Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-11T14:07:03Z No. of bitstreams: 1 Jailton_Azevedo Silva Junior. Impacto da vacina...2015.pdf: 2256825 bytes, checksum: 6da623ba97a2d68604f3b4a098585b07 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-11T14:07:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Jailton_Azevedo Silva Junior. Impacto da vacina...2015.pdf: 2256825 bytes, checksum: 6da623ba97a2d68604f3b4a098585b07 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-11T14:07:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jailton_Azevedo Silva Junior. Impacto da vacina...2015.pdf: 2256825 bytes, checksum: 6da623ba97a2d68604f3b4a098585b07 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO: Em 2010, a vacina conjugada 10-valente (PCV10) foi incorporada ao programa nacional de imunizações (PNI) brasileiro. Este imunobiológico confere imunização contra os dez principais tipos capsulares de Streptococcus pneumoniae, patógeno responsável por diversas manifestações clínicas e com elevada contribuição nas taxas de incidência e mortalidade por meningite, que é a condição clínica mais grave. OBJETIVO: O presente estudo teve como objetivo avaliar o impacto da PCV10 na epidemiologia da meningite pneumocócica na região metropolitana de Salvador (RMS) Bahia, comparando o período anterior (2008-2010) e posterior (2011-2013) a sua utilização, bem como realizar uma caracterização molecular minuciosa a partir de uma série histórica (1996-2012) entre os isolados resistentes a penicilina (PNSSP com CIM≥ 0,125 μg/mL) e para os sorotipos não-vacinais (2008-2012). MATERIAL E MÉTODOS: Foram incluídos todos casos de meningite pneumocócica confirmados laboratorialmente no período entre 1996 a 2013. Taxas de incidência para a Salvador e RMS foram calculadas com base nos dados populacionais do IBGE/2010. A determinação do tipo capsular foi realizada através da técnica de Multiplex-PCR e/ou reação de Quellung. A sensibilidade a nove antimicrobianos foi testada através das técnicas disco-difusão, microdiluição e E-test. Para caracterizar o perfil molecular foram aplicadas as técnicas de genotipagem de PFGE e MLST. RESULTADOS: Um total de 939 casos de meningite pneumocócica foram identificados no período de 1996- 2013, sendo que 70 casos ocorrem entre 2011 a 2013 (período pós-vacinal). A incidência de meningite pneumocócica em todas as faixas etárias na RMS reduziu de 0,70 casos/100.000 habitantes para 0,59 casos/100.000 habitantes considerando o período de três anos antes e após a vacinação com PCV10 [p< 0,05; RR IC 95%: 1,46 (1,03-2,05)]. Esta redução foi significativa na faixa etária de 0-2 anos e nos casos por sorotipos relacionados à PCV10. Não houve aumento significativo de casos por sorotipos não vacinais nesta casuística, apesar do surgimento de casos por sorotipos não-vacinais não detectados anteriormente na série histórica de MP (10F, 21, 22F, 15A e 24F). Os isolados resistentes à penicilina analisados na série histórica se restringiram a 13 sorotipos, entre os quais: 14 (45,1 %; 78/173), 23F (19,1%; 33/173), 6B (14,4 %; 25/173), 19F (9,2 %; 16/173) e 19A (5,2 %; 9/173). 94% dos casos nãosusceptíveis à penicilina (PNSSP) foram de sorotipos vacinais. Os grupos clonais caracterizados pelo PFGE/MLST predominantes ao longo dos anos foram representados pelo sorotipo 14, denominado grupo A/ST 66 [35,3 % (61/173)] e grupo GK/ST 156 [4.6 % (8/173)], este último associado com níveis elevados de resistência a penicilina e ceftriaxona. Não foram detectados grupos clonais emergentes associados a tipos capsulares não-vacinais. CONCLUSÕES: Estes achados sugerem que a introdução da PCV10 modificou a epidemiologia da meningite pneumocócica na população estudada. / INTRODUCTION: In 2010, the 10-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV10) was introduced into the Brazilian national immunization program (NIP). This immunobiological provides immunization against the main ten capsular types of Streptococcus pneumoniae, the pathogen responsible for different clinical manifestations and high contribution in the incidence and mortality from meningitis, which is the most severe clinical condition. OBJECTIVE: This study aimed to evaluate the impact of PCV10 in the epidemiology of pneumococcal meningitis in the metropolitan area of Salvador (RMS) Bahia, comparing the previous (2008-2010) and after (2011-2013) periods its use, as well as conduct a thorough molecular characterization from a historical series (1996-2012) among isolates resistant to penicillin (PNSSP with CIM≥ 0.125 g / ml) and nonvaccine serotypes (2008-2012). MATERIAL AND METHODS: We included all cases of pneumococcal meningitis laboratory confirmed for the period 1996 to 2013. Incidence rates for Salvador and RMS were calculated based on population data from IBGE/2010. The capsular type determination was performed by multiplex PCR and/or Quellung reaction. Isolates Nine antibiotics were tested by disk-diffusion test, broth micro-dilution and E-test. To characterize the molecular profiling techniques were applied genotyping PFGE and MLST. RESULTS: A total of 939 cases of pneumococcal meningitis were identified during 1996-2013 period, with 70 cases occurring between 2011-2013 (post-vaccination period). The incidence of pneumococcal meningitis in all age groups in the RMS decreased from 0.70 cases / 100,000 inhabitants to 0.59 cases / 100,000 inhabitants considering the three-year period before and after vaccination with PCV10 [p <0.05; RR 95% CI: 1.46 (1.03 to 2.05)]. This reduction was significant in the age group 0-2 years and in cases by serotypes related to PCV10. There was no significant increase in cases by serotypes not vaccine in this series, despite the emergence of cases by serotypes not-vaccine previously undetected in the historical series of MP (10F, 21, 22F, 15A and 24F). The penicillin resistant isolates analyzed the historical series were restricted to 13 serotypes, including: 14 (45.1%; 78/173), 23F (19.1%; 33/173), 6B (14.4%; 25/173), 19F (9.2%, 16/173) and 19A (5.2%, 9/173). 94% of nonsusceptible to penicillin cases (PNSSP) were vaccine serotypes. Clonal groups characterized by PFGE / MLST predominant over the years have been represented by serotype 14, group called A / ST 66 [35.3% (61/173)] and Group GK / TS 156 [4.6% (8/173) ], the latter associated with elevated levels of penicillin and ceftriaxone resistance. Not were detected emerging clonal groups associated with capsular types non-vaccination. CONCLUSIONS: These findings suggest that the introduction of PCV10 changed the epidemiology of pneumococcal meningitis in the population studied.

