L'utilisation d'agents chimiothérapeu tiques est souvent limitée par leur toxicité sur les cellules non pertinentes. Pour remédier à ce problème, nous avons utilisé des drogues dirigées de façon spécifique vers la tumeur grâce à leur association à des anticorps monoclonaux qui reconnaissent spécifiquement la cellule-cible. Nous avons évalué l'efficacité de ce modèle avec deux drogues couramment utilisées en thérapie, la daunorubleine et le chlorambucil, couplées a des anticorps mono clonaux dirigés contre un antigène de surface des lymphocytes T, 1'antigène Thy-1.1. Ces anticorps ont été produits en ascite chez des souris nu/nu et CDF1. Ils ont ensuite été purifiés sur DEAE-Sepharose CL-6B et leur activité sur les cellules AKR-SL3 (Thy-1.1 positives) a été prouvée par immuno fluorescence et ELISA. Une fois les conjugués obtenus, nous avons mesuré leur activité pharmacologique par des tests d'inhibition de croissance cellulaire sur les cellules de leucémie de souris P388-D1 (Thy-1.1 -) et AKR-SL3. Les conjugués se sont révélés beaucoup plus actifs (pourcentage de survie plus faible) sur la lignée AKR-SL3 que sur les cellules P388-D1. On constate aussi une augmentation de la spécificité par rapport a la drogue 119re. Cependant lorsqu'on utilise des conjugués non pertinents (dirigés contre des cellules d’adénocarcinome de colon humain, LoVo) on trouve une activité similaire à celle des conjugués drogue-anti-Thy-1.1. On ne peut donc pas vraiment parler de spécificité du modèle d'immunochimiothérapie. Nous avons aussi étudié l'action combinée des deux drogues sur les deux lignées leucémiques et une lignée myélomateuse (SP2/0-Ag-14) selon une représentation graphique appelée isobologramme. Cette représentation permet d'évaluer si l'action des drogues est antagoniste, synergique ou tout simplement additive. Sur les cellules AKR-SL3 et SP2/O-Ag-14, elle s'est avérée additive ; par contre sur les cellules P388-D1 elle est synergique. / Montréal Trigonix inc. 2018

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La concentration des médicaments cationiques dans les compartiments acides de la cellule est bien connue. Nous avons tenté d'expliquer davantage certains aspects encore inconnus au sujet de cette réaction cellulaire. En premier lieu, nous avons étudié l'accumulation subcellulaire et in vivo d'un médicament cationique fluorescent, la quinacrine, dans un modèle murin. L'accumulation cellulaire de la quinacrine dans les fibroblastes dermiques de souris induisait une inhibition du flux autophagique, ainsi qu'une lysosomogénèse. L'administration de la quinacrine in vivo démontrait une distribution hétérogène et une augmentation autophagique et lysosomale dans les poumons. En deuxième lieu, l'effet cytostatique et cytotoxique d'une série de médicaments cationiques lysosomotropiques furent étudiés dans une série de lignées cellulaires. Une série de 6 triéthylamines substituées furent choisies afin d'étudier davantage l'effet cytostatique de l'ion trapping. L'accumulation du marqueur autophagique LC3 II, le marqueur apoptotique PARP1, la cytotoxicité, le cycle cellulaire et la fonction endocytose furent étudiés plus en détails dans la lignée tumorale U937. Chacun des médicaments cationiques démontrait un effet antiprolifératif significatif, mais aucun signe de cytotoxicité n'était observé à certains niveaux de concentrations. Un cotraitement avec les inhibiteurs de cholestérol, β-cyclodextrine et lovastatine, renversait partiellement l'effet antiprolifératif des amines. L'intensité de l'effet antiprolifératif induit par les médicaments cationiques est clairement prédite par leur puissance de l'inhibition du flux autophagique et par la liposolubilité. L'accumulation tissulaire de la quinacrine et l'effet cytostatique prédit par l'inhibition du flux autophagique et par la liposolubilité des amines substituées offre des possibilités d'application dans le domaine de l'oncologie et de la pharmacocinétique des nombreux médicaments concernés.

