Les virus herpétiques sont des pathogènes ubiquitaires caractérisés, entre autres, par la persistance de leur génome au sein de l'hôte. Parmi ceux-ci, le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à la mononucléose infectieuse, au carcinome du nasopharynx et au lymphome de Burkitt. L'homologie génomique qui existe entre certains virus herpétiques, principalement entre le gammaherpèsvirus murin 68 (MHV-68) et EBV, est établie depuis plusieurs années. Cette homologie est d'autant plus importante que ces virus sont reconnus par le système immunitaire de manière similaire chez leurs hôtes respectifs. Ce système se décline en deux volets complémentaires, soit l'immunité innée et l'immunité acquise. Les "Toll-like receptors" (TLRs) composent l'une des principales familles de récepteurs impliquées dans l'immunité innée. C'est donc sur cet aspect que le projet s'est concentré, et plus précisément sur l'activation du récepteur membranaire TLR2 par le virus MHV-68. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'activation du TLR2 par MHV-68 mène à une augmentation de l'activité NF-KB. À l'aide de cellules fibroblastiques embryonnaires (MEFs) provenant de souris C57BL6 TLR2⁻/⁻ ou MyD88⁻/⁻, nous avons prouvé que la synthèse d'IL-6 et d'IFN-α induit par MHV-68 est partiellement dépendante du TLR2 et entièrement dépendante de MyD88. L'induction du gène TLR2 par MHV-68 a pu être établie in vivo à l'aide de souris transgéniques exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur du TLR2. L'utilisation de MHV-68 irradiée aux UV a donné des résultats similaires suggérant que la transcription génique et la replication virale ne sont pas essentielles à l'activation ni à l'induction du TLR2. Nous avons par la suite mis en évidence par cytometric de flux que le TLR2 était induit à la suite d'une infection par MHV-68 chez les granulocytes, les monocytes circulants et les monocytes inflammatoires recrutés au poumon. Nous avons finalement observé une diminution de la sécrétion d'IFN-α, d'IFN-β et d'IL-6 dans les poumons et la rate des souris TLR2⁻/⁻ et MyD88⁻/⁻ infectées, comparativement aux témoins (WT), et ce, de façon concomitante avec une augmentation de la charge virale. 11 s'agit de la première étude qui prouve que le virus MHV-68 est reconnu par le récepteur membranaire TLR2 murin.

La cardiomyopathie dilatée est une pathologie affectant la structure du myocarde menant, à terme, à une défaillance cardiaque. Elle constitue la troisième cause la plus importante de défaillance cardiaque. De nombreuses pathologies cardiaques, dont la cardiomyopathie dilatée, résultent de mutations sur le canal sodique voltage-dépendant Nav1.5, responsable de la phase de dépolarisation des potentiels d’action et donc de la contraction. La mutation R219H, sur ce canal, engendre un courant de protons en phase d’hyperpolarisation nommé « courant oméga ». Celui-ci provoquerait une augmentation de la concentration intracellulaire en sodium et en calcium via l’échangeur sodium-calcium à l’origine du remodelage du myocarde dans la cardiomyopathie dilatée. Objectif : La mutation R219H fut détectée chez un patient souffrant de cardiomyopathie dilatée et d’arythmie. Les travaux présentés dans ce mémoire consistèrent à déterminer si le modèle de souris R219H présentait un phénotype cardiaque similaire. Méthode : Une évaluation structurelle des coeurs a été effectuée au moyen de coupes histologiques. La technique de patch clamp servit à caractériser la biophysique de Nav1.5 et à enregistrer le courant oméga. Résultats : Les coupes histologiques permirent de mettre en évidence des dysfonctions structurelles chez les souris hétérozygotes et homozygotes ainsi qu’une désorganisation importante de la structure cellulaire. Les enregistrements d’électrophysiologie montrèrent une activation du canal plus précoce chez les souris hétérozygotes et homozygotes. Une diminution de l’amplitude des potentiels d’action et de la vitesse de conduction fut aussi observée. La présence d’un courant oméga chez les souris portant la mutation fut également confirmée. Les résultats obtenus semblent indiquer que la mutation R219H soit à l’origine du développement de la pathologie, bien que le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à déterminer. / Dilated cardiomyopathy is a structural cardiac disorder leading to heart failure. It is the third most common cause of heart failure. Several cardiac pathologies, including dilated cardiomyopathy, result from mutations on the gene encoding the voltage-dependent