As infecções do trato respiratório inferior lideram entre as principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. Um dos grandes problemas associados ao tratamento das infecções do sistema respiratório, como as pneumonias, advém da crescente resistência aos mais modernos antibióticos adquirida pelos microrganismos. A terapia fotodinâmica, uma técnica baseada na interação da luz com uma substância fotoativa para causar dano oxidativo a células, tem se destacado como uma interessante alternativa para diversas doenças como diferentes tipos de câncer e infecções. Neste trabalho foi realizada, com experimentos in vitro, uma prova de princípio da possibilidade de inativar, com um protocolo eficiente e seguro, uma das bactérias mais comumente encontradas em quadros de pneumonia, a Streptococcus pneumoniae, com terapia fotodinâmica infravermelha mediada pela indocianina verde. Duas fontes de luz, uma a base de lasers emitindo 780 nm e outra construída com LEDs emitindo 850 nm, foram comparadas para avaliar sua eficiência. Experimentos com a bactéria foram realizados para determinação dos melhores parâmetros de inativação microbiana. Em seguida, ensaios de citotoxicidade foram feitos com macrófagos RAW 264.7 com o intuito de averiguar se as condições microbicidas não apresentavam atividade tóxica para células fagocitárias do sistema imune. Foi possível delinear os parâmetros de concentração de indocianina, tempo de incubação e dose de luz que apresentassem atividade microbicida e que não fossem tóxicas para as células. A interação da terapia fotodinâmica com a ação fagocitária dos macrófagos sobre as bactérias foi avaliada pelo estabelecimento de co-cultura dessas espécies. Concluiu-se que, utilizando-se LEDs de 850 nm fornecendo uma dose de luz de 10 J/cm2 as amostras contendo indocianina verde 5&mu;M, é possível inativar S. pneumoniae de modo eficiente e auxiliar a ação fagocitária de macrófagos. / The lower respiratory tract infections lead among the main causes of morbidity and mortality worldwide. A major problem associated with respiratory tract infections, e.g. pneumonia, stems from from the increasingly resistance to most modern antibiotics developed by microorganisms. Photodynamic therapy, a technique based on the interaction of light and a photoactive substance to cause oxidative damage to cells, has emerged as an attractive alternative for several diseases such as different kinds of cancer and infections. In this work, with in vitro experiments, we accomplished a proof of concept for the possibility of inactivating, with an efficient and secure protocol, one of the most commonly found bacteria in pneumonia cases, Streptococcus pneumoniae, with infrared photodynamic therapy mediated by indocyanine green. Two light sources, one based on 780 nm lasers and the other built with 850 nm LEDs, were compared to evaluate their efficiency. Experiments with bacteria determined the best parameters microbial inactivation. Then, cytotoxicity assays with RAW 264.7 macrophages analyzed if the microbicidal parameters had toxic effects on immune cells. It was possible to delineate the indocyanine concentration parameters, incubation time and dose of light to obtain microbicidal results that weren´t toxic to the cells. Interaction of photodynamic therapy with the phagocytic action of macrophages on the bacteria was assessed by establishing a co-culture with these species. We concluded that, using 850 nm LEDs providing a light dose of 10 J/cm2 to samples containing 5&mu;M indocyanine green, it is possible to inactivate S. pneumoniae and efficiently assist the phagocytic action of macrophages.

