L'urani empobrit s'ha utilitzat durant dècades en l'àmbit de la medicina i també ha tingut aplicacions industrials, però no ha estat fins a l'ús militar, en els conflictes del Golf i dels Balcans, que la població s'ha preocupat sobre les possibles conseqüències d'aquesta exposició.La preocupació originada pels problemes de salut que podrien patir les poblacions que es troben en les zones de conflicte en què s'ha emprat munició amb urani empobrit ha plantejat en l'àmbit de la salut ambiental molts interrogants importants.D'altra banda, l'estrès és una resposta altament individualitzada a un repte extern o intern. És evident que la humanitat pot estar exposada a diferents tipus d'estrès, i una situació on es fa especialment evident l'estrès és un conflicte bèl·lic.Com que tant els canvis neurocomportamentals i fisiològics com les alteracions bioquímiques es donen com a resposta a l'estrès, l'exposició concurrent a urani i estrès es podria manifestar com una interacció, per que n'augmenti o en modifiqui els efectes.L'objectiu d'aquest treball és avaluar els efectes de l'exposició a l'urani (UAD) sobre la reproducció i la conducta, així com la influència que l'estrès pot exercir en aquesta exposició.De forma generalitzada, no s'observen variacions en els tests d'aprenentatge realitzats a mascles exposats a UAD, ni en funció de les dosis administrades ni per l'estrès.En aquest estudi s'observa que l'exposició oral a UAD de manera crònica produeix alteracions en la morfologia i la producció d'esperma, així com alteracions morfològiques progressives als túbuls seminífers dels testicles en funció de la dosi. D'altra banda l'administració de dosis elevades d' UAD produeix una important transformació angiomatosa al ronyó. En tots els teixits d'estudis, l' UAD ha provocat una alteració dels sistemes antioxidants.No s'observen, de forma global, diferències significatives en el nombre total d'implantacions, implantacions viables i no viables/ventrada. No obstant això, l' UAD provoca una disminució, no dependent de la dosi, del percentatge de femelles prenyades.En la descendència dels animals exposats a UAD, els diferents paràmetres de desenvolupament físic i neuromotor, així com d'aprenentatge, globalment no es veuen afectats. A més, l'estrès no modifica els resultats.Els resultats d'aquesta tesi doctoral mostren que l'exposició a UAD per via oral crònica en rates produeix signes de toxicitat en testicles, ronyó i cervell. L'estrès, per immobilització, aplicat conjuntament amb l' UAD a les dosis estudiades no en potencia els efectes. No obstant això, aquests resultats no comporten que l'estrès en general es pugui descartar com a factor potenciador del efectes de l'urani en altres dosis. / Depleted uranium has been used in medial and industrial applications for decades but only since its use in military conflicts in the Gulf and the Balkans has public concern been raised about potential health consequences from exposure to it.Moreover, uranium contamination becomes dispersed across the natural environment, thus entering the food chain. It means that for certain populations, the chemical toxic effects of uranium intake can be a matter of notable concern.On the other hand, stress is a highly individualized response of an organism to external or internal challenges. It is obvious that general population, as well as the military personnel are probably subjected to remarkable stressful events or experiences.It is also well known that neurobehavioral changes, together with physiological and biochemical alterations, are common response to stress. Taking into account that humans be potentially exposed to uranium, while they can be also concurrently subjected to stressful situations, the consequences could become apparent as an interaction,like an increase or a decrease of the effects.The main objective of the present study was to assess whether stress could enhance the potential adverse effects of uranium (UAD) on reproduction and behaviour.Neither UAD doses tested nor restraint stress induces alterations in the behavioural tests carried out in adult male rats exposed to uranium.The results of the current study suggest that chronic UAD exposure in males affects sperm production and morphology, as well as reveal dose related tubular and interstitial alterations of the testes. Moreover, histopathological examination of the kidneys revealed an angiomatose transformation in UAD-exposed animals.In brain, testes and kidneys, graded doses of UAD elicit depletion of the antioxidant defence system of the rat and induce oxidative stress.General data on pregnancy outcome measures show, neither in the number of total implants per litter nor in the number of viable and nonviable implants per litter significant differences among groups. However, UAD produced a significant (not dose-related) decrease in the pregnancy rate of treated rats.In the current study, restraint stress did not enhance the induced physical, neuromotor and behavioural changes in the offspring of UADexposed male rats.This doctoral thesis shows that oral UAD exposure in rats causes signs of toxicity in testes, kidneys and brain. The results of this investigation show that at the current UAD doses, restraint stress did not enhance the uranium-induced adverse effects in male rats. However, the influence of stress on these potential toxic effects cannot be discarded.