La biologie des sites de contact entre organelles est une nouvelle branche de la biologie cellulaire qui étudie comment les organelles coopèrent ensemble pour coordonner des activités cellulaires complexes. Le premier contact de ce type à être décrit de manière fonctionnelle est celui qui est formé par le réticulum endoplasmique lisse (RE) et la mitochondrie, la MAM (Mitochondria-Associated ER Membrane). La MAM coordonne en effet les échanges de phospholipides et de calcium entre ces deux organelles. Cependant, on ignore si les mitochondries peuvent également former des contacts fonctionnels avec d'autres types de RE. Pour combler ce manque de connaissances, j'ai contribué, dans ma thèse, à étudier pour la première fois l'organisation morphologique et la fonction du contact entre l'ER brut et les mitochondries. Grâce à l'utilisation de la microscopie électronique (EM) et de la tomographie 3D, j'ai contribué à découvrir l'existence d'un nouveau type d'ER brut, que nous avons appelé wrappER, qui enveloppe étroitement les mitochondries dans les hépatocytes hépatiques de la souris. Sa caractérisation biochimique a révélé la présence de protéines et de transcrits impliqués dans la biogenèse des lipoprotéines de très basse densité (VLDL). De plus, mes études ont permis d'établir que la protéine Rrbp1 sert à lier les deux organelles et de découvrir que sa dérégulation dans le foie de la souris est caractérisée par une augmentation de la distance entre la mitochondrie et le wrappER ainsi qu'une diminution du taux de sécrétion des VLDL. Sur la base de ces résultats, nous avons proposé que les contacts wrappER-mitochondrie participent à l'homéostasie des lipides en régulant le taux de sécrétion des VLDL. / The biology of inter-organelle contact sites is a new branch of cell biology that studies how organelles cooperate together to coordinate complex cellular activities. The first contact of this type to be functionally described was that that is formed by the smooth endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondrion, the MAM (Mitochondria-Associated ER Membrane). The MAM indeed coordinates phospholipid and calcium exchanges between these two organelles. However, whether mitochondria can also form functionally competent contacts with other types of ER remains unknown. To fill this gap of knowledge, in my thesis I contributed to investigate for the first time the morphological organization and the function of the contact between the rough-ER and the mitochondria. Through the use of electron microscopy (EM) and 3D tomography, I have contributed to discover the existence a new type of rough-ER, which we called wrappER, that closely wraps the mitochondria in the liver hepatocytes of the mouse. Its biochemical characterization revealed the presence of proteins and transcripts involved in the biogenesis of the very low-density lipoproteins (VLDL). Furthermore, my studies have helped establish that the Rrbp1 protein serves to tether between the two organelles and discovered that its down-regulation in the mouse liver is characterized by an increase in the distance between mitochondrion and wrappER as well as to a decrease in the secretion rate of VLDL. Based on these results, we have proposed that wrappER-mitochondrion contacts participate in lipid homeostasis by regulating the rate of VLDL secretion.