Orientador: Pedro Luiz Rosalen / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T06:14:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_LucianaSallesBrancode_M.pdf: 997625 bytes, checksum: 22585531caf6213f9ef4a62e5b018a3b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este estudo avaliou a atividade antimicrobiana de extratos da Rheedia brasiliensis contra Streptococcus mutans e o potencial anticárie do seu composto ativo isolado. Os extratos hexânicos (EH), acetato de etila e etanólico (concentrações entre 6,25-800 µg/ml) do fruto (¿bacupari¿) foram testados contra S. mutans UA159 por meio de determinação das concentrações inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM). Biofilmes de 5 dias de formação foram tratados com os extratos ativos (100 x CIM), por 0, 1, 2, 3 e 4 h, e plaqueados para contagem das UFC/ml (time kill). Os extratos ativos foram submetidos à análise química por métodos espectroscópicos, e o composto ativo isolado (0,625-80 µg/ml) foi testado contra células de S. mutans por meio de CIM/CBM. A influência do composto isolado (12,5-100 µg/ml) sobre a síntese de glucanos foi avaliada através da atividade da enzima glucosiltranferase (GTF) B em superfície de hidroxiapatita. A ação do composto sobre biofilmes (125 e 250 µg/ml) foi testada com os ensaios de queda de pH e inibição de formação de biofilme. O potencial anticárie do composto (250 µg/ml) foi avaliado em ratas Wistar sob alto desafio cariogênico. Os EH (casca e semente) inibiram S. mutans em baixas concentrações (CIM:12,5-25 µg/ml) e reduziram células viáveis dos biofilmes após 4 h de exposição. O composto ativo presente foi identificado como a 7- epiclusianona (7-epi), a qual inibiu o crescimento do S. mutans (CIM:1,25-2,5 µg/ml), a atividade da GTF B em superfície (48% de inibição) e a produção de ácidos do S. mutans em biofilme, porém não reduziu a formação e o acúmulo dos biofilmes. No estudo animal, a 7-epi reduziu a incidência e a severidade de cárie e a microbiota total, mas não diminuiu a porcentagem de S. mutans. A 7-epi diminuiu a virulência do S. mutans e inibiu o desenvolvimento de cárie in vivo, sugerindo ser um agente terapêutico promissor para o controle do biofilme dental cariogênico. Palavras-chave: Rheedia brasiliensis, 7-epiclusianona, Streptococccus mutans, fatores de virulência, cárie animal / Abstract: The present study evaluated the antimicrobial activity of Rheedia brasiliensis extracts against Streptococcus mutans and the anticaries properties of its isolated bioactive compound. Hexane (HE), ethyl-acetate and ethanolic extracts (concentrations ranging from 6.25 to 800 µg/ml) of R. brasiliensis fruits (¿bacupari¿) were tested against S. mutans UA159 by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC). S. mutans 5-days-old biofilms were treated with active extracts (100 x MIC), for 0, 1, 2, 3 e 4 h (time-kill), and plated for colony counting (UFC/ml). Such extracts were submitted to exploratory chemical analyses to isolate and identify the bioactive compound using spectroscopic methods. The compound (0.625-80 µg/ml) was then tested against S. mutans cells using MIC/MBC assays. The influence of the bioactive compound (12.5-100 µg/ml) on glucans synthesis was evaluated by testing the activity of glucosyltranferase (GTF) B on hydroxyapatite surface. The effects of the compound (125 e 250 µg/ml) on biofilms were analyzed using glycolytic pH-drop and inhibition of formation assays. The anticaries activity of such compound (250 µg/ml) was evaluated in Wistar rats submitted to a high cariogenic challenge. HE (peel and seeds) reduced S. mutans cells at low concentrations (MIC:12.5-25 µg/ml) and also biofilm viability after four hours, confirming the presence of the bioactive compound. This compound was identified as 7-epiclusianone (7-epi), which inhibited the S. mutans growth (MIC:1.25-2.5 µg/ml), the activity of GTF B (48% of inhibition) and the acid production, not interfering with the formation and accumulation of biofilms. In the animal study, 7-epi additionally reduced the incidence and severity of caries and also the total microbiota, however no reduction on the percentage of S. mutans was observed. In conclusion, 7-epi may be considered a promising agent to control cariogenic dental biofilm. Keywords: Rheedia brasiliensis, 7-epiclusianone, Streptococccus mutans, virulence factors, animal caries / Mestrado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Mestre em Odontologia

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Orientador: Jaime Aparecido Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:16:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CcahuanaVasquez_RenzoAlberto_D.pdf: 3034196 bytes, checksum: 00640a6cb63bb31d61a9ad6b5692b87c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Modelos in vitro e in situ tem sido desenvolvidos para o estudo do biofilme dental. Protocolos que simulem episódios de "fartura-miséria" quando açúcares da dieta estão presentes na cavidade bucal e permitam avaliação de cárie dental são necessários. Por outro lado, poucos estudos da expressão gênica de biofilmes formados in situ foram realizados. Assim, este trabalho teve como objetivos: Desenvolver e validar um modelo de formação de biofilme de S. mutans que simule episódios de "fartura-miséria" e permita avaliar mudanças no biofilme, e desmineralização do esmalte dental. Também, avaliar o efeito da sacarose na expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA de biofilme dental formado in vitro e in situ. Para os primeros objetivos, biofilmes de S. mutans UA159 cresceram durante 5 dias sobre blocos de esmalte bovino a 37oC, 10% CO2, em meio de cultura ultrapurificado, sendo avaliado: o efeito de concentração (1 a 20%) de sacarose e da freqüência (0 a 8x/dia) de exposição à sacarose. O efeito da