La pèrdua de contactes sinàptics és un fenomen que té lloc en tot el sistema nerviós durant la histogènesis dels circuits neuronals. La superproducció sinàptica inicial ve seguida d'una pèrdua de sinapsis anomenada eliminació sinàptica durant el desenvolupament, en l'envelliment i en algunes malalties. Les neurotrofines, són proteïnes essencials per la supervivència de les motoneurones i també participen en altres processos biològics. Amb el model neuromuscular de rosegadors hem investigat la localització de les neurotrofines (BDNF, NT-3 i NT-4) i els seus receptors (TrkB, TrkC i p75NTR) i la implicació en el procés de desconnexió i eliminació sinàptiques en el període postnatal i en el control local de la neurotransmissió colinèrgica de les sinapsis neuromusculars neonatals i adultes.Els principals resultats demostren que les neurotrofines i els seus receptors es localitzen en els components cel·lulars de la sinapsi neuromuscular i que exerceixen diferents efectes en l'alliberament de l'ACh i en el procés de l'eliminació sinàptica. / The loss of synaptic contacts is a phenomenon that it takes place in all the nervous system during the histogenesis of neural circuits. The initial synaptic superproduction comes followed by a synaptic contacts loss called synaptic elimination, given in the development period and also in the aging and in some illnesses. Neurotrophins are essential proteins for the survival of the motorneuron and also can participate in other biological processes.With the neuromuscular model of rodents we investigate the neurotrophins location (BDNF, NT-3 and NT-4) and its receptors (TrkB, TrkC and p75NTR) and its involvement in the disconnection process and synaptic elimination in the postnatal period and in the local control of the cholinergic neurotransmission in the neonatal and adult neuromuscular junctions.The main results demonstrate that neurotrophins and its receptors are found in the cellular components of the neuromuscular junction and exert different effects in the ACh release and in the process of synaptic elimination.

El present estudi s'ha plantejat per aprofundir en la influència de l'equilibri redox en aspectes de la biologia tumoral com són el metabolisme oxidatiu i el creixement cel·lular; a més a més, d'avaluar la importància de les espècies reactives d'oxigen en l'eficàcia de la quimioteràpia i establir la rellevància de la intensitat de l'estrès oxidatiu en la superació de la quimioresistència a fàrmacs convencionals. Els nostres resultats mostren que les diferències en l'estrès oxidatiu s'expressen segons el grau de diferenciació cel·lular i entre regions d'un mateix tumor. L'estat redox cel·lular, així com la resposta immediata al desequilibri oxidatiu generat, són factors determinants tant del creixement de la cèl·lula cancerosa com de l'eficàcia d'alguns agents antitumorals.En conclusió, els moduladors redox capaços de potenciar l'acció pro-oxidant de fàrmacs anticancerosos podrien tenir un potencial benefici per controlar el creixement de les cèl·lules canceroses i sensibilitzar-les novament a l'acció d'agents antitumorals clàssics

L'esquizofrènia és una de les psicosis més comunes que té una prevalença d'un 1% en la població mundial i una etiologia desconeguda. Una de les hipòtesis etiopatològiques més recolzades per l'esquizofrènia és la teoria del neurodesenvolupament la qual postula que l'origen de la esquizofrènia tindria lloc per alteracions de la neurogènesi i gliogènesi en les etapes del desenvolupament perinatal. Nombrosos estudis han descrit diverses alteracions de la mielina (substància blanca del cervell) en pacients esquizofrènics. La mielinització dels axons és important per una correcta transmissió del senyal entre neurones. Les cèl·lules responsables de sintetitzar mielina per embolcallar el axons en el cervell són els oligodendròcits. En humans els majors pics del procés de mielinització ocorren en la etapa perinatal, infantesa i adolescència. En aquesta última etapa és on es manifesten majoritàriament els primers símptomes de l'esquizofrènia.Diversos estudis de lligament apunten a que a la regió cromosòmica 6p hi podria haver un gen o gens de susceptibilitat per l'esquizofrènia. El nostre grup va escollir un gen d'aquesta regió, el gen que codifica pel Receptor Domini Discoidina 1 (DDR1), com a candidat per l'esquizofrènia. Se sap que DDR1 és un receptor tirosina quinasa que s'expressa de forma molt important en zones proliferatives durant el neurodesenvolupament del cervell de rata i ratolí i també s'ha vist que s'expressa en cervell humà. DDR1 té com lligant el col·lagen, el qual promou la diferenciació i proliferació de les cèl·lules neuroepitelials en rates. El nostre grup ha observat una important expressió de DDR1 en la substància blanca i en concret en els oligodendròcits durant el desenvolupament pre i postnatal en ratolins. A demés l'expressió d'aquest receptor segueix un patró espacio-temporal al procés de mielinització. En la present tesi doctoral hem estudiat per primera vegada en detall el patró d'expressió gènica i proteïca del receptor DDR1 en cervell humà mitjançant tècniques específiques d'hibridació in situ, immunohistoquímica i de quantificació d'RNAm. Hem trobat que existeix una associació positiva tan a nivell gènic com haplotípic de DDR1 amb l'esquizofrènia mitjançant un estudi d'anàlisi de variants tipus SNPs en una mostra de casos i control. També hem descrit per primera vegada que DDR1 és una proteïna de la mielina en cervell humà i que entre les 5 diferents isoformes que es coneixen