Thesis (Doctoral)--Københavns universitet, 2005. / Includes bibliographical references.

Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2002.

Hintergrund und Fragestellung/Hypothese Trotz verbesserter Diagnose und Therapiestrategien in der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) in den letzten Jahrzehnten liegt das 5-Jahres-Überleben der Patienten bei nur etwa 60 %. Die hohe Mortalität ist zurückzuführen auf eine hohe Rezidivrate nach Radio- und Radiochemotherapie. Experimentelle und klinische Daten zeigen in dieser Tumorentität eine häufige Dysregulation des PI3K/AKT-Signalweges, der an verschiedenen Resistenzmechanismen beteiligt ist. Die Zielmoleküle des Signalweges sind involviert in DNA-Reparatur, Reoxygenierung und Repopulierung. Aufgrund der bekannten Beteiligung des PI3K/AKT-Signalweges an diesen wichtigen radiobiologischen Resistenzmechanismen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit folgenden Fragestellungen: 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Material und Methode/Ergebnisse 1. Charakterisierung des Aktivierungsstatus des PI3K/AKT-Signalweges in Korrelation mit radiobiologischen Parametern in HNSCC-Experimentaltumoren Für die vorliegende Untersuchung wurde auf Tumormaterial von sechs verschiedenen Plattenepithelkarzinomzelllinien (FaDu, SAS, XF354, UT-SCC-5, UT-SCC-14, UT-SCC-15) aus einer Biobank zurückgegriffen. Analysiert wurden Xenografttumoren, die mit 0, 3, 5 oder 10 Fraktionen bestrahlt worden waren. Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges wurde mittels Western Blot-Analyse untersucht. Die publizierten Daten der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen, der Pimonidazol hypoxischen Fraktion und der HIF-1α-Proteinexpression wurden mit der pAKT-Expression korreliert. In allen unbehandelten Tumoren konnte pAKT nachgewiesen werden, wobei sich eine intratumorale Heterogenität in der Expression zeigte. Unter fraktionierter Strahlentherapie konnte in dem Panel von sechs Tumorlinien keine einheitliche Aktivierung des PI3K/AKT-Signalweges nachgewiesen werden. Die Expression des endogenen Hypoxiemarkers HIF 1α korrelierte in unbehandelten Tumoren mit der pAKT-Proteinexpression. Kein Zusammenhang wurde zwischen dem Gehalt von pAKT und der Pimonidazol hypoxischen Fraktion sowie der lokalen Tumorkontrolle nach 30 Fraktionen in sechs Wochen gefunden. 2. Bestimmung der Wirksamkeit des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 in HNSCC-Zelllinien in vitro Die Experimente wurden an den humanen Plattenepithelkarzinomzelllinien Cal33, FaDu, UT-SCC-5 und UT-SCC-14 durchgeführt. In Proliferationsassays und weiteren Zellkultur-experimenten wurde der Effekt des selektiven PI3K-Inhibitors Bay 80-6946 auf die Proliferation, die Phosphorylierung von AKT sowie die Dauer des inhibitorischen Effektes untersucht. Das klonogene Zellüberleben wurde bestimmt, indem die Tumorzellen mit 0, 2, 4, 6 oder 8 Gy bestrahlt, 24 Stunden mit dem Inhibitor inkubiert und die entstandenen Kolonien nach 14 Tagen ausgezählt wurden. Eine deutliche Hemmung der Proliferation konnte an den Plattenepithelkarzinomzelllinien schon bei geringen Konzentrationen von Bay 80-6946 gezeigt werden. Die Zelllinie Cal33, welche eine bekannte PI3K Mutation besitzt, reagierte am empfindlichsten auf die Inhibition von PI3K, gefolgt von UT-SCC-14 und FaDu. Nach Inkubation mit 1 µM Bay 80 6946 konnte in keiner der drei Tumorlinien phosphoryliertes AKT nachgewiesen werden. Die Dauer der Inhibition hielt allerdings nur für die Dauer der Inkubation mit Bay 80-6946 an. Das klonogene Zellüberleben nach Bestrahlung wurde durch die Behandlung mit dem Inhibitor nicht signifikant verändert. 