sodium channel Nav1.5 which is responsible for the upstroke of the action potential and therefore for contraction. The mutation R219H on this channel drives a gating pore current of protons in hyperpolarizing condition called “omega current”. This current ought to induce a rise of the intracellular concentration of sodium and calcium through the sodium-calcium exchanger that might cause the structural remodelling developing in dilated cardiomyopathy. Objective: The mutation R219H has been identified in a patient with a mixed dilated cardiomyopathy and arrhythmia phenotype. In the present study, investigation of heart phenotype and electrophysiology of transgenic R219H mice model was conducted. Method: Histological analysis was used to examine cell structure and tissues. The biophysical properties of the Nav1.5 channel were characterized by means of the patch clamp technique. Results: Histological analysis disclosed structural dysfunctions and loss of structural organization in myocardial cells in both heterozygous and homozygous mice. Finally, a shift of activation in heterozygous and homozygous mice were observed in electrophysiological recordings. A decline of action potential amplitude and conduction velocity was also observed in homozygous mice. The presence of the omega current was confirmed in mice carrying the mutation. Those results suggest that R219H could cause the pathology even if the precise molecular mechanism is not unravelled yet.

La stimulation cérébrale profonde (SCP) est une procédure chirurgicale utilisée dans le traitement de divers contextes pathologiques. Ce système, composé d’électrodes implantées dans une région cible du cerveau et d’un neurostimulateur reliés par un fil, permet de délivrer un courant électrique dans une région voulue du cerveau. À ce jour, les mécanismes d’action de la SCP et les effets cellulaires qu’elle engendre demeurent mal connus. Cette problématique découle du fait qu’il existe peu de prototypes de micro-stimulation dans le domaine de la recherche, sans compter que ceux-ci ne répondent pas bien aux critères de cette recherche. Mes travaux de maîtrise visaient donc à développer un système de microstimulation pouvant être utilisé chez la souris et de développer et valider toutes les techniques nécessaires à l’implantation de ce système chez la souris. Au terme de ces travaux, nous avons développé un système de micro-stimulation : 1) utilisable chez la souris 2) pour des protocoles de stimulation chronique de longue durée (jusqu’à 1 mois), 3) possédant des paramètres électriques, semblables à ceux utilisés chez l’humain en clinique, 4) pouvant être ajustés à différents contextes pathologiques. Nous avons aussi développé toutes les techniques nécessaires à son implantation chez la souris. Cet outil novateur permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes d’action et des mécanismes cellulaires sous-jacents aux effets de la SCP et pourra mener, à long terme, à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Deep brain stimulation (DBS) is a surgical procedure used in the treatment of various pathologies. This system, composed of electrodes implanted in a target area in the brain and of a neurostimulator connected by a wire, allows the delivery of an electrical current in a specific area in the brain. To this day, mechanisms of action and cellular effects resulting from DBS remain poorly understood because of a lack of micro-stimulation tools available in the domain and by the fact that these tools do not properly address requirements of this research. To address this challenge, the objectives of my master’s research were to develop a micro-stimulation system usable in mice and to develop and validate required techniques to make this system work in small-sized rodents. Through this study, we have developed a micro-stimulation system that is : 1) usable in mice, 2) able to sustain a long term chronic stimulation (up to 1 month), 3) similar to those used in human in terms of electrical parameters and 4) offering the possibility of adjusting those parameters to various pathological contexts. We also developed the required techniques for its use in mice. This novel tool will allow to deepen our knowledge on the mechanisms of action and cellular mechanisms underlying DBS effects and possibly lead to the identification of new therapeutic targets.