només les isoformes DDR1c i DDR1a es relacionen amb la mielina. D'aquesta tesi es deriven les següents aportacions científiques: - Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Sotmés a revisió a la revista Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscrit en preparació. / Schizophrenia is one of the most common psychoses in the world today. It has a prevalence of 1% in the population and is of unknown etiology. One of the most widely accepted etiopathogenic hypotheses for schizophrenia is neurodevelopmental theory, which postulates that schizophrenia originates from a variety of neurogenetic and gliogenetic disorders during perinatal development. Many studies have reported that schizophrenic patients have alterations in their myelin (white matter of the brain). Axons must be myelinated if signals are to be properly transmitted between neurons. The cells that form the myelin sheaths of the axons in the CNS are the oligodendrocytes.In humans, the myelination process peaks in the perinatal, childhood and adolescence stages. It is during this last stage that the symptoms of schizophrenia become manifest. Several linkage studies indicate that the 6p chromosomal region may contain one or more susceptibility genes for schizophrenia. Our group chose a gene in this region, the gene encoding the discoidin domain receptor 1 (DDR1), as a candidate gene for schizophrenia.DDR1 is known to be a receptor tyrosine kinase which is highly expressed in proliferative areas during murine brain development, and has also been shown to be expressed in human brain. The DDR1 ligand is collagen, which promotes the proliferation and differentiation of the neurophitelial cells in rats. Our group has observed that DDR1 is significantly expressed in the white matter and particularly in oligodendrocytes during pre- and postnatal development in mice. Furthermore, the expression of this receptor follows a spatial-temporal pattern similar to the process of myelination.In this doctoral thesis we have made the first detailed study of the pattern of gene and protein expression of DDR1 in human brain, using specific techniques such as in situ hybridization, immunohistochemistry and quantification of RNAm. We found a positive association of DDR1 with schizophrenia in a case-control association study using markers of the SNP (single nucleotide polymorphism) type.We have also reported for the first time that DDR1 is a myelin protein in the human brain and that of the five different isoforms that are known only isoforms DDR1c and DDR1a are related to the myelin.The following scientific articles have been written as a result of this doctoral thesis:- Roig B, Virgos C, Franco N, Martorell L, Valero J, Costas J, Carracedo A, Labad A, Vilella E. The discoidin domain receptor 1 as a novel susceptibility gene for schizophrenia. Molecular Psychiatry. 2007. doi: 10.1038/sj.mp.4001995. IF: 11.8- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Tomàs J, Costas J, Vogel WF, Vilella E. Identification of the tyrosine kinase receptor discoidin domain 1 (DDR1) as a novel myelin protein. Submitted to Glia. IF: 4.1- Roig B, Franco-Pons N, Martorell L, Vilella E. Quantitative analysis of DDR1 mRNA expression in normal and schizophrenic brain. Manuscript in preparation.

La formació de tumors és el resultat d'alteracions genètiques successives que afecten, entre d'altres, a gens implicats en el control de la proliferació cel.lular. En aquest contexte, els proto-oncogens i els gens supressors de tumor han estat definits com a molècules que estan implicades en el control i la diferenciació cel.lular. L'alteració de l'expressió d'aquests gens permet a les cèl.lules escapar als mecanismes de regulació donant lloc a un creixement anormal (revisat a Solommon et al., 1991; Weinberg, 1993).Les pèrdues al.lèliques observades en tumors humans han suggerit la presència de gens supressors de tumor en les regions cromosòmiques. Els experiments efectuats fins ara han permès l'identificació de tres gens candidats: el Smad2, el Smad4 i el DCC. Els objectius concrets de la present tesi doctoral són:a) Estudi de la implicació dels gens DCC i Smad4 en els càncers de còlon i de pàncrees.b) Caracterització de la funció del DCC en les cèl.lules de l'epiteli gastrointestinal.c) Caracterització d'altres molècules implicades en la vida de transducció de senyal del DCC.

maviles@um.es / En la presente tesis doctoral se han estudiados diferentes aspectos relacionados con la composición glucídica, estructura, formación y origen de la zona pelúcida y las glicoproteínas que la forman, poniendo especial interés en la especie humana. Para este propósito hemos desarrollado tres líneas principales de investigación, estudio ultraestructural de la zona pelúcida y gránulos corticales de ovocitos humanos y de la síntesis de las glicoproteínas de la ZP humana y de ratón, análisis bioquímico y biofísico de las glicoproteínas de la zona pelúcida de hámster y análisis bioquímico y fisiológico de ZP2 y ZP3 recombinantes humanas expresadas en células CHO / In the present thesis, several aspects of the carbohydrate content, structure, formation and origin of the ZP, with special attention to the human ZP, have been analyzed. Therefore, the methods and techniques used in the present thesis included the ultrasctuctural study of human ZP, cortical granules and biosynthetic pathway of the human and mouse ZP, biochemical and cytochemical characterization of the hamster zona pellucid and characterization of recombinant human ZP2 y ZP3 expressed in CHO cells.

