. of bitstreams: 1 Tese Lidiane.pdf: 1449534 bytes, checksum: 483272938ee77a60ad54caa8f898d243 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2018-01-24T12:15:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Lidiane.pdf: 1449534 bytes, checksum: 483272938ee77a60ad54caa8f898d243 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-24T12:17:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Lidiane.pdf: 1449534 bytes, checksum: 483272938ee77a60ad54caa8f898d243 (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Introduction: acute bronchiolitis (AB) is an inflammatory disease of the airways considered the most common pathology of the lower respiratory tract in childhood. Responsible for a large number of hospitalizations in infants is one of the leading respiratory diseases worldwide, raising the costs of health care in infants. According to epidemiological data, between 75,000 and 125,000 children are hospitalized in the United States each year with infections caused by respiratory syncytial virus (RSV), accounting for approximately 25% of pediatric pneumonia and up to 70% of hospitalizations for acute bronchiolitis. Children with deficiencies in cell-mediated immunity can develop more severe and prolonged infections. Activation of the mTOR, STAT-3 and STAT-6 signaling pathways have been identified as key regulators in different functions of the immune system. The aim of this study was to investigate the relationship between the gene expression of mTOR, STAT-3, STAT-6 and AB severity. Methods: it is a cohort study that included a group of infants less than 12 months old with AB admitted to a tertiary hospital in Porto Alegre, Brazil. Nasopharyngeal lavage was collected from all patients and stored in Trizol solution at -80?C at the Biomedical Research Institute (IPB) of PUCRS for subsequent extraction of RNA and cDNA synthesis. Specific primers were used to verify the relative expression of mTOR, STAT-3 and STAT-6 by means of real-time PCR. The results obtained were correlated with AB severity markers such as hospitalization time and wheezing time. Results: for the analysis of expression of the mTOR signaling protein and transcription factors STAT-3 and STAT-6, 23 patients hospitalized with AB were included. A general correlation was made between clinical markers (days of hospitalization and days of wheezing) and expression of signaling pathways. Data were stratified according to severity markers and showed a trend towards decreased mTOR expression in patients with a wheezing time equal to or greater than 5 days (r = -0.702 and p = 0.024). However, the STAT-3 and STAT-6 signaling pathways were not correlated with AB severity factors when applied in this group of patients. Conclusion: transcription factors are essential for generating effective immune responses. mTOR, STAT-3 and STAT-6 participate in the expression of a variety of genes in response to cellular stimuli and may play a key role in the manifestation of the disease. Our data demonstrate the decrease in mTOR expression, with improvement in clinical markers of severity, but other studies are needed to reinforce this finding. / Introdu??o: a bronquiolite aguda (BA) ? uma doen?a inflamat?ria das vias a?reas considerada a patologia mais comum do trato respirat?rio inferior na inf?ncia. Respons?vel por um grande n?mero de hospitaliza??es em lactentes ? uma das principais doen?as respirat?rias em todo o mundo, elevando os custos de cuidados de sa?de em lactentes. Segundo dados epidemiol?gicos, entre 75.000 e 125.000 crian?as s?o hospitalizadas nos Estados Unidos anualmente com infec??es causadas pelo v?rus sincicial respirat?rio (VSR), respondendo por aproximadamente 25% das pneumonias pedi?tricas e at? 70% das interna??es por bronquiolite aguda (BA). As crian?as com defici?ncia na imunidade mediada por c?lulas podem desenvolver infec??es mais graves e prolongadas. A ativa??o das vias de sinaliza??o mTOR, STAT-3 e STAT-6 t?m sido identificadas como reguladores-chave em diferentes fun??es do sistema imune. O objetivo deste estudo foi investigar a rela??o entre a express?o g?nica de mTOR, STAT-3, STAT-6 e a gravidade da BA. M?todos: trata-se de um estudo de coorte onde foi inclu?do um grupo de lactentes de idade inferior a 12 meses, com BA, internados em um hospital terci?rio de Porto Alegre, Brasil. Foi coletado lavado