clorexidina (0, 012 a 0,12%) 2x/dia e de NaF 0,05% foram testados para validar o modelo. Foram determinadas: viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme, biomassa e polissacarídeos; e a desmineralização do esmalte. Para o último objetivo, no estudo in vitro biofilmes de S. mutans UA159 cresceram nas mesmas condições acima citadas e foram expostos à sacarose 1% constante (controle) ou sacarose 10% 8x/dia (grupo intermitente) e após 48, 72 e 120 h os biofilmes foram coletados para análise gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. No experimento in situ, um estudo cruzado de 2 fases experimentais de 7 dias foi realizado, com 9 voluntários que usaram um dispositivo palatino contendo 12 blocos de dentina que foram submetidos 8x/dia a soluções de sacarose de 1, 5, 10 e 20%. No final, os biofilmes foram coletados para análise microbiológica, bioquímica e de expressão gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. Os resultados de padronização mostraram que as concentrações de sacarose de 10% e 20% e a frequência 8x/dia provocam mudanças no biofilme e na demineralização similares ao controle. Clorexidina mostrou efeito dose resposta, diminuindo biomassa, viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme e demineralização do esmalte, NaF 0,05% não mostrou atividade antimicrobiana, mas apresentou similar efeito a clorexidina 0,12% na redução da desmineralização. Para o último objetivo, os resultados in vitro do grupo intermitente mostraram que a expressão de genes analisados parece ser constante enquanto que no controle a expressão desses genes incrementou-se em função ao tempo. No estudo in situ, o incremento da concentração de sacarose aumentou os valores de peso úmido do biofilme, lactobacilos e polissacarídeos extracelulares do biofilme. Quanto a expressão gênica, só foi possível quantificar o gtfB e não apresentou diferenças entre os grupos. Em conclusão, o modelo in vitro apresenta potencial para avaliar o efeito antimicrobiano de substâncias sobre biofilmes e desmineralização dental. A quantificação da expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA foi possível in vitro, mas in situ somente a expressão de gtfB foi determinada e não parece ser regulada pela concentração de sacarose. / Abstract: In vitro and in situ models have been developed to study dental biofilms. Protocols, that simulate the alternations of "feast or famine" episodes that happen in oral environment in the presence of dietary carbohydrates and allowing dental caries evaluation, are necessaries. On the other hand, few studies about gene expression of dental biofilm formed in situ were performed. Thus, the objectives of this research were: To develop and to validate a model of S. mutans biofilm formation simulating 'feast-famine' episodes that allows biofilms and dental demineralization changes assessment. Also, to evaluate the effect of sucrose exposure on expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA of in vitro and in situ dental biofilms. For the first objectives, S. mutans UA159 biofilms were grown during 5 days on bovine enamel slabs at 37oC, 10% CO2 in ultra-purified culture media. To develop the model, the effect of sucrose concentration (1 - 20%) 8x/day and frequency (0 - 8x/day) exposure were evaluated and to validate the model, chlorhexidine (CHX) effect (0.012- 0.12%) 2x/day was tested. Bacterial viability, biofilm acidogenicity, biomass and polysaccharides were determined, and enamel demineralization was evaluated by surface hardness loss. To the last objective, for in vitro study, S. mutans UA159 biofilms were grown in the same conditions of previous experiments and were exposed to 1% sucrose constantly (control) or 10% sucrose 8x/day (intermittent group) and after 48, 72 and 120 h the biofilms were collected for analysis. For in situ experiment, a crossover study was conducted in two phases of 7 days each, with nine volunteers that wore intraoral palatal appliances containing 12 dental dentin slabs, which were extra orally submitted 8 times/day to sucrose solutions of 1%, 5%, 10% and 20% . On the 7th day, biofilms were collected for analysis. RNA from the in vitro and in situ biofilms were extracted and purified. Gene expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA were evaluated by real time PCR. In vitro development and validation results showed that 10% and 20% sucrose concentrations and frequency 8x/day provoked biofilm and enamel demineralization changes similar to control group. CHX showed dose-response effect decreasing biomass, bacterial viability and enamel demineralization (p<0.05). Also, 0.05% NaF did not show antimicrobial effect but had similar effect than 0.12% CHX decreasing enamel demineralization (p<0.05). With regard to gene expression of in vitro experiment, gene expression of intermittent group was constant along the time. In situ results showed that biofilm wet weight, lactobacillus, extracellular polysaccharides values of the biofilm increased according to the increase of sucrose exposure. No differences for gtfB gene expression between the groups were observed (p<0.05) and no levels of gtfC, gtfD and dexA were detected. In conclusion, the model developed and validated has potential to assess substances with antimicrobial effect on biofilm and dental demineralization. Quantification of gtfB, gtfC, gtfD and dexA gene expression levels were possible for S. mutans biofilms in vitro study but only gtfB gene expression of in situ study can be determined and was not regulated by sucrose concentration. / Doutorado / Cariologia / Doutor em Odontologia

