Universiẗat, Diss., 2004--München.

The aim of this review is to discuss current findings regarding the roles of miRNAs in periodontal diseases and the potential use of saliva as a diagnostic medium for corresponding miRNA investigations. For periodontal disease, investigations have been restricted to tissue samples and five miRNAs, that is, miR-142-3p, miR-146a, miR-155, miR-203, and miR-223, were repeatedly validated in vivo and in vitro by different validation methods. Particularly noticeable are the small sample sizes, different internal controls, and different case definitions of periodontitis in in vivo studies. Beside of that, the validated miRNAs are associated with inflammation and therefore with various diseases. Furthermore, several studies successfully explored the use of salivary miRNA species for the diagnosis of oral cancer. Different cancer types were investigated and heterogeneous methodology was used; moreover, no overlap of resultswas found. In conclusion, fivemiRNAs have consistently been reported for periodontitis; however, their disease specificity, detectability, and expression in saliva and their importance as noninvasive markers are questionable. In principle, a salivary miRNA diagnostic method seems feasible.However, standardized criteria and protocols for preanalytics, measurements, and analysis should be established to obtain comparable results across different studies.

Das Phänomen „dentale Erosionen an Zahnhartsubstanz“ als Folge des erhöhten Konsums von sauren Getränken stand im Mittelpunkt der vorliegenden in-vitro Studie. Das Ziel war, den remineralisierenden Einfluss einer neuartigen calciumhaltigen Salzhydratschmelze auf das erosive Potential handelsüblicher säurehaltigen Getränke wie Coca Cola, Orangensaft, Eistee u. a. zu untersuchen. Unterschiedliche Konzentrationen dieser calciumreichen Salzhydratschmelze (SHS) wurden den Testgetränken in Pulverform beigemischt. Die Experimente wurden an künstlich hergestellten, porösen Hydroxylapatitkörpern durchgeführt, die in ihren wesentlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften dem Zahnschmelz weitgehend entsprachen. Die Veränderungen des Mineralgehaltes der Probekörper während der Exposition von sauren Flüssigkeiten wurden sowohl gravimetrisch als auch mit Hilfe einer hochauflösenden Online-Radiographie mit hoher Genauigkeit reproduzierbar gemessen. Aus den Ergebnissen konnte die Schlussfolgerung gezogen werden, dass es möglich ist, mit Hilfe der getesteten Salzhydratschmelze erosive Getränke so zu modifizieren, dass ihre demineralisierenden Wirkung auf Hydroxylapatit nicht nur gestoppt, sondern im Sinne einer Remineralisation umgekehrt wird. Es wurde stets eine reproduzierbare Mineraleinlagerung bei den Testgetränken beobachtet. Dieser Effekt beruhte auf dem Prinzip der forcierten dynamischen Remineralisation. Mit Hilfe der Salzhydratschmelze scheint es somit zumindest in-vitro möglich zu sein, die durch saure Getränke verursachten dentalen Erosionen zu vermeiden. / The phenomenon „dental erosion of the tooth’s hard tissue" as a result of higher consumption of acidic drinks stood as a central point in the current study in an artificial environment. The aim was to research the remineralization effect of a new type of calcium containing salthydratic melt (SHS) on the erosive potential of commercially traded common drinks such as Coca-Cola, orange juice, ice tea and others. Different concentrations of the calcium rich salthydratic melt were mixed with the tested drinks in powder form. The experiments were conducted on artificially created porous hydroxyapatite experimental bodies, the physical and chemical properties of which corresponded to a large extent to tooth enamel. The changes in the mineral content of the experimental bodies were measured with high precision in a reproducible manner during exposure to acidic liquids not only gravimetrically, but also with the help of high resolution online radiography. From the results it was possible to reach the conclusion that it is possible with the help of the tested salthydrated melt, to modify erosive drinks not only by preventing their remineralization effect on the hydroxyapatite, but in a sense to reverse the remineralization. A reproducible mineral incorporation was continuously observed with regard to the tested drinks. This effect is based on the principle of accelerated dynamic remineralization. It appears that it is possible, at least in an artificial environment, with the help of salthydratic melt to prevent dental erosion resulting from acidic softdrinks.