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 avril 2024) / 8 vidéos en format .avi . Supplementary video file 1 and 2 represents mitochondrial time-lapse recording of Wt and Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 3 and 4 represents lysosomal time-lapse recording of Wt and Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 5 and 6 represents mitochondrial timelapse recording of vehicle (DMSO) and TubA (1μM) treated Gan-/- DRG neurons. Supplementary video file 7 and 8 represent lysosomes time-lapse recording of vehicle (DMSO) and TubA (1μM) treated Gan-/- DRG neurons. / La neuropathie axonale géante (GAN) est une maladie neurodégénérative autosomique récessive mortelle. Les phénotypes d'apparition de la GAN sont des déficits des voies sensorielles et motrices qui évoluent vers l'aréflexie, la perte de la sensibilité profonde et superficielle, l'altération de la démarche, la perte de déplacement autonome et la mort dans les 10 à 30 ans. La gigaxonine est un adaptateur spécifique de substrat des protéines de la famille Cul3-E3 ligase qui favorise la dégradation des protéines du cytosquelette par médiation protéasomale, notamment des protéines de la famille des filaments intermédiaires (IFs). La perte de fonction de la protéine gigaxonine entraîne l'agrégation des protéines des neurofilaments (NFs) dans le système nerveux central (SNC) et le système nerveux périphérique (SNP). La biopsie du nerf sural de patients atteints de GAN a révélé une accumulation massive de IFs provoquant un gonflement des axones, une caractéristique typique de la maladie de GAN. Des fibroblastes humains et des motoneurones iPSc cultivés in vitro ont présenté une accumulation importante de IFs en l'absence de gigaxonine. En outre, les souris knock-out à la gigaxonine présentaient des niveaux accrus de protéines NFs dans le cerveau, la moelle épinière et le nerf sciatique entre l'âge de 3 et 18 mois. Malgré l'accumulation de NFs, ces souris n'ont pas développé de phénotypes typiques de la maladie de la GAN. De plus, les axones géants étaient absents chez ces animaux. Il est bien établi que les NFs jouent un rôle important dans le SNC et le SNP en maintenant le cytosquelette neuronal, la régulation synaptique et le transport axonal. Cependant, nous ne savons toujours pas dans quelle mesure les accumulations de NFs contribuent à la maladie de la GAN. Des études antérieures ont révélé que la formation d'accumulations de NF est parfois associée à un transport axonal défectueux. Dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth, il a été constaté que les mutations du gène *NEFL* encodant la sous-unité légère des neurofilaments (Nefl) provoquaient des accumulations de NFs et des défauts dans le transport axonal. En outre, la cultivation des neurones présentant des NFs désorganisés en raison de la surexpression du gène *PRPH* encodant la périphérine (Prph) dans des cellules portant un knock-out du gène Nefl ont présenté un transport axonal des organelles aberrant. Dans cette étude, nous avons généré une souris double transgénique de la maladie de GAN qui est basée sur le croisement de souris transgéniques surexprimant la périphérine (souris TgPer) dans un contexte de portant un knock-out du gène encodant gigaxonine (GanGan$^\textup{-/-}$). Les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer obtenues développent à un jeune âge des accumulations de IFs composées des protéines NFs et Prph provoquant le gonflement des motoneurones. En outre, les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer présentent des déficits cognitifs et moteurs à l'âge de 12 mois. La microscopie a révélé une perte substantielle du calibre des neurones et des axones chez ces souris. De manière intéressante, des axones géants (≥160µm²) remplis de IF désorganisés ont également été trouvés chez ces souris, une caractéristique typique de la maladie de le GAN. En outre, nous avons également examiné les effets de l'agrégation des NF sur le transport axonal. L'imagerie de cultures de neurones des ganglions spinaux (neurones DRG) GanGan$^\textup{-/-}$ a montré un transport axonal défectueux des mitochondries et des lysosomes. De plus, le traitement avec la Tubastatine A (TubA) a augmenté les niveaux de tubuline acétylée et a restauré le transport axonal normal des mitochondries et des lysosomes dans ces neurones DRG en culture. Nous avons également testé l'effet du médicament TubA chez les souris GanGan$^\textup{-/-}$ ;TgPer. À l'âge de 12 mois, le traitement au TubA des souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer pendant quelques semaines a entraîné une légère amélioration de la fonction motrice, et en particulier une amélioration