3. Untersuchung der Wirksamkeit von Bay 80-6946 in einem Panel von HNSCC-Experimentaltumoren in vivo mit und ohne Bestrahlung sowie des Einflusses der PI3K-Inhibition auf radiobiologische Parameter Die Wirksamkeit von Bay 80-6946 wurde in einer Gruppe von neun verschiedenen Kopf-Hals-Tumorlinien sowie zwei NSCLC-Tumorlinien untersucht (A549, Cal33, FaDu, GLF, H460, SAS, SAT, UT-SCC-5, UT-SCC-8, UT-SCC-14 und XF354). Experimenteller Endpunkt war die Tumorwachstumsverzögerung. Bay 80-6946 wurde insgesamt fünfmal im Abstand von 48 Stunden in einer Konzentration von 20 mg/kg KG intravenös injiziert. Die Behandlung begann bei einem Tumordurchmesser von 7 mm. In den drei Tumorlinien Cal33, FaDu und UT-SCC-5 wurde Bay 80-6946 zusätzlich zur Monotherapie auch in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung untersucht. Diese Tumormodelle wurden ausgewählt, da sie die intertumorale Heterogenität im Ansprechen auf die alleinige PI3K-Inhibition widerspiegeln. Die Tiere wurden mit 5 x 2 Gy täglich (Gesamtdosis 10 Gy) bestrahlt. Bay 80-6946 wurde einmal wöchentlich in einer Konzentration von 20 mg/kg KG über einen Zeitraum von 29 Tagen verabreicht. Die Behandlung begann eine Woche vor der ersten Bestrahlungsfraktion. Aufgrund des verlängerten Gesamtbehandlungs-zeitraums begann die Behandlung bereits bei einem Tumordurchmesser von 4 mm. In allen Experimentalarmen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Tumoren entnommen und immunhistochemisch auf die radiobiologischen Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion untersucht. Hinsichtlich der Wirksamkeit von Bay 80-6946 auf unbehandelte Plattenepithelkarzinome lassen sich drei Gruppen abgrenzen: starkes Ansprechen bei Cal33, intermediäres Ansprechen (SAS, UT-SCC-8, SAT, FaDu) und fehlendes Ansprechen (XF354, GLF, UT SCC-5, UT-SCC-14). Die NSCLC-Modelle A549 und H460 sprachen moderat auf Bay 80 6946 an. Bei der Kombinationstherapie von Bay 80-6946 mit fraktionierter Bestrahlung deutet sich bei Cal33 ein additiver und bei FaDu ein supraadditiver Effekt an. Bei UT-SCC-5 war in der Kombinationstherapie kein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum nachweisbar. Die immunhistochemischen Analysen zeigten in allen drei Tumorlinien weder bei der Mono- noch bei der Kombinationstherapie einen Einfluss des Inhibitors auf die Parameter Hypoxie, Anzahl der Gefäße und Perfusion im Vergleich zur Kontrolle. Schlussfolgerung Die in einem Panel von Experimentaltumoren gewonnen Daten unterstützen derzeit nicht den Einsatz von pAKT als Biomarker, um das Ansprechen auf eine fraktionierte Strahlentherapie vorherzusagen. Vielmehr scheinen die gewonnenen Ergebnisse im Einklang zu den kontroversen und teilweise inkonsistenten Daten anderer Arbeitsgruppen zu stehen. Somit sind trotz klarer radiobiologischer Rationale weitere methodische und translationale Untersuchungen zum potenziellen Stellenwert des AKT-Signalweges als prognostischer Biomarker für die Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren notwendig. Durch die Kombination einer fraktionierten Strahlentherapie mit einem selektiven PI3K-Inhibitior konnte in der vorliegenden experimentellen Arbeit ein deutlicher Effekt auf die Tumorwachstumsverzögerung von Kopf-Hals-Tumoren gezeigt werden. Das Ausmaß des Ansprechens unterschied sich jedoch zwischen den drei untersuchten Tumorlinien und wirft die Frage nach der Ursache dieser Variabilität auf. Vor dem Einsatz eines PI3K-Inhibitors unter fraktionierter Strahlentherapie sollte in weiteren Experimenten der zugrundeliegende Mechanismus der Strahlensensibilisierung geklärt werden. Als zentrale Mechanismen sollten dabei vertiefend der Einfluss der selektiven PI3K-Inhibition auf das Tumormikromilieu sowie die Beteiligung des PI3K-Inhibitors an der Reparatur strahleninduzierter Schäden untersucht werden.