Für Kinder und Jugendliche stellt die Blutentnahme im Rahmen des Therapeutischen Drug Monitorings (TDM) aufgrund der Invasivität häufig eine große physische sowie psychische Belastung dar. Diese Stresssituation kann durch Speichelsammlung aufgrund des nicht invasiven Prozederes vermieden und zusätzlich der Material-, Personal- und Zeitaufwand im Vergleich zu einer Blutentnahme minimiert werden. Da die therapeutischen Referenzbereiche in der AGNP Konsensus-Leitlinie zum TDM von Psychopharmaka nur für Serum und Plasma validiert sind, sind vergleichende Untersuchungen von alternativen Matrizes mit Serum oder Plasma sowie eine klinische Validierung essenziell für die Implementierung in die klinische Praxis. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es daher, den Zusammenhang zwischen Speichel- und Serumkonzentrationen von Amphetamin und Guanfacin zu untersuchen, um zukünftig das Prozedere der Probenahme für TDM bei Kinder und Jugendliche unter ADHS-Pharmakotherapie durch ein nicht invasives Verfahren zu erleichtern. Zur quantitativen Bestimmung wurden zwei unterschiedliche Methoden aus der Literatur weiterentwickelt. So war es möglich, aus Speichel- und Serumproben Amphetamin mittels HPLC-FL Analytik sowie Guanfacin mittels LC-MS/MS Analytik zu quantifizieren. Die chromatographischen Methoden wurden in Anlehnung an die Richtlinien der Gesellschaft für toxikologische und forensische Chemie (GTFCh) erfolgreich validiert. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Speichel- und Serumkonzentrationen von Amphetamin und Guanfacin bei Kinder und Jugendlichen wurde eine klinische Studie in der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendpsychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikum Würzburgs initiiert. Von 34 Probanden, die mit Lisdexamphetamin und/oder Guanfacin behandelt wurden, konnte jeweils eine korrespondierende Speichel- und Serumprobe gewonnen und quantifiziert werden. Für Amphetamin wurde belegt, dass der Speichel-pH-Wert einen erheblichen Einfluss auf die Wirkstoffverteilung, den Quotienten aus Speichel- und Serumkonzentration, hat (ρ = -0,712; P < 0,001). Dadurch konnte erstmalig unter Berücksichtigung des Speichel-pH-Wertes eine Berechnung der theoretischen Serumkonzentration aus der Speichelkonzentration durchgeführt werden. Es wurde zwar gezeigt, dass sich sowohl der Mittelwert der Differenzen durch die Berechnung theoretischen Serumkonzentration von -343 auf 12 ng/mL als auch die Anzahl der Messwert innerhalb des Akzeptanzintervalls von 20 % verbessern, jedoch war auch nach der Umrechnung die Differenz der Messwerte zu groß, sodass eine klinische Validierung für Amphetamin nicht möglich war. In dieser Studie wurde auch erstmals Guanfacin im Speichel nachgewiesen und quantifiziert, die Konzentrationen lagen zwischen 0,45 und 5,55 ng/mL und waren im Mittel dreifach niedriger als im Serum (2,36 ng/mL vs. 7,47 ng/mL; t (8) = 5,94; P < 0,001).   Die Speichelguanfacinkonzentration wies einen starken Zusammenhang mit der korrespondierenden Serumkonzentration auf (r = 0,758; P = 0,018). Obwohl ein nicht signifikanter Trend für den Einfluss des Speichel-pH-Wertes auf den Quotienten aus Speichel- und Serumkonzentration zu erkennen war, scheint dieser weniger stark ausgeprägt zu sein als bei Amphetamin und anderen basischen Arzneistoffen (r = -0,574; P = 0,106). Mit der vorliegenden Arbeit konnte zum einen gezeigt werden, dass sich die Speichelbestimmung von Amphetamin nur zum qualitativen Nachweis für TDM eignet. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass der Speichel-pH-Wert einen geringeren Einfluss auf die Speichelkonzentration von Guanfacin zu haben scheint, als es bei Amphetamin der Fall ist, und sich Guanfacin somit potenziell für TDM in Speichel eignet. Zukünftig könnten Speichelproben zur Kontrolle der Adhärenz sowohl von Amphetamin als auch von Guanfacin verwendet werden und die Probenahme für die Patienten vereinfachen. / Due to the invasive procedure, blood sampling for therapeutic drug monitoring (TDM) is often associated with high stress levels for children and adolescents, which may be avoided by non-invasive oral fluid collection. Furthermore, it may reduce material, personnel and time costs compared to blood collection. Since the therapeutic ranges of the AGNP guideline for TDM of psychotropic drugs are only validated for serum and plasma, comparative studies of alternative matrices with serum or plasma, as well as a clinical validation are essential for the implementation into clinical practice. To investigate the relationship between oral fluid and serum concentrations of amphetamine and guanfacine in children and adolescents, a clinical study was initiated at the Clinic and Polyclinic for Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy at the University Hospital of Würzburg. Therefore, corresponding oral fluid and serum samples derived from 34 subjects treated with lisdexamfetamine and/or guanfacine were collected and quantified. A significant effect of oral fluid pH on drug distribution (ρ = -0.712; P < 0.001), reported as the quotient of oral fluid to serum concentration, was observed for amphetamine. For the first time a calculation of serum concentration from oral fluid concentration, taking oral fluid pH into account, could be performed. Although the calculation improved both the mean of the differences of both methods from -343 to -12 ng/mL and the number of samples within the 20 % acceptance interval, the clinical validation was missed due to the variation between the measured and the calculated serum concentration of amphetamine. Furthermore, guanfacine was detected and quantified in oral fluid for the first time, with concentrations from 0.45 to 5.55 ng/mL, which was three times lower compared to serum concentrations (2.36 ng/mL vs. 7.47 ng/mL; t (8) = 5.94; P < 0.001). A strong relationship between oral fluid and the corresponding serum concentration of guanfacine (r = 0.758; P = 0.018) was observed. Although a non-significant trend suggested an influence of oral fluid pH on the oral fluid-to-serum concentration ratio, it appeared to be significantly less pronounced than for amphetamine and other basic drugs (r = -0.574; P = 0.106). With the herein presented work it was shown that, on the one hand, the determination of amphetamine in oral fluid may be suitable for qualitative issues in TDM, and, on the other hand, oral fluid pH seems to have a smaller influence on the oral fluid concentration of guanfacine than it is the case for amphetamine and, thus, guanfacine is promising candidate for TDM in oral fluid. In future, oral fluid could be used for compliance monitoring of amphetamine and guanfacine and to facilitate specimen collection as a non-invasive procedure for children and adolescents.