L'obésité et ses pathologies associées telles que la résistance à l'insuline, le diabète de type 2 et la stéatose hépatique non-alcoolique deviennent des enjeux de santé publique. Le foie est un organe majeur dans le contrôle de l'homéostasie du glucose corporel. À l'heure actuelle, les modèles de lignées cellulaires d'hépatome sont les principaux modèles d'étude in vitro disponibles pour approfondir la physiologie hépatique. Malheureusement, l'expression et les fonctions des protéines dans ces cellules diffèrent de la réalité in vivo. Les hépatocytes primaires représentent une plateforme attractive dans l'étude des maladies métaboliques car ils conservent la plupart des fonctions hépatiques in vivo. Une limitation fondamentale de la culture des hépatocytes primaires de souris correspond au déclin métabolique après leur isolement. En quelques jours, les cellules primaires se dédifférencient en une lignée cellulaire inférieure entraînant une perte des fonctions spécifiques et une modification de l'expression des gènes. Avec ce projet, nous avons étudié les hépatocytes primaires de souris en culture en présence de petites molécules modulant des voies spécifiques liées à la transition épithéliale à mésenchymateuse, un processus conduisant à la dédifférenciation dans les hépatocytes primaires isolés de souris. Nous avons constaté que des petits inhibiteurs chimiques du remodelage du cytosquelette préservaient partiellement l'expression de certains marqueurs hépatiques et épithéliaux tels que l'albumine, la Zonula-1 et l'occludine. De plus, nos résultats ont révélé que les hépatocytes primaires de souris en culture perdaient la réponse à l'insuline mais maintenaient la réponse au glucagon sur la gluconéogenèse bien que les valeurs soient beaucoup plus faibles après 7 jours de culture par rapport au jour 1. L'ensemble de nos résultats suggèrent que la réduction mécanique de la tension via l'inhibition du remodelage du cytosquelette pourrait être une voie à suivre pour générer un modèle in vitro fonctionnel d'hépatocytes primaires de souris à long-terme dans l'étude des maladies métaboliques. / Obesity and its related pathologies insulin resistance, type 2 Diabetes and non-alcoholic fatty liver disease are becoming one of the major health hazards of modern world. The liver is a major organ in the control of body glucose homeostasis. Nowadays, hepatoma cell lines are in vitro study models available to further study liver physiology. Unfortunately, protein expression and functions in these cells differ from the in vivo reality. Primary hepatocytes are an attractive platform in the study of metabolic diseases because they retain most in vivo hepatic functions. A fundamental limitation of the culture of primary mouse hepatocytes is the metabolic decline taking place after isolation in these cells. Within few days isolated primary cells dedifferentiate into an inferior cell lineage losing specific functions and changing gene expression. Here, we studied primary mouse hepatocytes in culture in the presence of small molecules that modulate specific pathways related to epithelial to mesenchymal transition, a process leading to dedifferentiation in isolated primary mouse hepatocytes. We found that small chemical inhibitors of cytoskeletal changes partially preserved the expression of some hepatic and epithelial markers such as albumin, Zonula-1 and occludin. Furthermore, our results revealed that primary mouse hepatocytes in culture lost the response to insulin but maintained the response to glucagon on gluconeogenesis although the values decreased after 7 days in culture compared to day 1. Taken together, our results suggest that reducing mechanical tension by inhibiting cytoskeletal remodeling could be a way to follow to generate a functional in vitro model of long-term primary mouse hepatocytes to study metabolic diseases.

La physiologie des épithéliums requiert la distribution asymétrique de nombreuses composantes cellulaires. Cette organisation structurale est nommée polarité épithéliale et se caractérise par la formation d'un domaine apical et un domaine basolatéral. La polarisation des cellules épithéliales dépend de la protéine Crumbs 3 (CRB3 chez la souris). Plus spécifiquement, cette protéine contribue à l'établissement du pôle apical et à la formation des jonctions serrées dans les cellules épithéliales en culture. De plus, la protéine CRB3 est capable de réprimer la croissance tumorale et la formation de métastases dans des modèles de xénogreffes. Toutefois, les mécanismes moléculaires agissant en aval de CRB3 sont méconnus et les fonctions physiologiques de CRB3 in vivo chez les mammifères