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / The aim of the present study was to find a relation between salivary peptides, caries experience and mutans streptococci (MS) levels in saliva of caries free (CF) and caries susceptible (CS) children in early childhood. One hundred and six 10 â 71 month-old children participated in the study. Fifty-eight children were CF and 48 who had experienced dental caries formed the CS group. Two samples of whole saliva were collected from all participants. Unstimulated whole saliva was collected, subsequently centrifuged. Supernatants were lyophilized, divided into two pools (CF and CS) and individual samples, and stored at -20oC for posterior analysis using LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) to study the peptide profile. Identification of salivary peptides was based on theoretical molecular masses available from online databases. Stimulated whole saliva was collected and used for MS detection in MSB agar medium. MS concentration in saliva was reported in cfu/mL. Dental examination was performed and dmfs/dmft scores were calculated. Data was analysed by using logistic regression. The chromatograms from CF and CS pools of saliva had different peak patterns. The identification of molecular masses suggested the presence of 9 peptides. Three of them were significantly related with caries experience. The presence of HNP-3 (&#945;-defensin 3) (p = 0.019) and HBD-3 (&#946;-defensin 3) (p = 0.034) reduced the chances of experiencing early childhood caries (ECC). The presence of PRP IB-4 significantly increased caries experience (p = 0.035). In addition, age (p = 0.020) and MS counts (p = 0.036) increased caries experience, however gender was not associated with dental caries (p = 0.877). Our results suggest that presence of specific peptides in saliva of CF or CS children in early childhood predisposes to a higher or lower risk of caries experience. / Este trabalho buscou estudar o perfil de peptÃdeos salivares de crianÃas com cÃrie da primeira infÃncia, relacionando-o com nÃveis de estreptococos do grupo mutans (EGM) salivares e experiÃncia de cÃrie. Cento e seis crianÃas, na faixa etÃria de 10 a 71 meses de idade, participaram do estudo, sendo 48 com experiÃncia de cÃrie e 58 sem cÃrie da primeira infÃncia. Duas amostras de saliva total foram coletadas de todos os participantes. A primeira amostra era composta de saliva nÃo estimulada, utilizada para anÃlise dos peptÃdeos. ApÃs coletada, essa saliva foi centrifugada, o sobrenadante retirado, liofilizado, dividido em pools com cÃrie, sem cÃrie e em amostras individuais e armazenado em freezer a -20oC atà anÃlise em aparelho de LC-MS (Cromatografia LÃquida acoplado ao EspectrÃmetro de Massa). A busca por peptÃdeos foi baseada em massas conhecidas de peptÃdeos existentes em bancos de dados. Saliva estimulada representou a segunda coleta, utilizada para o cultivo dos EGM (UFC/mL) em meio Ãgar mitis salivarius bacitracina (MSB). Anamnese e exame dentÃrio foram realizados para cÃlculo do Ãndice ceo-s e ceo-d. Os dados foram analisados por meio de modelo logÃstico binÃrio. Resultados foram considerados significantes quando p-valor < 0,05. Os cromatogramas obtidos a partir dos pools de crianÃas com/sem cÃrie apresentaram diferenÃas em relaÃÃo aos picos apresentados. A identificaÃÃo das massas moleculares sugeriram a presenÃa de nove peptÃdeos. RegressÃo logÃstica mostrou que 3 peptÃdeos se relacionaram com experiÃncia de cÃrie. PRP IB-4 associou-se a um aumento de experiÃncia de cÃrie (p=0,035); &#945;-defensina 3 (p=0,019) e &#946;-defensina 3 (p=0,034) associaram-se à reduÃÃo de experiÃncia de cÃrie. Em adiÃÃo, aumento na idade (p=0,020) e aumento na contagem de EGM (p=0,036) ocasionaram um aumento na experiÃncia de cÃrie, mas sexo nÃo se relacionou com cÃrie dentÃria (p=0,877). A partir desses resultados, pÃde-se concluir que a presenÃa de peptÃdeos especÃficos na saliva de crianÃas com e sem cÃrie dentÃria predispÃem a um maior ou menor risco à essa doenÃa.

nÃo hà / O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro e in situ os efeitos de um agente de limpeza cavitÃria a base de digluconato de clorexidina a 2% (CHX) na desinfecÃÃo de dentina cariada, bem como determinar a susceptibilidade de diferentes espÃcies a este agente antimicrobiano. Setenta blocos de dentina humana foram distribuÃdos de forma aleatÃria e submetidos a desafio cariogÃnico por um mÃtodo microbiolÃgico in vitro (n=15), bem como um in situ (n=20). No estudo in vitro, 30 blocos de dentina foram imersos por 5 dias, em caldo BHI inoculado com Streptococcus mutans, para induÃÃo de cÃrie. No estudo in situ, 20 voluntÃrios usaram dispositivos palatinos contendo dois blocos de dentina, que foram gotejados com soluÃÃo de sacarose 40%, 10 vezes ao dia, durante 14 dias. Ao final de cada perÃodo experimental, os blocos de dentina foram divididos aleatoriamente em dois grupos: Controle (soluÃÃo de NaCl a 0,9%) e CHX. Amostras de dentina infectada foram coletadas antes e 5 min apÃs cada tratamento, em seguida, as bactÃrias foram cultivadas e os microorganismos contados. Foram avaliados os seguintes microorganismos: estreptococos mutans in vitro e in situ, estreptococos totais, microorganismos viÃveis totais e lactobacilos, in situ. A reduÃÃo microbiana promovida por cada tratamento foi calculada e comparada entre os grupos pelo teste t, a susceptibilidade dos microorganismos isolados in situ foi comparada pela anÃlise de variÃncia ANOVA (&#61537;= 5%). A reduÃÃo microbiana promovida pela CHX foi significativamente maior quando comparada ao grupo controle para todos os microorganismos avaliados tanto in vitro quanto in situ. No entanto, nÃo houve diferenÃa na susceptibilidade dos vÃrios microorganismos avaliados. Desta forma, a CHX foi capaz de reduzir a populaÃÃo microbiana em dentina infectada, sugerindo que esta abordagem pode ser uma ferramenta auxiliar para desinfecÃÃo de dentina cariada residual suprimindo o crescimento de microorganismos associados ao desenvolvimento de cÃrie.