Die humane Yersiniose wird durch Lebensmittel tierischen Ursprungs übertragen und stellt aufgrund der jährlich gleichbleibend hohen Zahl übermittelter Krankheitsfälle sowie der wahrscheinlich weitaus höheren Dunkelziffer ein Problem des gesundheitlichen Verbraucherschutzes dar. Die intermittierende Ausscheidung des Erregers Yersinia enterocolitica beim klinisch unauffälligen Reservoirtier Schwein und die aufwändige Kultivierung erschweren den direkten Erregernachweis. Hier könnte der serologische Nachweis, in der Humanmedizin bereits seit langem etabliert, eine wertvolle diagnostische Hilfe sein. Die Erkennung serologisch positiver Bestände ähnlich dem Salmonellen-Monitoring und daran anschließende Hygienemaßnahmen, vor allem vor und während der Schlachtung, können den Eintrag des Erregers in die Lebensmittelkette vermindern. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein hochspezifisches serologisches Nachweissystem entwickelt, das durch die Verwendung rekombinanter und ausschließlich bei pathogenen Yersinien vorkommender Antigene eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Neun ausgewählte Yersinia Outer Proteins (Yops) wurden kloniert und mit spezifisch auf jedes Protein abgestimmten Bedingungen zur optimalen Expression gebracht. Durch die Evaluierung verschiedener Aufreinigungssysteme konnten schließlich reproduzierbare hochreine Antigene auch in großen Mengen hergestellt werden. Mit Blick auf eine sichere Auswertbarkeit bei der Verwendung des Testsystems in Laboratorien wurden die Antigene nicht elektrophoretisch aufgebracht, sondern mittels Sprühverfahren auf eine Nitrozellulosemembran aufliniert. Das gebrauchsfertige Testsystem, Blotstreifen von 2,5 mm Breite mit neun auflinierten, rekombinant hergestellten und Virulenzplasmid-basierenden Yersinia-Antigenen, eignet sich zur Diagnostik serologisch positiver Schweine. Mit Hilfe dieses Testsystems wurde die isotypspezifische Antikörperantwort von Schweinen im Infektionsmodell gegen den Erreger Y. enterocolitica ausgewertet. Nach zwei Vorversuchen mit jeweils zwei Schweinen wurden im Hauptversuch neun Ferkel experimentell mit einer Infektionsdosis von 5x1011 KBE per Magenschlundsonde infiziert, wobei die Tiere nach leichtem und kurzfristigem Durchfallgeschehen den Erreger symptomlos mit dem Kot ausschieden. Weitere neun Ferkel stellten eine Kontrollgruppe nicht infizierter Tiere dar. Vom Tag der Infektion bis zum Tag der Tötung (Tag 33) wurde regelmäßig bei den achtzehn Schweinen Blut, Speichel und Tränenflüssigkeit gewonnen, am letzten Tag zusätzlich Gelenkflüssigkeit und Darmsekrete. Die Auswertung der Seren im zeitlichen Verlauf zeigte deutlich die Immunogenität der Yops. Bei dominierenden Yops wie YopO, YopH, LcrV, YopD und YopE ließ sich das Einsetzen der Antikörperbildung (IgG und IgA) mit nachfolgendem Anstieg bei allen infizierten Tieren feststellen. Die früheste Bildung von Immunglobulin G konnte am Tag 10 gegen YopD verzeichnet werden, Immunglobulin A wurde gegen YopD bereits am Tag 7 gebildet. Die nicht infizierten Kontrolltiere waren im Immunoblot durchgehend negativ. In den Darmsekreten, der Gelenk- und Tränenflüssigkeit und vor allem im Speichel liessen sich mit dem entwickelten Test ebenfalls spezifische Yop- Antikörper detektieren. Der Test kann somit zur Diagnostik von Beständen mit Yersinia-Problematik herangezogen werden; er eignet sich als kompletter Kit sowohl für Labore als auch für veterinärmedizinische Praxen.

The aim of this review is to discuss current findings regarding the roles of miRNAs in periodontal diseases and the potential use of saliva as a diagnostic medium for corresponding miRNA investigations. For periodontal disease, investigations have been restricted to tissue samples and five miRNAs, that is, miR-142-3p, miR-146a, miR-155, miR-203, and miR-223, were repeatedly validated in vivo and in vitro by different validation methods. Particularly noticeable are the small sample sizes, different internal controls, and different case definitions of periodontitis in in vivo studies. Beside of that, the validated miRNAs are associated with inflammation and therefore with various diseases. Furthermore, several studies successfully explored the use of salivary miRNA species for the diagnosis of oral cancer. Different cancer types were investigated and heterogeneous methodology was used; moreover, no overlap of resultswas found. In conclusion, fivemiRNAs have consistently been reported for periodontitis; however, their disease specificity, detectability, and expression in saliva and their importance as noninvasive markers are questionable. In principle, a salivary miRNA diagnostic method seems feasible.However, standardized criteria and protocols for preanalytics, measurements, and analysis should be established to obtain comparable results across different studies.