Ziel der Arbeit ist es, technische, psychologische und gestalterische Grundlagen fuer medizinische Spezialbereiche zu erarbeiten. Es lassen sich wesentliche Ergebnisse zusammenfassen: Die detailliert betrachteten Bereiche der Strahlentherapie, der Lithotripsie und der Kernspintomographie (MRT) erfordern jeweils genaue Analysen, um die funktionellen Ablaeufe, die in der Arbeit nur eine untergeordnete Rolle spielen, die technischen Details und die psychologischen Rahmenbedingungen zu ermitteln. Daraus ergeben sich jeweils unterschiedliche Anforderungen an die Gestaltung der einzelnen Bereiche, in Abhaengigkeit der technischen und psychologischen Voraussetzungen. Zukuenftig werden interventionelle Methoden auch im Bereich des MRT eine Rolle spielen. Fuer diese multifunktionelle Nutzung der Raeume sind groessere Flaechen vorzusehen. Die weitere Entwicklung der Geraete und neuer Technologien liegt in der Hand von Wissenschaftlern und Herstellern, so dass sich zukuenftig Anforderungen an Raeume ergeben werden, die heute nur im Ansatz bedacht werden koennen. Die technische Weiterentwicklung der Geraete wird sich auf die bauliche Planung auswirken: inzwischen sind zahlreiche Geraete deckenhaeng anzuordnen, wie z.B. Monitore zur Darstellung durch Roentgen oder Sonographie zur Ueberwachung von Koerperfunktionen wie z. B. Herzschlag, sowie fuer Eingriffe unter Video-Bildgebung. (Abstract mit Genehmigung des Informationszentrum Raum und Bau/IRB Verlag entnommen aus der Datenbank RSWB Raum, Städtebau, Wohnungswesen, Bauwesen)

Aufgrund der heterogenen Tumorbiologie variiert der Therapieerfolg bei lokal fortgeschrittenen Plattenepithelkarzinomen stark, woraus ein mittleres 5-Jahres-Überleben dieser Patienten von etwa 50% resultiert. Um die Therapie besser an die Tumoreigenschaften anzupassen, muss die Therapieresistenz der Tumoren vor der Behandlung bestimmt werden. In dieser Dissertationsschrift werden Methoden aus dem Bereich des maschinellen Lernens angewandt um Genexpressionsdaten zu analysieren, um so Signaturen und Modelle zu erzeugen die eine Klassifizierung der Tumoren in verschiedene Risikogruppen bezüglich der loko-regionären Tumorkontrolle erlauben. Für Patienten, die mit postoperativer Radiochemotherapie behandelt wurden, konnte eine 7-Gen Signatur entwickelt und erfolgreich validiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass verschiedene Signaturen ähnlich gut zur Patientenklassifizierung geeignet sein können. Daher wurde eine Methode vorgeschlagen, die es erlaubt verschiedene prognostiche Modelle zu kombinieren. Weiterhin wurden verschiedene genbasierte Biomarker zwischen verschiedenen Genexpressionsmessmethoden verglichen. In den resultierenden Patienteneinteilungen zeigten Biomarker, die auf Signaturen basieren, eine geringere Variabilität als Biomarker, die auf einzelnen Genen basieren.:Abbreviations VII Figures IX Tables XII 1 Introduction 1 2 Biological & Statistical Background 4 2.1 Head and Neck Squamous Cell Carcinoma 4 2.1.1 Tumorigenesis 4 2.1.2 Biomarkers 8 2.2 Statistics 14 2.2.1 Survival analysis 14 2.2.2 Model and data evaluation 18 2.2.3 Data sampling methods 22 2.3 Machine learning algorithms 23 2.3.1 Feature selection algorithms 24 2.3.2 Prognostic models 27 2.4 Gene expression measurement methods 30 2.4.1 Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 31 2.4.2 nCounter® gene expression 32 2.4.3 In situ-synthesized oligonucleotide microarrays 32 3 Material and methods 35 3.1 Patient cohorts 35 3.1.1 Primary radiochemotherapy (pRCTx) cohorts 35 3.1.2 Postoperative radio(chemo)therapy (PORT-C) cohorts 36 3.1.3 Clinical endpoints 38 3.2 Gene expression analyses 39 3.2.1 HPV status 39 3.2.2 Immunohistochemical staining 39 3.2.3 RT-PCR measurements 40 3.2.4 nCounter® measurements 40 3.2.5 GeneChip® analyses (only training cohorts) 41 3.3 Machine learning framework 41 3.3.1 Pre-processing of gene expression data 41 3.3.2 Determination of the ensemble gene signature 42 3.3.3 Expanding the ensemble signature by highly correlated genes 43 3.3.4 Independent validation and patient stratification 45 4 Identification of gene expression signatures as prognostic biomarkers 46 4.1 