nasofar?ngeo de todos os pacientes e armazenados em solu??o de Trizol ? temperatura de -80?C no Instituto de Pesquisas Biom?dicas (IPB) da PUCRS para posterior extra??o de RNA e s?ntese de cDNA. Foram utilizados os iniciadores espec?ficos para verificar a express?o relativa de mTOR, STAT-3 e STAT-6 por meio de PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram correlacionados com marcadores de gravidade da BA como tempo de interna??o e tempo de sibil?ncia. Resultados: para a an?lise da express?o da prote?na de sinaliza??o mTOR e fatores de transcri??o STAT-3 e STAT-6, foram inclu?dos 23 pacientes hospitalizados com BA. Foi realizada uma correla??o geral entre os marcadores cl?nicos (dias de interna??o e dias de sibil?ncia) e a express?o das vias de sinaliza??o. Os dados foram estratificados de acordo com os marcadores de severidade e mostraram uma tend?ncia para a diminui??o da express?o de mTOR em pacientes com tempo de sibil?ncia igual ou superior a 5 dias (r = -0,702 e p = 0,024). No entanto, as vias de sinaliza??o STAT-3 e STAT-6 n?o foram correlacionadas com fatores de gravidade da BA quando aplicadas neste grupo de pacientes. Conclus?o: os fatores de transcri??o s?o essenciais para gerar respostas imunes eficazes. O mTOR, STAT-3 e STAT-6 participam na express?o de uma variedade de genes em resposta a est?mulos celulares e podem desempenhar um papel-chave na manifesta??o da doen?a. Nossos dados demonstram a diminui??o da express?o de mTOR, com melhora dos marcadores cl?nicos de gravidade, por?m outros estudos s?o necess?rios para refor?ar este achado.

Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-07-11T11:29:52Z No. of bitstreams: 1 Disserta??o Krist1107.pdf: 2340518 bytes, checksum: c4a07ad9b25622d62d44660937fb1ea0 (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-07-16T11:22:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Disserta??o Krist1107.pdf: 2340518 bytes, checksum: c4a07ad9b25622d62d44660937fb1ea0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-16T11:30:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta??o Krist1107.pdf: 2340518 bytes, checksum: c4a07ad9b25622d62d44660937fb1ea0 (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES

O vírus respiratório sincicial humano (HRSV) é um dos agentes patogênicos respiratórios de grande importância clínica, tendo em vista que acomete 64 milhões de crianças por ano em todo o mundo. A resposta imune do hospedeiro e a variabilidade genética do HRSV podem interferir na produção de uma vacina eficaz, tal como a presença de quasispecies na população viral. O objetivo deste trabalho foi detectar quasispecies em amostras de HRSV e verificar se soros obtidos da criança na fase convalescente da doença e de sua respectiva mãe selecionam estes mutantes. Uma alteração não sinonímia foi detectada no gene F em um dos clones seqüenciados, enquanto duas alterações sinonímias e duas não sinonímias foram encontradas no gene G do HRSV, sendo as últimas no mesmo nucleotídeo. Um dos clones pré-selecionados com soro humano apresentou a mesma alteração não-sinonímia, encontrada na ausência de anticorpos no gene G. Os resultados sugerem que diferentes sequencias virais presentes em menor quantidade na população podem ser selecionadas pelo sistema imunológico do hospedeiro. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is one of the most important clinical respiratory pathogens, since 64 millions children in the world are infected by this agent every year. Host immunity and viral genetic variability are important factors to a vaccine development, besides quasispecies presence in the viral population. In this work, HRSV quasispecies were detected in clinical samples in absence and presence of human polyclonal serum collected by children in the convalescent phase and mother serum. A non-synonymy variation was found in the F gene in antibodies absence. Four mutations were found at HRSV G2 in polyclonal serum absence. Two were synonymy and two were non-synonymy variation, the last in the same nucleotide. A non-synonymy mutation was found in the G2 region in presence of polyclonal serum collected from child convalescent phase. This alteration was the same of the observed in absence of polyclonal serum so it is possible that host antibodies can selected different viral minority sequences present in the population.