Die humane Mundhöhle beheimatet als hoch komplexes Ökosystem eines der vielfältigsten Mikrobiome des gesamten Körpers. Das Vorhandensein diverser Nischen wird durch abiotische und biotische Parameter wie mikrogeographische Charakteristiken, die Verfügbarkeit von Nahrung und Sauerstoff, spezifische pH-Werte und Temperaturen, Abwehrsysteme und Essgewohnheiten des Wirtes sowie molekulare und bakterielle Interaktionen bedingt. Zum derzeitigen Kenntnisstand umfasst das orale Mikrobiom etwa 700 bakterielle Phylotypen, die zum Teil als orts- und/oder wirtsspezifisch klassifiziert werden können. Aufgrund kurzer Generationsfolgen innerhalb des bakteriellen Wachstums adaptieren die mikrobiellen Kompartimente schnell an sich verändernde Umweltbedingungen. Dabei ist ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der residenten Mikroflora und dem Wirt ohne die Prädominanz potenziell pathogener Spezies für die Mundgesundheit elementar. Dem Erhalt dieser oralen Homöostase dient u.a. der Speichel mit seinen vielfältigen Funktionen. Als globales Reservoir der Mikrobiota der Mundhöhle in ihrer planktonischen Phase reflektiert er zudem Veränderung innerhalb der bakteriellen Zusammensetzung, welche mit oralen Erkrankungen wie Karies, Gingivitis und Parodontitis assoziiert sind. Die einfache, non-invasive und kostengünstig durchführbare Entnahme gestaltet den Speichel zum attraktiven Analysemedium. Derzeit stellen hierfür Sequenzierungstechniken den Goldstandard zur Untersuchung der phylogenetischen Vielfalt des oralen Mikrobioms dar. Allerdings sind diese Methoden mit einem hohen finanziellen, zeitlichen und laboratorischen Aufwand verbunden. Ein bereits in der Umweltmikrobiologie etabliertes Verfahren zur Betrachtung komplexer Ökosysteme ist die Durchflusszytometrie. Sie ermöglicht - gemäß eines Screenings - die Visualisierung und Bewertung sich schnell verändernder Gemeinschaftsstrukturen. Außerdem können quantitative Analysen im Sinne von Zellzahlmessungen der betrachteten Proben durchgeführt werden. Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, die Anwendbarkeit der Durchflusszytometrie auf Untersuchungen bakterieller Kompartimente im humanen Speichel zu evaluieren. Dafür sollten im Rahmen des Teilprojektes der vorliegenden Dissertationsschrift zunächst intra- und interindividuelle Unterschiede der bakteriellen Zusammensetzung innerhalb eines dreimonatigen Entnahmezeitraums untersucht werden. In einem weiteren Teilprojekt verfolgte Frau van Gelder die Reaktion der Bakteriengemeinschaften auf verschiedene extrinsische Stresseinflüsse (Zucker, Säure und antibakterielle Mundspüllösungen). Für die geplante Untersuchung erfolgte die Auswahl von zehn oral und allgemein gesunden Probanden beider Geschlechter im Alter über 18 Jahren. Alle Teilnehmer der Studie erhielten eine einheitliche Zahnbürste (Elmex InterX mittel) und die Zahnpasta Meridol (beides CP GABA Hamburg, Deutschland). Die standardisierten Mundhygieneartikel sollten während des gesamten Zeitraums der Untersuchungen verwendet werden. Die Probanden wurden angewiesen, zweimal täglich ihre Zähne zu putzen. Für die Analyse zeitabhängiger intra- und interindividueller Unterschiede der Speichelmikrobiome erfolgten 11 Probenentnahmen in festgelegten Intervallen: 0 Stunden (h), 8h, 24h, 3 Tage (d), 7d, 2 Wochen (w), 4w, 6w, 8w, 10w und 12w nach Beginn der Untersuchung. An den Tagen der Speichelgewinnung wurden die Probanden angehalten, ihre Zähne bis zur Entnahme nicht zu putzen. Das letzte Zähneputzen sollte spätestens bis 24 Uhr des Vortages erfolgt sein. Ferner sollte eine Stunde vor Probengewinnung keine Nahrungs- oder Getränkeaufnahme stattfinden. Die Gewinnung unstimulierten Speichels wurde gemäß eines standardisierten und validierten Protokolls durchgeführt: Hierfür spülten die Probanden nach einer fünfminütigen Adaptationszeit für 30 Sekunden mit destilliertem Wasser und sammelten dann innerhalb weiterer fünf Minuten den unstimulierten Speichel im Mund. Im Anschluss an die Speichelprobengewinnung erfolgten die Fixierung des Gesamtspeichels mit Glycerol, eine Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff und die Lagerung bei -80°C. Für die weiterführende laboranalytische Auswertung wurden die Speichelproben aufgetaut und ihre Zellen entsprechend eines definierten Färbeprotokolls mit dem DNA-Farbstoff DAPI (Di-Amidino-2-Phenyl-Indol) behandelt bzw. gefärbt. Nachfolgend konnten die Proben im Durchflusszytometer (MoFlow Legacy cell sorter) vermessen und bezüglich der optischen Parameter Zellgröße (Vorwärtsstreulicht, „Forward Scatter“) und DNA-Gehalt (DAPI-Fluoreszenz) analysiert werden. Mit Hilfe der Programme Summit Ver. 4.3, FlowJo und flowCyBar erfolgte die bioinformatische Auswertung der zytometrischen