Hypoxia classification 46 4.2 nCounter® gene expression based signatures 50 4.2.1 Patients treated with primary radiochemotherapy 50 4.2.2 Clinical Features 55 4.2.3 Signature extension using clinical features 64 4.2.4 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 65 4.2.5 Signature extension using clinical features – Port-C 72 4.3 GeneChip® gene expression-based signatures 78 4.3.1 Pre-selection 78 4.3.2 Patients treated with primary radiochemotherapy 79 4.3.3 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 87 4.4 Combined models for PORT-C 91 4.4.1 Creation of a consensus model 92 4.4.2 Consensus model based on 2 models 93 4.4.3 Consensus model based on more than 2 models 97 4.4.4 Discussion and summary of model combination 101 5 Stability of gene expression-based biomarkers 102 5.1 Reproducibility depending on time of nCounter® 102 5.2 Comparison of nCounter® and GeneChip® gene expression 106 5.2.1 Introduction 106 5.2.2 Correlation analyses 106 5.2.3 Model and biomarker transfer 108 6 Conclusion and outlook 123 Zusammenfassung 125 Summary 128 Appendix 130 A. Supplementary Figures 130 B. Supplementary Tables 133 Bibliography 147 Acknowledgements 188 Erklärungen 189 / Due to heterogeneous tumour biology, the treatment response of locally advanced head and neck squamous cell carcinoma differs largely between patients, resulting in a mean 5-year survival of about 50%. In order to adapt the treatment to the properties of the tumour, the therapy resistance of the tumours must be assessed before treatment. In this thesis, gene expression data were analysed to identify novel gene signatures and models that allow for stratifying patients into risk groups with low and high risk of loco-regional tumour recurrence. To identify those signatures, methods from the field of machine learning were applied. For patients treated with postoperative radiochemotherapy, a 7-gene signature was developed and successfully validated. Furthermore, it was shown that several models based on different gene signatures may be equally suitable for patient stratification. A method is presented that combines those distinct prognostic models. In addition, gene-expression-based biomarkers were transferred between different gene expressions measurement methods with the result that signatures showed less variability in patient stratification than single-gene biomarkers.:Abbreviations VII Figures IX Tables XII 1 Introduction 1 2 Biological & Statistical Background 4 2.1 Head and Neck Squamous Cell Carcinoma 4 2.1.1 Tumorigenesis 4 2.1.2 Biomarkers 8 2.2 Statistics 14 2.2.1 Survival analysis 14 2.2.2 Model and data evaluation 18 2.2.3 Data sampling methods 22 2.3 Machine learning algorithms 23 2.3.1 Feature selection algorithms 24 2.3.2 Prognostic models 27 2.4 Gene expression measurement methods 30 2.4.1 Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 31 2.4.2 nCounter® gene expression 32 2.4.3 In situ-synthesized oligonucleotide microarrays 32 3 Material and methods 35 3.1 Patient cohorts 35 3.1.1 Primary radiochemotherapy (pRCTx) cohorts 35 3.1.2 Postoperative radio(chemo)therapy (PORT-C) cohorts 36 3.1.3 Clinical endpoints 38 3.2 Gene expression analyses 39 3.2.1 HPV status 39 3.2.2 Immunohistochemical staining 39 3.2.3 RT-PCR measurements 40 3.2.4 nCounter® measurements 40 3.2.5 GeneChip® analyses (only training cohorts) 41 3.3 Machine learning framework 41 3.3.1 Pre-processing of gene expression data 41 3.3.2 Determination of the ensemble gene signature 42 3.3.3 Expanding the ensemble signature by highly correlated genes 43 3.3.4 Independent validation and patient stratification 45 4 Identification of gene expression signatures as prognostic biomarkers 46 4.1 Hypoxia classification 46 4.2 nCounter® gene expression based signatures 50 4.2.1 Patients treated with primary radiochemotherapy 50 4.2.2 Clinical Features 55 4.2.3 Signature extension using clinical features 64 4.2.4 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 65 4.2.5 Signature extension using clinical features – Port-C 72 4.3 GeneChip® gene expression-based signatures 78 4.3.1 Pre-selection 78 4.3.2 Patients treated with primary radiochemotherapy 