L’objectiu principal d’aquesta tesi és avançar en la comprensió del processament d’informació en xarxes neuronals en presència d’oscil lacions subumbrals. La majoria de neurones propaguen la seva activitat elèctrica a través de sinapsis químiques que són activades, exclusivament, quan el corrent elèctric que les travessa supera un cert llindar. És per aquest motiu que les descàrregues ràpides i intenses produïdes al soma neuronal, els anomenats potencials d’acció, són considerades la unitat bàsica d’informació neuronal, és a dir, el senyal mínim i necessari per a iniciar la comunicació entre dues neurones. El codi neuronal és entès, doncs, com un llenguatge binari que expressa qualsevol missatge (estímul sensorial, memòries, etc.) en un tren de potencials d’acció. Tanmateix, cap funció cognitiva rau en la dinàmica d’una única neurona. Circuits de milers de neurones connectades entre sí donen lloc a determinats ritmes, palesos en registres d’activitat colectiva com els electroencefalogrames (EEG) o els potencials de camp local (LFP). Si els potencials d’acció de cada cèl lula, desencadenats per fluctuacions estocàstiques de les corrents sinàptiques, no assolissin un cert grau de sincronia, no apareixeria aquesta periodicitat a nivell de xarxa. Per tal de poder entendre si aquests ritmes intervenen en el codi neuronal hem estudiat tres situacions. Primer, en el Capítol 2, hem mostrat com una cadena oberta de neurones amb un potencial de membrana intrínsecament oscil latori filtra un senyal periòdic arribant per un dels extrems. La resposta de cada neurona (pulsar o no pulsar) depèn de la seva fase, de forma que cada una d’elles rep un missatge filtrat per la precedent. A més, cada potencial d’acció presinàptic provoca un canvi de fase en la neurona postsinàptica que depèn de la seva posició en l’espai de fases. Els períodes d’entrada capaços de sincronitzar les oscil lacions subumbrals són aquells que mantenen la fase d’arribada dels potencials d’acció fixa al llarg de la cadena. Per tal de què el missatge arribi intacte a la darrera neurona cal, a més a més, que aquesta fase permeti la descàrrega del voltatge transmembrana. En segon cas, hem estudiat una xarxa neuronal amb connexions tant a veïns propers com de llarg abast, on les oscil lacions subumbrals emergeixen de l’activitat col lectiva reflectida en els corrents sinàptics (o equivalentment en el LFP). Les neurones inhibidores aporten un ritme a l’excitabilitat de la xarxa, és a dir, que els episodis en què la inhibició és baixa, la probabilitat d’una descàrrega global de la població neuronal és alta. En el Capítol 3 mostrem com aquest ritme implica l’aparició d’una bretxa en la freqüència de descàrrega de les neurones: o bé polsen espaiadament en el temps o bé en ràfegues d’elevada intensitat. La fase del LFP determina l’estat de la xarxa neuronal codificant l’activitat de la població: els mínims indiquen la descàrrega simultània de moltes neurones que, ocasionalment, han superat el llindar d’excitabilitat degut a un decreixement global de la inhibició, mentre que els màxims indiquen la coexistència de ràfegues en diferents punts de la xarxa degut a decreixements locals de la inhibició en estats globals d’excitació. Aquesta dinàmica és possible gràcies al domini de la inhibició sobre l’excitació. En el Capítol 4 considerem acoblament entre dues xarxes neuronals per tal d’estudiar la interacció entre ritmes diferents. Les oscil lacions indiquen recurrència en la sincronització de l’activitat col lectiva, de manera que durant aquestes finestres temporals una població optimitza el seu impacte en una xarxa diana. Quan el ritme de la població receptora i el de l’emissora difereixen significativament, l’eficiència en la comunicació decreix, ja que les fases de màxima resposta de cada senyal LFP no mantenen una diferència constant entre elles. Finalment, en el Capítol 5 hem estudiat com les oscil lacions col lectives pròpies de l’estat de son donen lloc al fenomen de coherència estocàstica. Per a una intensitat òptima del soroll, modulat per l’excitabilitat de la xarxa, el LFP assoleix una regularitat màxima donant lloc a un període refractari de la població neuronal. En resum, aquesta Tesi mostra escenaris d’interacció entre els potencials d’acció, característics de la dinàmica de neurones individuals, i les oscil lacions subumbrals, fruit de l’acoblament entre les cèl lules i ubiqües en la dinàmica de poblacions neuronals. Els resultats obtinguts aporten funcionalitat a aquests ritmes emergents, agents sincronitzadors i moduladors de les descàrregues neuronals i reguladors de la comunicació entre xarxes neuronals. / The main objective of this thesis is to better understand information processing in neuronal networks in the presence of subthreshold oscillations. Most neurons propagate their electrical activity via chemical synapses, which are only activated when the electric current that passes through them surpasses a certain threshold. Therefore, fast and intense discharges produced at the neuronal soma (the action potentials or spikes) are considered the basic unit of neuronal information. The neuronal code is understood, then, as a binary language that expresses any message (sensory stimulus, memories, etc.) in a train of action potentials. Circuits of thousands of interconnected neurons give rise to certain rhythms, revealed in collective activity measures such as electroencephalograms (EEG) and local field potentials (LFP). Synchronization of action potentials of each cell, triggered by stochastic fluctuations of the synaptic currents, cause this periodicity at the network level.To understand whether these rhythms are involved in the neuronal code we studied three situations. First, in Chapter 2, we showed how an open chain of neurons with an intrinsically oscillatory membrane potential filters a periodic signal coming from one of its ends. The response of each neuron (to spike or not) depends on its phase, so that each cell receives a message filtered by the preceding