Daten. Die Profile der Speichelmikrobiome zeigten über den untersuchten Zeitraum intra-individuelle Stabilitäten, aber unterschieden sich zwischen den Probanden, mit Ausnahme partieller Überlappungen. Personenspezifische Muster waren nachweisbar. Dabei stellten sich die Mikrobiomstrukturen einiger Probanden sehr beständig dar, während die bakteriellen Kompartimente anderer Probanden größere Schwankungen aufwiesen. Die zytometrischen Messungen wurden exemplarisch mittels Illumina®Sequenzierung verifiziert. Die phylogenetischen Unterschiede (Anzahl und Verteilung der operational taxonomic units) der Proben einer Versuchsperson zu unterschiedlichen Entnahmezeitpunkten waren hierin geringer als die der Proben zweier Teilnehmer zur selben Entnahme. Die unter Teilprojekt I formulierte Arbeitshypothese wurde durch die Ähnlichkeitsanalysen der Longitudinalstudie bestätigt. Auf dieser Basis können folgende Schlussfolgerungen getroffen werden: Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle Detektion komplexer bakterieller Kompartimente und deren Veränderungen im Speichel mundgesunder Probanden. Dabei sind individuelle, personenspezifische Bakterienprofile innerhalb der untersuchen Probanden graphisch darstellbar. Diese Profile weisen eine hohe innergemeinschaftliche Beständigkeit auf. Als qualitative Analyse bestätigt die Illumina®-Sequenzierung die Messung typischer Vertreter des Speichelmikrobioms im Zytometer sowie das Vorliegen intraindividueller Stabilitäten. Zur Verifizierung der Ergebnisse ist eine Ausweitung der Studie auf einen größeren Probandenpool erforderlich.:1. Einführung 1.1 Das orale Mikrobiom 1.2 Entwicklung des adulten oralen Mikrobioms und Einflüsse auf die mikrobielle Homöostase 1.3 Untersuchungsmethoden der oralen Mikrobiota 1.4 Durchflusszytometrie 1.5 Speichel 1.6 Zielsetzung und Fragestellung der vorliegenden Studie 2. Publikationsmanuskript 3. Zusammenfassung der Arbeit 4. Ausblick 5. Literaturverzeichnis 6. Wissenschaftliche Präsentationen 7. Darstellung des eigenen Beitrags 8. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 9. Lebenslauf 10. Danksagung

Neuweltkameliden, Trächtigkeitsdiagnose, Hormone, Speichel, Milch, Urin Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die trächtigkeitsassoziierten Hormone Progesteron (P4), Pregnanediol-Glucuronid (PdG), Östronsulfat (E1S) und Relaxin (RLN) in Spei-chel, Milch und Urin von tragenden und nicht tragenden Alpakas im Vergleich zur je-weiligen Blutkonzentration zu bestimmen, um ihre Eignung zur nicht invasiven Träch-tigkeitsdiagnostik zu untersuchen. Beprobt wurden, über einen Zeitraum von zwei Jahren, 36 Alpakastuten von sechs pri-vaten Züchtern in Sachsen jeweils vor der Bedeckung und in verschiedenen Stadien der Trächtigkeit (verifiziert durch eine transabdominale Ultraschalluntersuchung). Es wurden jeweils Serum-, Plasma-, Speichel-, Urin- und Milchproben gewonnen und die Hormonkonzentrationen mittels Enzymimmunoassay (EIA) bestimmt. Weiterhin wurden einige Milchproben in einem semiquantitativen Progesteron-Schnelltest für Rinder ein-gesetzt. P4-Konzentrationen steigen signifikant von Basalwerten beim nicht tragenden Tier von 0,35 ± 0,04 ng/ml auf 2,94 ± 0,11 ng/ml Plasma (bzw. von 0,26 ± 0,03 auf 2,87 ± 0,10 ng/ml Serum) bei tragenden Tieren an. Auch in Milch und im Urin tragender Alpakas sind signifikant höhere P4-Konzentrationen messbar: Sie steigen von basal 0,83 ± 0,06 ng/ml auf 4,09 ± 0,38 ng/ml Milch bzw. von 0,29 ± 0,04 ng P4/mg Krea auf 0,60 ± 0,06 ng P4/mg Krea im Urin. Die Urin-Konzentrationen von PdG sind signifikant höher bei graviden (152,73 ± 17,37 ng PdG/mg Krea) als bei ingraviden Alpakas (26,70 ± 2,80 ng PdG/mg Krea). Im Speichel sind weder von P4 noch von PdG Konzentrationsunterschiede zwischen den beiden Gruppen nachweisbar. Der P4-Schnelltest erkannte 28 von 31 Milchproben tragender Tiere richtig als tragend, was einem Prozentsatz von 90 % entspricht. Dage-gen wurden 22 von 32 Proben nicht tragender Tiere als nicht tragend identifiziert (69 %), wobei von den falsch positiven Milchproben jedoch 70% auch mit dem labor-gebundenen EIA falsch positive Ergebnisse lieferten. Während Blutkonzentrationen von RLN signifikant nach dem zweiten Trächtigkeitsmo-nat von basal 1,65 ± 0,56 ng/ml auf 11,69 ± 2,31 ng/ml (Plasma) bzw. von 0,95 ± 0,30 ng/ml auf 16,23 ± 3,05 ng/ml (Serum) ansteigen, sind keine Unterschiede in Milch, Speichel und Urin zwischen tragenden und nicht tragenden Tieren nachweisbar. Konzentrationen von E1S steigen erst im letzten Trächtigkeitsmonat signifikant an: Blutwerte steigen von basal 0,59 ± 0,07 ng/ml auf 3,43 ±0,55 ng/ml (Plasma) bzw. 0,32 ± 0,02 ng/ml auf 2,16 ± 0,43 ng/ml (Serum) und Urinwerte von basal 6,14 ± 0,53 ng E1S/mg Krea auf 