significative de la démarche. En conclusion, nous avons réussi à générer un modèle murin de la maladie de la GAN présentant une désorganisation des NF, des déficits cognitifs et un dysfonctionnement moteur. De plus, nous avons montré que la déficience en gigaxonine entraîne une désorganisation des NF ainsi qu'une altération du transport axonal antérograde des organelles. Les souris GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer devraient être utiles pour étudier les changements pathogéniques associés à la maladie de la GAN et pour tester des médicaments potentiels. / Giant axonal neuropathy (GAN) is a fatal autosomal recessive neurodegenerative disease. Onset phenotypes of GAN are sensory and motor tract deficits which progress into areflexia, loss of deep and superficial sensitivity, gait impairment, loss of ambulance, and death occurs within 10-30 years of the phenotypic onset. Gigaxonin is a substrate-specific adaptor of the Cul3-E3 ligase family proteins that promotes proteasomal-mediated-degradation of cytoskeletal proteins including intermediate filament (IF) family proteins. Loss of function in gigaxonin protein causes the aggregation of neurofilament (NF) proteins in the central nervous system (CNS) and in the peripheral nervous system (PNS). Sural nerve biopsy of GAN patients revealed massive accumulation of IFs causing swelling of axons, a typical characteristic of GAN disease. *In vitro* cultured human fibroblasts and iPSc motor neurons exhibit severe accumulation of IFs in absence of gigaxonin. Further, gigaxonin knockout mice shows increased levels of NF proteins in brain, spinal cord, and sciatic nerve from the age 3 to 18 months. Despite NF accumulations these mice did not develop overt phenotypes of GAN disease. Moreover, giant axons were absent in these animals. It is well established that NFs play an important role in CNS and PNS in maintaining the neuronal cytoskeletal, synaptic regulation, and axonal transport. Yet, it remains unknown to what extent NF accumulations contribute to the GAN disease. Past studies revealed that the formation of NF accumulations is sometimes associated with defective axonal transport. In Charcot-Marie-Tooth disease mutations in the neurofilament, *NEFL* gene were found to cause accumulations of NFs and defects in axonal transport. In addition, cultured neurons with disorganized NFs due to overexpression of *PRPH* gene in the context of *NEFL* knockout exhibited aberrant axonal transport of organelles. In the present study, we have generated a double transgenic mouse model of GAN disease which is based on the crossing of transgenic mice overexpressing peripherin protein (TgPer) in context of gigaxonin knockout (GanGan$^\textup{-/-}$). The resulting GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice at a young age develop IF accumulations made up of NF and Prph proteins causing the swelling of the spinal neurons. In addition, GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice exhibited cognitive and sensory-motor deficits at 12 months of age. Microscopy has revealed substantial neuronal and axon caliber loss in these mice. Interestingly, giant axons (≥160µm²) were also found in these mice filled with disorganized IF, a typical characteristic of GAN disease. In addition, we have also examined the effects of NF aggregation on axonal transport. Live cell imaging has shown defective axonal transport of mitochondria and lysosomes in GanGan$^\textup{-/-}$ cultured DRG neurons. Further, the treatment with Tubastatin A (TubA) increased the levels of acetylated tubulin and restored normal axonal transport of mitochondria and lysosomes in these cultured DRG neurons. Furthermore, we also tested the effect of the TubA drug in GanGan$^\textup{-/-}$ ;TgPer mice. At 12 months of age, TubA treatment of GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice for a few weeks led to a slight amelioration of motor function, and a significant improvement in gait. In conclusion, we have successfully generated a mouse model of GAN disease exhibiting NF disorganization, cognitive deficits, and sensory-motor dysfunction. Furthermore, we have shown that gigaxonin deficiency causes NF disorganization as well as impairment of anterograde axonal transport of organelles The GanGan$^\textup{-/-}$;TgPer mice should be useful to investigate the pathogenic changes associated with GAN disease and for testing potential drugs.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 145-151. Publié aussi en version électronique.