O Streptococcus pneumoniae, também conhecido como pneumococo, é um importante agente etiológico causador de pneumonia, bacteremia, meningite e otite aguda do ouvido médio, acometendo especialmente crianças e idosos. A cápsula polissacarídica (PS) é o fator de virulência mais importante e localiza-se na superfície do microrganismo e tem ação anti-fagocítica in vivo. O pneumococo expressa pelo menos 91 cápsulas diferentes, que são química e sorologicamente distintas. Usualmente, a cápsula é o antígeno das vacinas anti-pneumocócicas, tanto como polissacarídeo livre ou conjugado a proteínas. O sorotipo 6B acomete principalmente crianças e é o segundo mais prevalente no Brasil, e a otimização das condições de cultivo buscando maior produtividade em PS é o alvo desta tese. Simultaneamente, também foi investigada a influência do inóculo e da glicose residual no instante do pulso ou do início da alimentação em cultivos descontínuos alimentados. Nos cultivos descontínuos alimentados foi observado que quanto menor a densidade óptica da cultura do inóculo, maior a concentração de PS obtida. A concentração da glicose residual no momento do pulso provavelmente influenciou a produção de PS: a produção foi maior quando o pulso foi dado ainda em altas concentrações de substrato. Por isso, obteve-se uma produção de PS ~390 mg/L em cultivo descontínuo alimentado com pulso, quando DO 600 nm da cultura do inóculo ~1,6 e o pulso de glicose e acetato de amônio ~15 g/L. Observou-se também que, mesmo com DO do inóculo ~1,65, a produção de PS foi somente 248 mg/L, devido à aplicação do pulso quando a concentração de glicose residual era ~4,5 g/L. A menor produção de PS foi obtida quando a DO da cultura do inóculo foi ~2,6 e a concentração de glicose residual ~3,4 g/L, gerando somente 194 mg/L de PS. Assim, cultivos descontínuos alimentados com pulso renderam melhores resultados que os cultivos descontínuos alimentados. A alimentação constante rendeu maior quantidade de PS quando comparada à alimentação exponencial. E tanto os ensaios descontínuos com ou sem pulso e os descontínuos alimentados foram melhores do que os cultivos contínuos, principalmente se considerarmos a facilidade de operação. O efeito da concentração residual da glicose no instante da alimentação na produção de PS é provavelmente influenciado pela presença de outros componentes do meio, devido aos requerimentos nutricionais do pneumococo. O estado fisiológico do inóculo determinou uma importante correlação entre a produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados do sorotipo 6B: cultura do inóculo no meio da fase exponencial rendeu maior produção de PS. Esta correlação poderia ser conseqüência do perfil de crescimento do microrganismo in vitro e da ação de enzimas líticas após a fase exponencial. Foi observado, portanto, um efeito sinérgico entre a DO da cultura do inóculo, a concentração de glicose residual no momento de alimentação e produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen commonly responsible for pneumonia, bacteraemia, meningitis and otitis media, especially among young children and older adults. The most prominent pneumococcal virulence factor is the capsular polysaccharide (PS), which coats the surface of the bacterium and acts as an antiphagocytic factor in vivo. S. pneumoniae express at least 91 distinct capsules which are chemically and serologically distinct. The capsule is currently used as antigen in pneumococcal vaccines, either as free polysaccharide or conjugated to proteins. Pneumococcal serotype 6B is the second most prevalent in Brazil and the optimization of cultivation conditions is part of this study. Simultaneously we investigated the influence of the growth phase of the inoculum and the residual glucose concentration at the instant of the pulse or the start of feeding on PS production in batch and fed-batch cultivation. Streptococcus pneumoniae serotype 6B strain ST 433/03 was used. Bench scale experiments were carried out using a variant of the Hoeprich medium, containing glucose, acid-hydrolyzed casein, dialyzed yeast extract, L-glutamine and asparagine as nitrogen sources, choline as a growth factor and salts. The experiments were conducted in bioreactors monitored by the LabView 7.1program. It was observed in fed-batch cultivation, that the lower was the OD of the starter culture, the higher was the PS concentration obtained. The residual glucose concentration at the moment of the pulse also influenced the PS production: the PS production was higher when the pulse was given at higher residual glucose concentration. Hence, in fed-batch culture the highest PS production (387 mg/L) was obtained using an OD=1.6 of the starter culture and giving the pulse when the residual glucose was ~15 g/L. Using a similar inoculum (OD=1.65), the PS concentration reached 248 mg/L after giving the pulse when the residual glucose was 4.5 g/L. The lowest PS production was obtained when a culture with an OD=2.6 was inoculated into the reactor and the pulse was given when the residual glucose was 3.4 g/L (PS=194 mg/L). The effect of the residual glucose concentration at the instant of the start of feeding on PS production was probably influenced by the presence of other components in the concentrated feeding medium, which could better fit the nutritional requirements of the microorganism. The physiological state of the inoculum showed an important correlation to the PS production in batch and fed-batch cultivation of S. pneumoniae serotype 6B: mid-log phase inocula yielded high PS production. This correlation is consequence of the in vitro growth profile, the action of lytic enzymes after the log phase. In fed-batch cultivation, it was also observed a synergic effect of the inoculum OD and the residual glucose concentration in the moment of the pulse on PS production.