104,03 ± 24,09 ng E1S/mg Krea. Speichel und Milchkonzentrationen unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen. Die gemessenen Konzentrationen von P4, E1S und RLN im Blut bzw. PdG und E1S im Urin stimmen mit den Ergebnissen früherer Untersuchungen überein und können somit als Trächtigkeitsmarker bestätigt werden. Dies ist die erste Arbeit, die trächtigkeitsassoziierte Hormone in Speichel und Milch von Alpakas untersucht. Während die P4 Bestimmung in Milch sowie die Bestimmung von PdG und E1S in Urin geeignete Alternativen darstellen, ist Speichel für eine Trächtig-keitsdiagnostik beim Alpaka ungeeignet. Die Nutzung von Milch und Urin zur Trächtigkeitsdiagnose stellt insofern eine Vereinfa-chung der derzeitig gängigen Methoden (u. a. Blutprogesteron) dar, als dass der Besit-zer das Probenmaterial selbst gewinnen kann und dies mit erheblich weniger Stress für die Stuten verbunden ist. Die Bestimmung von P4 in Milch und PdG in Urin stellen so-mit geeignete Alternativen zur Frühdiagnostik im ersten Trächtigkeitsmonat dar, da zu diesem Zeitpunkt eine transabdominale Ultraschalluntersuchung noch nicht aussage-kräftig ist. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag, um die noch vergleichsweise kleine vor-handene Datenbank zur Endokrinologie der Reproduktion bei NWK zu erweitern. / Aims of the present study were the measurement of pregnancy-associated hormones progesterone (P4), pregnanediol-glucuronide (PdG), relaxin (RLN) and oestrone sul-phate (E1S) in saliva, milk and urine of pregnant and non-pregnant alpacas, to compare to their respective blood concentrations and to assess their potential use for pregnancy diagnosis. Samples were obtained over a course of two years from 36 female alpacas of 6 private alpaca breeders in Saxony (Germany) before mating and at different stages throughout pregnancy (confirmed by ultrasonography). Hormone concentrations in serum, plasma, saliva, urine and milk samples were determined using enzyme immunoassays (EIA). Some milk samples were also tested using a commercial on-farm P4 kit which is de-signed for dairy cattle. Concentrations of P4 increased significantly from basal values in non-pregnant alpacas of 0.35 ± 0.04 ng/ml to 2.94 ± 0.11 ng/ml in plasma (and from 0.26 ± 0.03 to 2.87 ± 0.10 ng/ml in serum) in pregnant animals. Milk and urine concentrations of P4 were sig-nificantly higher in pregnant alpacas: Values increased from basal 0.83 ± 0.06 ng/ml to 4.09 ± 0.38 ng/ml in milk and from 0.29 ± 0.04 ng P4/mg Cr to 0.60 ± 0.06 ng P4/mg Cr in urine. While PdG concentrations in urine were significantly higher in pregnant (152.73 ± 17.37 ng PdG/mg Cr) than in non-pregnant animals (26.70 ± 2.80 ng PdG/mg Cr), there were no differences in concentrations of P4 or PdG in saliva. The on-farm milk P4 test kit showed a sensitivity of 90% for diagnosis of pregnancy and a specificity of 69% for non-pregnancy. RLN concentrations in blood increased significantly after the 2nd month from basal 1.65 ± 0.56 ng/ml to 11.69 ± 2.31 ng/ml in plasma and from 0.95 ± 0.30 ng/ml to 16.23 ± 3.05 ng/ml in serum, whereas there were no differences in milk, saliva and urine between pregnant and non-pregnant animals. Hormone concentrations of E1S increase during the last month of pregnancy: Blood concentrations rise from basal values of 0.59 ± 0.07 ng/ml to 3.43 ± 0.55 ng/ml in plasma and from 0.32 ± 0.02 ng/ml to 2.16 ± 0.43 ng/ml in serum; urine concentrations from 6.14 ± 0.53 ng E1S/mg Cr to 104.03 ± 24.09 ng E1S/mg Cr. There were no sig-nificant differences in E1S concentrations in saliva and milk between pregnant and non-pregnant alpacas. Values of P4, E1S and RLN in blood as well as PdG and E1S in urine are comparable to previous reports in alpacas and therefore can be confirmed as an indicator for preg-nancy. This is the first study to include determination of pregnancy associated hormones in saliva and milk of alpacas. However, saliva seems to be unsuitable for pregnancy di-agnosis in alpacas, whereas P4 in milk, as well as PdG and E1S in urine seem to be adequate tools. The use of milk and urine would simplify pregnancy diagnosis in alpacas since, in con-trast to the current methods (e.g. blood P4 concentration and ultrasonography), the owners themselves can take the samples. The avoidance of blood sampling results in a considerable stress reduction for the animals and therefore reduces the risk for potential loss of pregnancies. The measurements of P4 in milk and PdG in urine are useful alternatives to pregnancy diagnosis, especially during the first month of pregnancy, when transcutaneous ultrasonography is not yet reliable. This work adds information to the comparatively small database for camelid reproduc-tive endocrinology.