sont peu caractérisées. Ainsi, l'objectif de mon projet était d'analyser le phénotype des souris invalidées pour Crb3 et de valider son rôle potentiel en tant que suppresseur de tumeurs. Nous avons généré des lignées de souris permettant le knockout conditionnel de Crb3. Comme première approche, nous avons invalidé le gène Crb3 dans tout l'organisme. Nous observons une létalité périnatale associée à une détresse respiratoire. Toutefois, les animaux Crb3-/- ne présentent pas de défaut macroscopique majeur. Une analyse plus détaillée révèle des anomalies de développement des alvéoles pulmonaires, la présence de kystes rénaux et la fusion des villosités intestinales. CRB3 est également essentielle pour maintenir l'identité de la membrane apicale dans les cellules épithéliales rénales et intestinales. Une perte de CRB3 cause également une forte augmentation des niveaux de β-caténine cytoplasmique dans l'épithélium intestinal. Cette protéine est un médiateur essentiel de la voie oncogénique Wnt. De plus, la mutation de Crb3 amplifie la croissance tumorale chez les souris ApcMin/+, qui développent de nombreux adénomes dus à la suractivation de la voie Wnt. Dans l'ensemble, nos résultats mettent en lumière l'importance de CRB3 dans l'homéostasie de l'épithélium pulmonaire, rénal et intestinal. De plus, nos données suggèrent que CRB3 pourrait agir en tant que suppresseur de tumeurs via son action sur la voie Wnt.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La Maladie d’Alzheimer est une maladie multifactorielle dont l’apparition peut être influencée par divers facteurs génétiques ou environnementaux, tels l’allèle ApoEɛ4, différents polymorphismes ainsi que le vieillissement ou la ménopause, par exemple. Depuis une dizaine d’années des études épidémiologiques ont mis en évidence l’existence d’une relation entre le statut métabolique des individus durant leur vie adulte et l’augmentation du risque de développer la MA à un âge plus avancé. Les travaux présentés dans cette thèse visent à étudier l’impact d’un régime riche en graisse, permettant le développement d’une obésité, sur le développement physiopathologique d’un modèle transgénique mimant le versant Tau de la MA, la souris THY-Tau22. Cette souris surexprime dans les neurones du cerveau la protéine Tau humaine mutée en 2 sites favorisant sa phosphorylation et son agrégation et présente une pathologie Tau hippocampique évolutive qui s'exprime en parallèle d'altérations mnésiques. Ainsi, ce modèle murin constitue un modèle particulièrement adapté à l'étude des conséquences comportementales, anatomo-pathologiques, biochimiques et transcriptomiques de la tauopathie de la MA. L'induction d'une obésité et de ses conséquences métaboliques chez la souris THY-Tau22 de 7 mois a engendré une diminution des performances d'apprentissage accompagnée d'une aggravation de la pathologie Tau hippocampique. De façon intéressante, ces modifications pathologiques ont eu lieu en parallèle du maintien d'une bonne sensibilité à l'insuline périphérique et en présence d'une activation de la voie de signalisation du récepteur à l'insuline dans l'hippocampe. Ces données remettent en cause le dogme établit dans la littérature, et suggèrent que les conséquences délétères d'une obésité sur Tau dans la MA peuvent être dissociées d'une résistance à l'insuline périphérique et centrale. Sur le plan métabolique, lorsque nourries par un régime obésifiant, les souris THY-Tau22 de 7 mois présentent au contraire de leurs contrôles de portées wild-type une homéostasie glucidique peu détériorée. Afin de contrôler la véracité de ce phénotype nous avons entrepris la caractérisation métabolique de la lignée de souris THY-Tau22 via une étude longitudinale de 2 à 9 mois. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence le caractère plus maigre de la souris THY-Tau22 comparé aux WT avec des différences de paramètres métaboliques qui s'accentuent au cours de la vie de la souris THY-Tau22. Afin de décrypter si cette particularité métabolique est le fruit du gain de fonction lié à la surexpression de la protéine Tau dans le cerveau de cette souris, un suivi longitudinal identique a été réalisé chez la souris Knock-out pour le gène Tau (KO-Tau). Les résultats indiquent que la souris KO-Tau présente un phénotype métabolique inverse à celui de la souris THY-Tau22, avec poids corporel augmenté et homéostasie glucidique altérée, suggérant que Tau puisse posséder un rôle dans l'homéostasie métabolique. En conclusion l’ensemble des résultats de cette thèse suggère par conséquent qu'une obésité provoque l'aggravation de la pathologie Tau de la MA, et ce, en l'absence d'une résistance à