one. Each presynaptic action potential causes a phase change in the postsynaptic neuron, which depends on its position in the phase space. Those incoming periods that are able to synchronize the subthreshold oscillations, keep the phase of arrival of action potentials fixed along the chain. The original message reaches intact the last neuron provided that this phase allows the discharge of the transmembrane voltage.I the second case, we studied a neuronal network with connections to both long range and close neighbors, in which the subthreshold oscillations emerge from the collective activity apparent in the synaptic currents. The inhibitory neurons provide a rhythm to the excitability of the network. When inhibition is low, the likelihood of a global discharge of the neuronal population is high. In Chapter 3 we show how this rhythm causes a gap in the discharge frequency of neurons: either they pulse single spikes or they fire bursts of high intensity. The LFP phase determines the state of the neuronal network, coding the activity of the population: its minima indicate the simultaneous discharge of many neurons, while its maxima indicate the coexistence of bursts due to local decreases of inhibition at global states of excitation. In Chapter 4 we consider coupling between two neural networks in order to study the interaction between different rhythms. The oscillations indicate recurrence in the synchronization of collective activity, so that during these time windows a population optimizes its impact on a target network. When the rhythm of the emitter and receiver population differ significantly, the communication efficiency decreases as the phases of maximum response of each LFP signal do not maintain a constant difference between them.Finally, in Chapter 5 we studied how oscillations typical of the collective sleep state give rise to stochastic coherence. For an optimal noise intensity, modulated by the excitability of the network, the LFP reaches a maximal regularity leading to a refractory period of the neuronal population.In summary, this Thesis shows scenarios of interaction between action potentials, characteristics of the dynamics of individual neurons, and the subthreshold oscillations, outcome of the coupling between the cells and ubiquitous in the dynamics of neuronal populations . The results obtained provide functionality to these emerging rhythms, triggers of synchronization and modulator agents of the neuronal discharges and regulators of the communication between neuronal networks.

La necrosi irreversible del múscul cardíac es coneix com infart de miocardi (MI) i es dóna quan la isquèmia supera el llindar crític y depassa els mecanismes cel·lulars de reparació. Després d’un MI, el teixit cardíac no té la capacitat suficient d’autoregeneració i com a conseqüència, la isquèmia pot causar la mort, moderada o severa, del teixit. L’enginyeria de teixits és un camp emergent interdisciplinari enfocat a l’obtenció de cultius tridimensionals (3D) emprats per a dos propòsits diferents: aportar eines biomèdiques amb potencial aplicació en la substitució, reparació i regeneració del teixit; o permetre l’estudi in vitro de la fisiologia i la fisiopatologia de manera més precisa. En aquesta tesi s’ha desenvolupat i analitzat un model 3D in vitro basat en el pèptid autoensamblant RAD16-I, i un implant bioactiu per a la reparació del teixit cardíac dins del marc del projecte europeu RECATABI. Els models 3D poden ajudar-nos a estudiar els paràmetres biofísics, biomecànics i bioquímics que regulen la diferenciació cel•lular. En la present tesis, s’ha desenvolupat un model 3D per analitzar el comportament de cèl·lules progenitores derivades de teixit adipós subcutani (subATDPCs) en termes de viabilitat, creixement i expressió gènica, sota la influència de diferents estímuls. Per una altra banda, s’ha desenvolupat un mètode simple i innovador per a l’estudi de l’efecte de l’estímul elèctric en cèl•lules cultivades en el model 3D proposat. L’objectiu final d’aquest model in vitro és entendre millor el comportament que poden tenir aquestes cèl•lules in vivo després de ser implantades. D’aquesta manera s’espera poder millorar la seva actuació en la regeneració o reparació del teixit infartat. S’ha proposat amb anterioritat que l’empelt de cèl·lules progenitores en l’àrea afectada pot contribuir en la generació d’un nou teixit de miocardi. La nostra hipòtesi es basa en que aquest mecanisme es pot millorar amb l’aplicació d’un implant bioactiu que pugui mantenir les cèl·lules en la localització d’implantació, suportar el comportament mecànic del cor i a la vegada proporcionar un micoambient adequat per a les cèl·lules implantades. Amb aquest objectius, es va preparar un material combinant consistent en la inclusió del RAD16-I dins dels microporus de membranes elastomèriques. L’objectiu d’aquest estudi és avaluar la capacitat de sembra d’aquesta plataforma i la supervivència, creixement i expressió gènica de les subATDPCs en el material combinat. Es descriu el desenvolupament i caracterització de bioimplants basats en dues membranes elastomèriques: polietilacrilat (PEA) i policaprolactona 2-metacrilociloxi etil ester (PCLMA). Ambdues són bons materials de suport i també són suficientment elàstiques per a suportar els esforços resultants del batec del cor. A més, ambdós materials compostos faciliten la propagació dels impulsos elèctrics i permeten el manteniment d’expressió gènica de les subATDPCs. Es proposa doncs que els implants bioactius (membranes elastomèriques amb pèptid autoensamblant i subATDPCs) poden millorar l’eficàcia de futures teràpies cel·lulars augmentant la immobilització i supervivència de les cèl·lules en l’àrea afectada. / La necrosis irreversible del músculo cardíaco se conoce como infarto de miocardio (MI) y se da cuando la isquemia supera el umbral crítico y rebasa los mecanismos celulares de reparación. Después de un MI, el tejido cardíaco no tiene la capacidad suficiente de autoregeneración y como consecuencia, la