O surgimento de resistência bacteriana aos tratamentos convencionais tem proporcionado o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento e/ou controle da cárie dentária. Nesse contexto, a utilização da terapia fotodinâmica (TFD) é sugerida como alternativa para a inativação de microrganismos patogênicos envolvidos na gênese da cárie. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) sobre três culturas de S. mutans: uma cepa padrão de S. mutans (ATCC 25175) e dois isolados clínicos (43513 e 47513) oriundos da saliva de crianças. O corante (C) azul de orto-toluidina (TBO) foi utilizado associado à iluminação com LEDs (L) no comprimento de onda vermelho. Estas suspensões foram transferidas para placas de 96 orifícios, tratadas com quatro concentrações de TBO (0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL) e expostas a quatro dosimetrias (12; 24; 36 e 48 J/cm2) constituindo o grupo C+L+ (TFD). Suspensões adicionais foram tratadas somente com as quatro concentrações de TBO (C+L-) ou apenas com as quatro dosimetrias (C-L+). Amostras não submetidas ao tratamento com a fonte de luz nem ao corante, constituíram a condição C-L- (controle positivo). Alíquotas de 100 µL de cada orifício foram transferidas para tubos de ensaio para se verificar a presença ou ausência de crescimento microbiológico. Adicionalmente, alíquotas de 25 µL do grupo correspondente a TFD (C+L+) foram semeadas em placas de Petri, as quais foram incubadas a 370C por 48 horas para posterior visualização de halos de inibição e/ou crescimento microbiológico correspondente a efetividade ou ineficiência da TFD, respectivamente. Com o intuito de confirmar os achados, essas mesmas amostras foram submetidas à análise pela microscopia confocal a laser. Os resultados demonstraram que a TFD, em determinadas condições experimentais, foi efetiva no controle do crescimento microbiológico das espécies de S. mutans usadas neste estudo. A concentração mínima de TBO necessária para a inativação in vitro das três culturas de S. mutans foi de 2,5 µg/mL associada à dosimetria mínima de 24 J/cm2 da fonte de luz LED utilizada no estudo. / The increase of bacterias resistance to conventional treatment resulted in the development of new therapeutic modalities for dental caries treatment and/or prevention. In this field, the use of photodynamic therapy (PDT) is suggested as an alternative for inactivation of patogenic microrganisms involved in the etiology of tooth decay. The aim of this study was to evaluate in vitro the antimicrobian effect of the photodynamic therapy (PDT) on bacteria suspensions of S. mutans (ATCC 25175) and two suspensions (43513 and 47513) from infants saliva. Toluidine blue O (TBO) (D) and a red light-emmiting diodes (LEDs) (L) were used in association. Samples were inserted into 96 well-plate and treated with four TBO concentrations (0.25; 2.5; 25 e 250 µg/mL) and exposed to four dosimetries (12; 24; 36 e 48 J/cm2) defining the D+L+ group (PDT). Additional samples were treated only with TBO (D+L-) or only with red LEDs (D-L+). The treatment without dye and none red LED constituted the D-L- condition (positive control). Aliquots from D+L+ (TFD group) were inserted in Petri dishes, which were incubated at 370C for 48 hours. Posterior analysis of microbiologic growth, corresponding to PDT effectivity, was conducted. These samples were also submitted to laser confocal microscopy analysis for microbiologic data confirmation. The results showed PDT effectiveness for S. mutans inactivation in particular conditions. It was demonstrated that PDT was efficient to kill S. mutans species in the presence of the TBO at 2.5 µg/mL (minimum concentration) associated to 24 J/cm2 dosimetry.