79 4.3.3 Patients treated with postoperative radiochemotherapy 87 4.4 Combined models for PORT-C 91 4.4.1 Creation of a consensus model 92 4.4.2 Consensus model based on 2 models 93 4.4.3 Consensus model based on more than 2 models 97 4.4.4 Discussion and summary of model combination 101 5 Stability of gene expression-based biomarkers 102 5.1 Reproducibility depending on time of nCounter® 102 5.2 Comparison of nCounter® and GeneChip® gene expression 106 5.2.1 Introduction 106 5.2.2 Correlation analyses 106 5.2.3 Model and biomarker transfer 108 6 Conclusion and outlook 123 Zusammenfassung 125 Summary 128 Appendix 130 A. Supplementary Figures 130 B. Supplementary Tables 133 Bibliography 147 Acknowledgements 188 Erklärungen 189

An uncommon case with semi-spheric perivesical calcification after pelvic radiotherapy is reported and the possible pathogenesis of this phenomenon is discussed. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Hintergrund Die strahlentherapeutische Behandlung von Krebserkrankungen erfolgt zurzeit hauptsächlich durch eine Bestrahlung mit hochenergetischen Photonen und Elektronen aus kompakten Therapie-Linearbeschleunigern. Seltener werden auch Protonenstrahlen eingesetzt. Diese besitzen gegenüber Photonen und Elektronen vorteilhaftere physikalische und strahlenbiologische Eigenschaften, die besonders bei der Bestrahlung von tiefliegenden Tumoren in der Nähe von lebenswichtigen, strahlenempfindlichen Organen von Bedeutung sind. Die Behandlung mit Protonen erfordert jedoch sehr große und teure Bestrahlungsanlagen, weshalb es weltweit bisher nur ca. 50 solcher Anlagen an großen Zentren gibt. In den letzten Jahren wurde das völlig neuartige Prinzip der Teilchenbeschleunigung durch Hochleistungslaser soweit entwickelt, dass eine medizinische Anwendung zur Krebstherapie vorstellbar ist. Die laserbasierte Teilchenbeschleunigung verspricht deutlich kompaktere und kostengünstigere Protonenbeschleuniger, erzeugt jedoch im Unterschied zu herkömmlichen Beschleunigern sehr kurze (~ps) hochintensive Protonenpulse mit großer Strahldivergenz und breitem Energiespektrum. Im Rahmen des Verbundprojektes onCOOPtics wird die klinische Anwendbarkeit derartiger laserbeschleunigter Protonenstrahlen untersucht, was nicht nur die Entwicklung des notwendigen Laser-Teilchen-Beschleunigers, sondern auch die Entwicklung eines geeigneten Strahlführungssystems beinhaltet.

In-beam Positron Emission Tomography (PET) is a system for monitoring high precision radiation therapy which is in the most cases applied to the tumors near organs at risk. High quality and fast availability of in-beam PET images are, therefore, extremely important for successful verification of the dose delivery. Two main problems make an in-beam PET monitoring a challenging task. Firstly, in-beam PET measurements result in a very low counting statistics. Secondly, an integration of the PET scanner into the treatment facility requires significant reduction of the sensitive surface of the scanner and leads to a dual-head form resulting in imaging artifacts. The aim of this work is to bring the imaging process by means of in-beam PET to optimum quality and time scale. The following topics are under consideration: - analysis of image quality for in-beam PET; - image reconstruction; - solutions for building, testing, and integration of a PET monitoring system into the dedicated treatment facility.

Die Therapie von Wirbelsäulenmetastasen ist durch den demographischen Wandel der Bevölkerung und der damit einhergehenden erhöhten Inzidenz und Prävalenz von immer größerer Bedeutung. Diese Studie befasste sich mit der kombinierten Behandlung aus chirurgischer Intervention und postoperativer Radiatio sowie deren Auswirkungen auf die Wundheilung. Dabei stand einerseits die Identifizierung individueller Risikofaktoren für das Auftreten von postoperativen Wundkomplikationen im Vordergrund. Andererseits untersuchten wir die zeitliche Relation beider Interventionen in der Patientenkohorte, um daraus eine Empfehlung für das optimale Timing der postoperativen Radiatio abzuleiten und das Auftreten von Wundheilungsstörungen damit zukünftig zu minimieren.