isquemia puede causar la muerte, moderada o severa, del tejido. La ingeniería de tejidos es un campo emergente interdisciplinar enfocado a obtener cultivos tridimensionales (3D) con dos propósitos distintos: aportar herramientas biomédicas con potencial aplicación en la substitución, reparación y regeneración del tejido; o permitir el estudio in vitro de la fisiología y la patofisiología de manera más precisa. En la presente tesis se ha desarrollado y analizado un modelo in vitro 3D basado en el péptido autoensamblable RAD16-I y un implante bioactivo para la reparación del tejido cardíaco dentro del marco del proyecto europeo RECATABI. Los modelos 3D pueden ayudarnos a estudiar los parámetros biofísicos, biomecánicos y bioquímicos que regulan la diferenciación celular. En esta tesis, hemos desarrollado un modelo 3D para analizar el comportamiento de células progenitoras derivadas de tejidos adiposo subcutáneo (subATDPCs) en términos de viabilidad, crecimiento y expresión génica, bajo la influencia de diferentes estímulos. Por otro lado, se ha desarrollado un método simple y novedoso para el estudio del efecto de un estímulo eléctrico en células encapsuladas en el modelo 3D. El objetivo final de este modelo in vitro es entender mejor el comportamiento que estas pueden tener células in vivo después de su implantación. De esta manera se espera poder mejorar su actuación en términos de regeneración o reparación del tejido infartado. Se ha propuesto con anterioridad que el injerto de células progenitoras en el área infartada puede contribuir en la generación de un nuevo tejido de miocardio. Nuestra hipótesis se basa en que este mecanismo puede ser mejorado con la aplicación de un implante bioactivo que pueda mantener las células en la localización de implantación, soportar el comportamiento mecánico del corazón y a la vez proporcionar un microambiente adecuado a las células implantadas. Con estos objetivos se preparó un material combinado consistente en la inclusión del RAD16-I dentro de los microporos de membranas elastoméricas. El objetivo de este estudio es evaluar la capacidad de siembra de esta plataforma y la supervivencia, crecimiento y expresión génica de las subATDPCs. Se describe el desarrollo y caracterización de bioimplantes basados en dos membranas elastoméricas: poli etil acrilato (PEA) y policaprolactona 2-metacriloxiloxi etil ester (PCLMA). Ambas son buenos materiales de soporte para la implantación de células y también son suficientemente elásticas para soportar los esfuerzos resultantes del latido del corazón. Se ha observado que los dos materiales compuestos facilitan la propagación de los impulsos eléctricos y permiten el mantenimiento de la expresión génica de las subATDPCs. Se propone que los implantes bioactivos (membranas elastomérica con péptido autoensamblable y subATDPCs) pueden mejorar la eficacia de futuras terapias celulares, aumentando la inmovilización y supervivencia de las células en el área afectada. / The irreversible necrosis of heart muscle (myocardial infarction, MI) occurs when ischemia exceeds a critical threshold and overwhelms myocardial cellular repair mechanisms. After MI, myocardial tissue lacks the ability to significantly regenerate itself and as a consequence, ischemia might cause moderate or severe tissue death. Tissue Engineering is an emerging interdisciplinary field focused on the obtaining of three-dimensional (3D) constructs with two different purposes: provide a set of biomedical tools with potential applicability in tissue replacement, repair and regeneration; or enable the in vitro study of cardiac human physiology and physiopathology more accurately. In this work, we have developed and analyzed a 3D in vitro model based on RAD16-I self-assembling peptide and a bioactive implant for cardiac tissue repair in the framework of RECATABI European Project. 3D models can help us to study the biophysical, biomechanical and biochemical parameters that regulate cell differentiation. In this thesis, we have developed a 3D in vitro model to analyze the behavior of subcutaneous adipose derived progenitor cells (subATDPCs) in terms of viability, growth, and gene expression, under different stimuli. Moreover, a novel and simple method to study the effect of electrical stimulus on cells growing in the 3D model has been achieved. The goal of these in vitro models is to better understand the behavior that these cells could have after their in vivo implantation with the hope to improve their performance in terms of regeneration or repair of the infarcted tissue. Stem cells have been previously proposed to be grafted into the infarcted area to contribute to the generation of new myocardial tissue. We hypothesize that this mechanism could be enhanced by the application of a bioactive implant that could maintain the cells in the implanted site, afford the mechanical heart behavior and, at the same time, provide to the implanted cells a proper microenvironment. Therefore, we have prepared a composite obtained from the combination of RAD16-I included within microporous of elastomeric membranes. The goal of the present study is to evaluate cell survival and growth, seeding capacity and gene expression of subATDPCs in the new synthetic composite scaffold platform. We have described the development and characterization of bioimplants based on two different elastomeric membranes: poly(ethyl acrylate) (PEA), and poly(caprolactone 2-(methacryloyloxy)ethyl ester, (PCLMA). Both biomaterials are a good support for cell delivery and elastic enough to withstand the stresses arising from the heartbeat. Additionally, the developed composites equally facilitated the propagation of electrical pulses and maintained subATDPCs gene expression. We have proposed that the bioactive implants (elastomeric membranes with self-assembling peptide, and subcutaneous adipose tissue derived progenitor cells) could increase the efficacy of future cardiac cell therapy by improving cell immobilization and survival at the affected site.