Patients with bulimia nervosa are at high risk for dental erosion. However, not all bulimic patients suffer from erosion, irrespective of the severity of their eating disorder. It is often speculated that differences in the saliva are important, however, little is known about salivary parameters in bulimic patients, particularly directly after vomiting. The aim of the clinical trial was to compare different salivary parameters of subjects suffering from bulimia with those of healthy controls. Twenty-eight subjects participated (14 patients with bulimia nervosa, 7 of them with erosion; 14 matched healthy controls). Resting and stimulated saliva of all participants was analysed as well as saliva collected from bulimic patients directly and 30 min after vomiting. Parameters under investigation were flow rate, pH, buffering capacity and the enzyme activities of proteases in general, collagenase, pepsin, trypsin, amylase, peroxidase, and lysozyme. Regarding flow rate, pH and buffering capacity only small differences were found between groups; buffering capacity directly after vomiting was significantly lower in bulimic subjects with erosion than in subjects without erosion. Differences in enzymatic activities were more pronounced. Activities of proteases, collagenase and pepsin in resting and proteases in stimulated saliva were significantly higher in bulimic participants with erosion than in controls. Peroxidase activity was significantly decreased by regular vomiting. Proteolytic enzymes seem to be relevant for the initiation and progression of dental erosion directly after vomiting, maybe by both hydrolysis of demineralized dentine structures as well as modulation of the pellicle layer. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Glucocorticosteroide (GC) spielen für viele endogene Prozesse im Organismus eine wichtige Rolle. Sie regulieren die Gluconeogenese sowie den Lipid- und Proteinstoffwechsel. Außerdem sind sie für die Stressregulierung über die Hypothalamus-Nebennierenrinden-Achse verantwortlich. Therapeutisch kommen die GCs wegen ihrer entzündungshemmenden Wirkung zum Einsatz und werden u.a. bei Asthma und Gelenkentzündungen angewandt. Diese Eigenschaft macht sie auch interessant für den Gebrauch im Sportbereich. Dort wird ihre Anwendung über die Weltantidopingagentur reguliert. Ihr oraler, intramuskulärer, intravenöser und rektaler Gebrauch ist im Wettkampf verboten. Diese Einschränkung bzgl. des Applikationszeitraumes und des Applikationsweges erschwert die diagnostische Aussagekraft von Routinedopingproben, welche im Urin durchgeführt werden. Ein Grenzwert von 30 ng/ml soll einen legalen Gebrauch von einem Missbrauch abgrenzen. Die endogenen Glucocorticosteroide stellen hierbei jedoch einen Graubereich dar. Endogen wird Cortisol in einem zirkadianen Rhythmus produziert und die Produktion ist stressinduziert. Somit kommt es zu ausgeprägten intra- und interindividuellen Streuungen der endogenen Produktion. Dadurch bedingt ist eine Abgrenzung der endogenen Produktion von einer legalen Anwendung bzw. einem Missbrauch im Rahmen der Dopingrichtlinien im Urin nicht möglich. Speziell für den Nachweis von endogenen Substanzen ist es wichtig, eine Methode zu finden, mit der es möglich ist, die endogene Produktion von einer exogenen Bezugsquelle abzugrenzen. Dabei haben sich zwei Wege als hilfreich herausgestellt. Zum einen, wenn die Differenzierung nicht an Hand von Absolutkonzentrationen sondern durch die Anwendung von Analytverhältnissen durchgeführt wird. Zum anderen, wenn zusätzliche Untersuchungen im Speichel oder Haar durchgeführt werden. Haar- und Speichelproben zählen zu den ergänzenden Matrizes der Routineuntersuchungsmedien Urin und Blut und werden bereits in vielen forensischen und klinischen Laboren für diagnostische Fragestellungen verwendet. Diese Matrizes liefern wichtige Hinweise auf den akuten (Speichel) oder chronischen/ zurückliegenden (Haar) Gebrauch bzw. Missbrauch von Medikamenten und Drogen. Sowohl die Haar- als auch Speichelmatrix sollen den physiologisch aktiven Anteil von Substanzen im Blut widerspiegeln und somit korrektere Rückschlüsse auf deren Wirksamkeit zulassen. Das endogene Glucocorticosteroid Cortisol steht seit der Jahrtausendwende im Blickpunkt vieler Forschungen, welche sich mit dessen Bedeutung für die Stressantwort befassen und Cortisol u.a. im Speichel und Haar nachweisen. Auffällig ist dabei, dass die ersten Arbeiten fast ausschließlich mittels immunchemischen Nachweisverfahren erfolgten. Erst in den letzten fünf Jahren wurde vermehrt LC-MS/MS-Verfahren angewandt. Vorteil dieser ist, dass der Nachweis von Substanzen selektiv erfolgt und Kreuzreaktionen nicht stattfinden. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass die Konzentrationen von mehreren Analyten mit einer Messung bestimmt werden können. So ist es zum Beispiel möglich Cortisol und andere Steroide, z.B. dem Cortison parallel nachzuweisen. Cortison spielt für die physiologische Wirkung der Glucocorticosteroide im Körper keine Rolle, da es selbst nicht biologisch aktiv ist. Deshalb wurde es in bisherigen Forschungen für diagnostische Aussagen nicht berücksichtigt. Mit Verwendung der LC-MS/MS-Technologie werden jedoch beide endogenen GCs zunehmend nebeneinander bestimmt. Bei der Betrachtung von unterschiedlichen Untersuchungsmedien ist auffällig, dass sich die Konzentrationsverhältnisse Cortisol zu Cortison unterscheiden. Entgegengesetzte Verhält-nisse werden ersichtlich, wenn die GC-Konzentrationen im Blut mit denen im Speichel bzw. Haar verglichen werden. Bisher wurden diese Beobachtungen mit der lokalen Wirksamkeit von Enzymen, welche die Corticosteroide ineinander umwandeln, erklärt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde folgender Fragestellung für die Nachweisbarkeit der Glucocorticosteroide nachgegangen: „Wie hoch ist der Anteil der Plasmaproteinbindung der GCs im Blut und welche Rückschlüsse lassen sich daraus auf die Konzentrationsverschiebung innerhalb der einzelnen Matrizes ziehen?“ Basierend auf die einzelnen Teilprojekte wurden sowohl Plasmaproben als auch Speichel- und Haarproben hinsichtlich ihrer GC-Konzentrationen analysiert. Die Untersuchung von Kontrollproben ermöglichte es, Referenzwerte unter Normalbedingungen zu erheben. Die Ergebnisse aus den Projekten ergaben, dass die beiden endogen GCs Cortisol und Cortison in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen in den Analysenmedien vorkommen: Plasma: Gesamtkonzentration F:E ca. 3:1 freie Konzentrationen F:E ca. 1:1 Speichel: F:E ca. 1:5 Haar: F:E ca. 1:3 Die Bestimmung der Plasmaproteinbindung (PPB) beider endogener GCs hat gezeigt, dass Cortisol mit ca. 96 % stärker an die Transportproteine CBG und Albumin bindet als Cortison mit ca. 85 %. Dies führt dazu, dass sich die freien, nicht-proteingebundenen Konzentrationen angleichen und es zu einer Verhältnisverschiebung von Cortisol zu Cortison von 3:1 auf 1:1 kommt. Somit stehen vergleichbare Konzentrationen für die Inkorporation ins Haar bzw. die Diffusion in den Speichel zur Verfügung. Es konnte gezeigt werden, dass die freien Plasmakonzentrationen beider GC stark mit den Speichelkonzentrationen korrelieren. Cortisol aber unterproportional und Cortison überproportional vom Plasma in den Speichel übergeht. Dies kann mit zwei weiteren Mechanismen, welche während der Diffusion eine Rolle spielen, der unterschiedlichen Lipophilie und der Inaktivierung durch lokale Enzym-reaktionen, erklärt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass sich die Tagesrhythmik der GC-Produktion im Speichel abbilden lässt und eine starke Korrelation zwischen Cortison und Cortisol vorliegt. Mit Hilfe einer Grenzfunktion können endogene Referenzkonzentrationen definiert und Messdaten eingeordnet werden. Unter anderem wurde gezeigt, dass eine Hormonersatztherapie mit Hydrocortison zu einer Verschiebung der Metabolisierung und der PPB führt und somit ein Gebrauch/Missbrauch von GCs durch abweichende Konzentrationsverhältnisse nachweisbar ist. Speicheluntersuchungen während einer chronischen Stresssituation (Schwangerschaft) zeigen, dass die GC-Produktion stetig ansteigt und sich besonders die morgendlichen Werte unterscheiden. Um die tageszeitlichen und stressbedingten Schwankungen der GC-Produktion auszublenden und eine längere Zeitspanne zu betrachten, wurden zusätzlich Haarproben analysiert. In diesen wurde ein kontinuierlicher Anstieg der GCs in den proximalen Haarsegmenten nachgewiesen, was auf eine kontinuierlich erhöhte Inkorporation während der chronischen Stresssituation schließen lässt. Außerdem wurde gezeigt, dass die Haarkonzentrationen dem Auswascheffekt unterliegen und die nachweisbaren Konzentrationen geringer werden, je älter das Haar wird. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass beide Mechanismen (Einlagerung und Auswaschung) konkurrieren und deshalb Referenzdaten nur für das proximale Segment erhoben werden können. Für weitere Segmente sind die Auswirkungen der individuellen Einflüsse nicht mehr allgemeingültig kalkulierbar und nur noch intraindividuelle Vergleiche nach mehrmaliger Beprobung aussagekräftig. Sind die Effekte der verstärkten Inkorporation größer als die Auswaschung, lassen sich diese auch Monate später erkennen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Plasmaproteinbindung der GCs zur Verhältnisverschiebung der Konzentrationen im Blut, Speichel und Haar beiträgt. Etwa 50 % des beobachteten Effekts kann der PPB zugeordnet werden. Weitere Quellen sind die unterschiedliche Lipophilie der GCs und die enzymatische Umwandlung, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht „quantitativ“ betrachtet wurden. Die enzymatische Inaktivierung wurde bis dato als Hauptverantwortliche für die Konzentrationsverschiebung diskutiert. Mit der aktuellen Arbeit wurde dies widerlegt, und die Plasmaproteinbindung als Hauptquelle identifiziert.