l'insuline. De plus, nous révélons l'existence d'une potentielle fonction inédite de la protéine Tau dont l'action au niveau central aurait des conséquences métaboliques périphériques. / Alzheimer's disease (AD) is a multifactorial disease that can be influenced by several genetic or environnemental factors, such as ApoEɛ4 allele, genetic polymorphisms and ageing and menopause, for instance. Since a decade epidemiological studies have pointed out the existence of a relationship between the metabolic status of individuals during their adult's life and an increased risk of developing AD at an advanced age. Indeed, type 2 diabetes doubles the risk to have AD. Mid-life overweight and obesity are also important risk factors for the development of AD. The work presented in this thesis aim at studying the impact of an obesity induced by a high-fat diet on physiopathological development of a transgenic mouse model reproducing AD-like Tau pathology, the THY-Tau22 mouse. This mouse overexpresses in the neurons a human Tau protein, mutated on two sites favoring its phosphorylation and aggregation and exhibits a progressive hippocampal Tau pathology in parallel with learning and memory impairment. This mouse model therefore constitutes an appropriate model to study the behavioral, anatomo-pathologic, biochemical and transcriptomic consequences of AD-like Tauopathy. Diet induced obesity and its metabolic disturbances in 7 months THY-Tau22 mice impaired learning and induced an aggravation of hippocampal Tau pathology. Interestingly, this pathological worsening occurred in parallel with healthy peripheral insulin sensitivity and activation of central insulin signaling. These data question the current dogma of the literature and suggest that deleterious consequences of obesity on Tau pathology could happen dissociated from peripheral and central insulin signaling. On the metabolic point of view, when fed high-fat, 7 months THY-Tau22 mice present, on the contrary of their littermate controls, a relative healthy glucose homeostasis. To control this phenotype we undertook the characterization of THY-Tau22 mice with a longitudinal study from 2 to 9 months. This characterization led us to underscore the leaner phenotype of THY-Tau22 compared to their WT counterparts, with increasing differences in metabolic parameters over age. In order to decipher if this metabolic feature is due to a gain of function induced by the neuronal overexpression of Tau we realized the same phenotyping on a Tau knock-out mouse (KO-Tau). The results indicate that, in contrary to THY-Tau22 mice, KO-Tau mice present a mirrored metabolic phenotype with higher body weight and impaired glucose homeostasis, suggesting a possible role for Tau in metabolic homeostasis. In conclusion, all the data presented in this thesis therefore suggest that obesity induces a worsening of AD-like Tau pathology that occurs dissociated from insulin resistance. Moreover, our study reveals the existence of a potential unpublished function of Tau protein whose action at central level could have peripheral metabolic consequences.

Reproduction de : Thèse d' exercice : Médecine spécialisée : Nancy 1 : 2002. / Thèse : 2002NAN11095. Titre provenant de l'écran-titre.

La thérapie génique utilisant les vecteurs viraux est une des approches thérapeutiques possible pour le développement d’une thérapie pour les maladies génétiques mono-géniques dont l’ataxie de Friedreich (FRDA). Dans le but de vérifier l’efficacité des virus adéno-associés (AAV) à transférer la copie normale du transgène dans les tissus qu’ils infectent, nous avons insérer le gène codant pour la forme améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP) dans les AAV sérotype 9 (AAV9). Ces AAV recombinants (AAVr) ont été ensuite administrés aux souris femelles gestantes par voie intraveineuse et intra-péritonéale. Les résultats obtenus montrent que le transgène a été transféré à la fois dans les tissus des souris femelles ainsi que dans ceux des souriceaux. / Gene therapy using viral vectors is one of the therapeutic approaches possible for the development of genetic therapies for monogenic diseases including Friedriech's Ataxia (FRDA). In order to verify the effectiveness of adeno-associated virus (AAV) to transfer a transgene in the tissues they infect, we inserted the gene encoding the enhanced form of the green fluorescent protein (eGFP) in AAV Serotype 9 (AAV9). These recombinant AAV (rAAV) were then administered by intravenous and intraperitoneal to pregnant female mice. The results obtained show that the transgene was transferred in both in the female’ mouse tissues and in those of young mice.