Le mercure est une toxine environnementale pouvant produire des déficits neurologiques marqués incluant des handicaps neurotoxiques et comportementaux chez les organismes exposés. La présente étude se propose d'étudier chez la souris les effets moteurs, cognitifs et comportementaux d'une exposition prénatale au mercure méthylé (MeHg). Des souris femelles exposées prénatalement au MeHg (jours 12 à 14 de la gestation) sont soumises à des épreuves faisant appel à un apprentissage moteur, à un apprentissage d'alternance spatiale suivi d'un test avec délais, aux qualités exploratoires spontanées, à la discrimination visuelle et à la mémoire de référence et de travail. Bien que l'exposition prénatale n'exerce aucun effet significatif sur la motricité et sur les habiletés visuelles, elle retarde l'apprentissage de l'alternance spatiale et entraîne une diminution de l'exploration qui explique probablement la faible performance à la tâche de mémoire (labyrinthe radial). Ces résultats indiquent qu'une intoxication prénatale au MeHg, même relativement faible, a des effets durables sur le développement neurocomportemental.

Une sélection artificielle pour augmenter le comportement de course volontaire chez la souris, Mus domesticus, a généré des lignées montrant une augmentation d'ordre 3 du nombre de tours effectués dans la roue d'entraînement. Un phénotype inhabituel appelé « mini-muscle » (petits muscles, distribution des fibres désorganisées, augmentation du niveau des enzymes mitochondriales) est apparu dans certaines des lignées sélectionnées. La présente étude examine si un changement dans les types de fibres musculaires pourrait être en cause. En fait, l'électrophorèse des chaînes lourdes de myosine et l'histochimie montrent que les lignées sélectionnées et contrôles possèdent les mêmes types de fibres dans le muscle tibialis, alors que chez les « mini-muscles », il manque les fibres de type IIB et les chaînes lourdes de myosines correspondantes. Les « mini-muscles » montrent également une augmentation de l'activité de l'hexokinase et de la citrate synthase comparativement aux muscles de taille normale. / Une sélection artificielle pour augmenter le comportement de course volontaire chez la souris, Mus domesticus, a généré des lignées montrant une augmentation d'ordre 3 du nombre de tours effectués dans la roue d'entraînement. Un phénotype inhabituel appelé « mini-muscle » (petits muscles, distribution des fibres désorganisées, augmentation du niveau des enzymes mitochondriales) est apparu dans certaines des lignées sélectionnées. La présente étude examine si un changement dans les types de fibres musculaires pourrait être en cause. En fait, l'électrophorèse des chaînes lourdes de myosine et l'histochimie montrent que les lignées sélectionnées et contrôles possèdent les mêmes types de fibres dans le muscle tibialis, alors que chez les « mini-muscles », il manque les fibres de type IIB et les chaînes lourdes de myosines correspondantes. Les « mini-muscles » montrent également une augmentation de l'activité de l'hexokinase et de la citrate synthase comparativement aux muscles de taille normale. / Artificial selection of mice, Mus domesticus, for voluntary wheel running has generated lines that show a threefold increase in wheel running. An unusual « mini-muscle » phenotype (small muscles, disorganised fibre distribution, increased mitochondrial enzyme levels) has appeared in certain selected lines. This study examined whether changes in muscle fibre types could explain these modifications. Although selected and control lines did not differ in fibre types present in the tibialis, as assessed by electrophoresis of myosin heavy chains and by histochemistry, «mini-muscles» lack type IIB fibres and the corresponding myosin heavy chains. The mini-muscles show also increased activities of hexokinase and citrate synthase compared to the normally sized muscles. / Artificial selection of mice, Mus domesticus, for voluntary wheel running has generated lines that show a threefold increase in wheel running. An unusual « mini-muscle » phenotype (small muscles, disorganised fibre distribution, increased mitochondrial enzyme levels) has appeared in certain selected lines. This study examined whether changes in muscle fibre types could explain these modifications. Although selected and control lines did not differ in fibre types present in the tibialis, as assessed by electrophoresis of myosin heavy chains and by histochemistry, «mini-muscles» lack type IIB fibres and the corresponding myosin heavy chains. The mini-muscles show also increased activities of hexokinase and citrate synthase compared to the normally sized muscles.