The design of smart biomaterial devices plays a key role to improve the way conventional therapies are being delivered, and to promote the development of new approaches for advanced therapies, such as regenerative medicine and targeted drug release. Injectable biodegradable materials, such as those consisting of suspensions of polymeric particles, are highly versatile devices that can be delivered through minimally-invasive injections. The physic-chemical properties of the particles can be engineered to obtain smart scaffolds for tissue engineering, carriers for drug release and cell therapy. The aim of this Thesis is to develop a novel class of biodegradable and injectable particulate carriers based on polylactic acid (PLA), that are capable to trigger and guide specific responses from the cells and the biological milieu. First, a novel route to fabricate PLA-based microcarriers (MCs) was set and characterized. The production method involved green, non-harmful chemicals and it is easy to scale-up. Such technique allowed tuning MC size and size distribution in the range suitable for drug and cell delivery applications. The favorable regulatory status of the materials and reagents may also be beneficial for the translation of the MCs from bench to bedside. The principles guiding the fabrication procedure can inspire techniques to generate nanocarriers for controlled drug delivery. Recent studies point out the importance of drug-loaded and submicron-sized materials in the treatment of severe clinical conditions, such as persistent biofilm infections. These nanoparticles (NPs) can be endowed with smart functionalities to enhance drug delivery within the biofilm matrix. In this way, NPs encapsulating the antibiotic ciprofloxacin were produced and functionalized with DNase I. The NPs improved the antimicrobial activity of the encapsulated drug and promoted biofilm eradication, targeting and degrading directly the biofilm matrix. On the other hand, larger particles such as MC, display a high surface area for cell expansion. MCs can also deliver cells with therapeutic potential as ¿living drugs¿, ideally in a spatio-temporal controlled fashion. This is especially important, as, in standard cell therapies, direct injection of cells is accompanied by massive cell mortality that renders the treatment ineffective. PLA MCs suitable for Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing have been produced and modified with different functionalization approaches. The physic-chemical properties of the MCs and bioactive coatings modulated cell adhesion, proliferation, and migratory potential in response to chemokines that regulate MSC tissue localization, like SDF-1a. The results highlight the importance of carriers design to control cell delivery, and provide important guidelines to instruct a new generation of efficient biomaterial carriers. Another exciting application of injectable, cell-laden MCs is to use them as building blocks to fabricate living tissues in vitro. Combining MC technology and bioprinting is an appealing strategy to generate tissues grafts with controlled architectures. The suspension of injectable PLA cell-laden MCs within gelatin-based hydrogels formed an extrudable, composite bioink. MCs acted as mechanical reinforcement for soft gels and as means for cell expansion to encapsulate high cell payload. MSCs were shown to form MC-MSCs aggregates, with enhanced cell-to-cell contact on surface functionalized PLA MCs, and differentiated towards the osteogenic lineage. This result suggests potential applications of MC-MSCs laden bioinks for bone tissue engineering, and the composite bioink is proposed as component to build multimaterial, 3D-printed osteochondral graft models. Taken together, the injectable devices developed in the Thesis constitute promising and highly versatile biomaterial platforms for biomedical applications, and can be employed in a wide array of tissue engineering, and cell and drug delivery strategies. / El diseño de dispositivos basados en biomateriales inteligentes, juega un papel fundamental a la hora de mejorar las terapias convencionales, así como en el desarrollo de nuevas estrategias para la medicina regenerativa y la liberación controlada de fármacos. Materiales inyectables biodegradables, tales como las suspensiones de partículas poliméricas, constituyen dispositivos versátiles, que se pueden suministrar por medio de inyecciones mínimamente invasivas. Las propiedades físico-químicas de las partículas pueden ser modificadas para obtener andamios inteligentes para la ingeniería de tejidos, transportadores para liberación de fármacos y cultivo y terapia celular. El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de una nueva clase de partículas transportadoras inyectables y biodegradables, basadas en ácido poliláctico (PLA), que sean capaces de desencadenar y guiar respuestas específicas por parte de las células y del entorno biológico. Primero, se ha creado y caracterizado una nueva ruta para fabricar microstransportadores (MCs) basados en PLA. Este método de producción utiliza reactivos verdes y no-tóxicos, y es sencillo de adaptar para la fabricación a gran escala. Esta técnica permite controlar parámetros fundamentales en las MCs, tales como su tamaño y dispersión, que pueden ser controlados dentro de los rangos adecuados para aplicaciones de liberación de fármacos y células. El hecho que los materiales y reactivos utilizados están bien aceptados por las agencias reguladoras, puede