O presente estudo foi dividido em quatro etapas distintas. A primeira etapa teve por objetivo avaliar a liberação de xilitol na saliva de humanos ao longo do tempo após aplicação de verniz controle e contendo 10% e 20% de xilitol. Um estudo cruzado foi realizado pela aplicação de 32 mg de cada verniz sobre as superfícies vestibulares de todos os incisivos centrais de 10 voluntários. Amostras salivares foram coletadas no baseline e após 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 1 h 30 min, 2 h, 4 h e 8 h da aplicação dos vernizes para posterior análise da concentração de xilitol na saliva. Um estudo clínico foi realizado na segunda etapa com o objetivo de verificar a influência do verniz contendo xilitol a 20% sobre a contagem de estreptococos do grupo mutans provenientes de biofilme dentário. Semanalmente, 32 mg de verniz controle (grupo G1) ou verniz contendo xilitol a 20% (grupo G2) foram aleatoriamente aplicados sobre as superfícies vestibulares dos incisivos centrais de 67 crianças. Após quatro semanas de procedimento, amostras de biofilme dentário foram coletadas do terço cervical de todos os dentes presentes na cavidade bucal e a contagem relativa e absoluta dos microrganismos foi determinada. A terceira etapa objetivou analisar a influência do xilitol sobre a ultra-estrutura de Streptococcus mutans ATCC 33478 e Streptococcus sobrinus ATCC 25175. Além disso, a capacidade do xilitol e do flúor em promover estresse celular em S. mutans UA 159 geneticamente modificados (deleção do gene vicK) foi determinada na quarta etapa. As concentrações de xilitol na saliva (F=5,228, p=0,024) em diferentes tempos de coleta (F=18,24, p<0,0001) foram estatisticamente diferentes após aplicação dos vernizes contendo 10% e 20% do açúcar (etapa 1). Na etapa 2, contagens absolutas inicial e final de estreptococos do grupo mutans (Teste-t, p=0,4192) e de estreptococos totais (Teste-t, p=0,3506) não foram significativamente diferentes nos indivíduos pertencentes ao grupo G2. No entanto, uma redução significativa na porcentagem relativa inicial e final de estreptococos do grupo mutans em relação aos estreptococos totais foi observada (Teste-t, p= 0,0095). Xilitol a 20% promoveu alterações na morfologia de S. mutans ATCC 33478 e S. sobrinus, ATCC 25175, resultando em paredes celulares mais difusas e menos definidas, cápsulas 24 polissacarídicas mais dispersas e irregulares em relação ao grupo controle (etapa 3). Os tratamentos envolvendo xilitol a 1,25% e 2,5% mostraram-se capazes de produzir maior estresse celular à S. mutans geneticamente modificados quando comparados aos tratamentos com NaF a 22,5 mM e 45 mM em todos os tempos analisados (ANOVA a um critério, Teste de Tukey, p<0,05). Portanto, o verniz contendo xilitol pode ser considerado um interessante veículo para a administração do açúcar, uma vez que demonstrou propiciar uma liberação mais lenta do poliol na cavidade bucal. Além disso, a significativa redução da contagem relativa de estreptococos do grupo mutans em relação aos estreptococos totais pode auxiliar na prevenção de cárie dentária. Este estudo também demonstrou a habilidade do xilitol em produzir alterações ultra-estruturais de S. mutans ATCC 33478 e S. sobrinus, ATCC 25175, além de ser capaz de produzir estresse celular em S. mutans UA159 com deleção do gene vicK. / This study was divided in four distinct stages. The first one aimed to assess the xylitol release in human saliva along time after application of control, 10% or 20% xylitol varnishes. A cross-over design study was performed by application of 32 mg of each varnish on buccal surfaces of all incisors of 10 volunteers. Salivary samples were collected to analyze the xylitol concentration in baseline and after 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h, 1 h 30 min, 2 h, 4 h and 8 h from varnishes application. A clinical study was executed in the second stage aiming observe the influence of 20% xylitol varnish on mutans streptococci counts from dental plaque. Weekly, 32 mg of control varnish (group G1) or 20% xylitol varnish (group G2) were randomly applied on buccal surfaces of central incisors of 67 children. After 4 weeks of procedures, dental plaque samples were collected from cervical of all teeth and relative and absolute counts of microorganisms were determined. The third stage aimed to analyze the effect of xylitol on the ultrastructure of Streptococcus mutans ATCC 33478 and Streptococcus sobrinus ATCC 25175. Moreover, the capacity of xylitol and fluoride to promote cellular stress in S. mutans UA 159 knockout vick gene was determined in the fourth stage. Salivary xylitol concentrations (F=5,228, p=0,024) in different collection times (F=18,24, p<0,0001) were statistically different after 10% and 20% varnishes application (stage 1). In stage 2, initial and final absolute mutans streptococci (Teste-t, p=0,4192) and total streptococci counts (Teste-t, p=0,3506) did not differ significantly in volunteers from group G2. However, a significant reduction of initial and final relative mutans streptococci counts was observed in relation to total streptococci (Teste-t, p= 0,0095). 20% xylitol promoted alterations in morphology of S. mutans ATCC 33478 and S. sobrinus, ATCC 25175, resulting in more diffuse and less defined cellular wall, more dispersive and irregular polysaccharidic capsules in comparison to control group (stage 3). 1.25% and 2.5% xylitol treatments were able to produce higher cellular stress to genetically modified S. mutans when compared to 22.5 mM and 45 mM NaF treatments throughout the time (ANOVA, Tukeys test, p<0.05). Therefore, xylitol varnish can be regarded as interesting vehicle to administer the polyol because it achieved a slower xylitol release into the oral cavity. Furthermore, a significant reduction of relative mutans streptococci counts in relation to total streptococci can aid in prevention of dental caries. The present study also demonstrated the ability of xylitol in producing ultrastructural alterations in S. mutans ATCC 33478 and S. sobrinus, ATCC 25175, besides generating cellular stress to S. mutans UA159 knockout vicK gene.