Des travaux antérieurs ont montré qu'une exposition prénatale au mercure méthylé (MeHg) à forte dose peut provoquer l'apparition de symptômes moteurs et sensoriels graves. À des doses plus modérées, des études ont mis en évidence des symptômes sous-cliniques comportementaux et mnésiques qui constitueraient vraisemblablement les premiers signes d'une intoxication au McHg. Cette étude vise à identifier chez la souris, modèle animal de l'intoxication humaine, des déficits comportementaux et mnésiques causés par une exposition aiguë au McHg pendant les jours 7 à 9 de la gestation en tenant compte des effets moteurs et sensoriels potentiels d'une telle exposition. Les résultats montrent un déficit de persévération chez les souris traitées, mais aucune autre modification des fonctions cognitives. Une exposition aiguë au McHg pendant les jours 7 à 9 de la gestation serait davantage propice à l'apparition de symptômes sous-cliniques comportementaux que de problèmes mnésiques majeurs.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Parmi les contaminants environnementaux reconnus pour leur toxicité et leur propagation à travers le monde, les métaux lourds sont certainement d'une première préoccupation. Des études démontrent que les métaux lourds peuvent altérer différents systèmes dont le système immunitaire. Ils peuvent induire des effets immunomodulateurs qui pourront avoir comme conséquences, l'augmentation de la susceptibilité à des agents infectieux, l'apparition de maladies néoplasiques et de maladies auto-immunes. Afin de se protéger de cette agression, les cellules immunitaires induisent des thiols (cystéines, glutathion, métalloprotéines) qui sont des molécules capables de neutraliser les métaux en s'y liant et ainsi protéger l'organisme des effets néfastes. La pré-activation de ces cellules augmenterait leur contenu intracellulaire en thiols et les rendrait donc plus résistantes à l'effet néfaste des métaux lourds. Dans cette étude, nous avons voulu démontrer, l'effet de la pré-activation des lymphocytes avec la concanavaline A sur la toxicité de certains métaux lourds tels que le mercure (organique et inorganique), le cadmium, le zinc et le sélénium. Nous avons mesuré la prolifération Iymphoblastique, la viabilité, l'apoptose ainsi que le niveau de thiols intracellulaires dans ces cellules pré-activées ou non pré-activées. Pour la prolifération lymphoblastique, les cellules pré-activées ont été significativement plus résistantes que les cellules au repos pour les deux formes de mercure, le cadmium et le zinc. Le niveau de thiols a été significativement augmenté chez les lymphocytes pré-activés de même que la viabilité, alors que l'apoptose a été augmentée dans les lymphocytes pré-activés par rapport à leur contrôle respectif en présence de mercure inorganique, de zinc et de sélénium. Les résultats suggèrent que la pré-activation des lymphocytes entraîne une augmentation du niveau de thiols intracellulaires leur procurant une meilleure protection contre l'effet néfaste des métaux lourds.