favorecer el traslado de las partículas fabricadas desde la investigación hasta la práctica clínica. Los principios de este método pueden adaptarse a otras técnicas de fabricación para generar nanotransportadores (nanopartículas, NPs) de fármacos. Estudio recientes subrayan la importancia de biomateriales submicrométricos cargados con compuestos bioactivos en el tratamiento de enfermedades, tal como las infecciones provocadas por biofilms. Estas NPs pueden ser modificadas con funcionalidades inteligentes, para mejorar la distribución del fármaco en la matriz del biofilm. De esta manera, se han producido NPs que encapsulan el antibiótico ciprofloxacino, modificadas superficialmente con DNasa I. Estos transportadores tienen como diana la matriz que compone el biofilm y pueden degradarla, incrementando la actividad antibacteriana del ciprofloxacino y promoviendo la erradicación de los biofilms. Por otra banda, las partículas más grandes, como las MCs, poseen una superficie adecuada para la expansión celular. Las MCs se pueden usar para transportar “drogas vivas”, es decir células con potencial terapéutico, posiblemente controlando su distribución espacial y su cinética de liberación. Esto es de particular importancia, porque la ineficiencia de muchas terapias celulares actuales se debe a la gran cantidad de células que no sobreviven una vez inyectadas in vivo. Se han producido MCs de PLA modificadas por diferentes estrategias de funcionalización y aptas para suportar en su superficie células madres mesenquimales (MSCs). La biofuncionalización y las propiedades físico-químicas de las MCs juegan un papel fundamental en la adhesión y proliferación célular, así como la capacidad de las MSCs de migrar en respuesta a estímulos quimiotácticos, que regulan su localización en los tejidos, tal como el SDF-1α. Los resultados subrayan la importancia del diseño de las MCs para controlar la liberación de las células, y a la vez aportan información para desarrollar una nueva y más eficiente generación de transportadores de células. Otra aplicación prometedora de las MCs inyectables es su uso como bloques de construcción para fabricar tejidos vivos in vitro. La combinación de la tecnología de las MCs con la bioimpresión 3D constituye una estrategia atractiva para obtener injertos de tejidos multimateriales con arquitectura controlada. Se han obtenido biotintas compuestas y capaces de ser extruidas mezclando materiales basados en hidrogeles de gelatina con las MCs de PLA cargadas con células. Las MCs actúan de refuerzo mecánico para el hidrogel y como vehículo para la expansión celular (por ejemplo, en un bioreactor “spinner flask”) para encapsular elevadas cantidades de células. Las MSCs forman agregados células-particulas, una vez sembradas en las superficies de las MCs, y estos complejos, ricos en contactos célula-célula, se demostraron capaces de suportar la diferenciación osteogénica de las MSCs. Este resultado sugiere potenciales aplicaciones de las biotintas cargadas de agregados de MCs y MSCs para la ingeniería del tejido óseo. Esta biotinta ha sido también utilizada como componiente para generar un modelo de injerto osteocondral, por medio de una técnica de impresión 3D. El conjunto de dispositivos inyectables desarrollados en esta Tesis constituyen una plataforma muy versátil y prometedora para aplicaciones biomédicas, en particular en estrategias de ingeniería de tejidos, y liberación de células y fármacos

This thesis is about challenges that currently concern in vitro production (IVP), sex determination procedures and sex-related survival of in vitro-produced porcine embryos. Specifically, the current thesis develops a new suitable PCR-based procedure based on the amplification of repetitive sequences for determining the sex of porcine embryos at different developmental stages. Furthermore, this work establishes new culture conditions and provides new knowledge about physiology, development and sexual dimorphisms in survival rates and kinetics of the development of in vitro-produced porcine embryos under specific in vitro culture conditions. The presence of optimal concentrations of hyaluronic acid and specific energy substrates at the appropriate time of embryo development, as well as the timing of several events during the earliest stages of development, essentially the timing of the first embryonic cleavage, appear to be linked amongst them and are related to subsequent embryonic competence, influencing development in a sex related manner / Aquesta tesi tracta alguns dels reptes que actualment afecten la producció in vitro (PIV), la determinació del sexe i la supervivència relacionada amb el sexe dels embrions de porcí. Concretament, presenta una nova tècnica de PCR basada en l’amplificació de seqüències repetitives apte per a determinar el sexe d’embrions porcins a diferents estadis de desenvolupament. També estableix noves condicions de cultiu i ofereix nous coneixements sobre la fisiologia, el desenvolupament i els dimorfismes sexuals en les taxes de supervivència i en la cinètica del desenvolupament d’embrions de porcí PIV sota unes determinades condicions de cultiu. Concentracions òptimes d’àcid hialurònic, i de glucosa, piruvat i lactat com a substrats energètics, en el moment adequat del desenvolupament embrionari, així com també el moment en el qual té lloc la primera divisió embrionària, estan relacionats entre sí i condicionen el posterior desenvolupament embrionari, tendint a desviar la proporció de sexes