According to a study of the European Commission, approximately one million hips are replaced by prostheses worldwide every year. The interaction of the human body with foreign materials that are subjected to alternating mechanical load in a highly corrosive environment still provides challenges. The main factors affecting prosthesis failure are stress shielding effect and poor osseointegration. In this thesis the problem of prosthesis failure has been approached from the material and from the osseointegration point of view trying to give a global solution to the problem. Niobium and hafnium, which are demonstrated to be totally biocompatible, were used to design a Ti-based alloy. The effect of the alloying elements regarding microstructure and elastic modulus was studied and the best composition was deeply characterized in terms of microstructure, elastic modulus, corrosion resistance and superficial energy. Recombinant fragments of fibronectin were synthesised spanning the cell attachment site and the heparin binding domain which are important for cell viability. These motifs were used to functionalise the surface of the TiNbHf alloy. Two tethering methods were studied: physisorption and silanisation. Silanisation was not used before to immobilise fibronectin recombinant fragments onto metallic substrates and in this thesis, its good performance was demonstrated. In vitro studies were made with each fragment and with different combinations of the fragments, which showed the importance of the heparin binding domain to obtain a cell response equivalent to that of fibronectin in terms of cell adhesion, proliferation and differentiation. / De acuerdo con un estudio de la Comisión Europea, aproximadamente un millón de caderas son remplazadas por prótesis en el mundo anualmente. La interacción del cuerpo humano con materiales externos sujetos a una carga mecánica alternante en un medio altamente corrosivo todavía presenta ciertos desafíos. Los factores que contribuyen principalmente al fallo de una prótesis son el apantallamiento de cargas y la pobre osteointegracion. En la presente tesis el problema de la fallida de prótesis ha sido abordado desde el punto de vista del material y de la osteointegracion en un intento de dar una solución global al problema. El niobio y el hafnio, cuya total biocompatibilidad ha sido demostrada, se han utilizado para diseñar una aleación de titanio. El efecto de dichos aleantes respecto a la microestructura y el módulo elástico ha sido estudiado y la mejor composición ha sido profundamente caracterizada en términos de microestructura, módulo elástico, resistencia a la corrosión y energía superficial. Fragmentos recombinados de fibronectina han sido sintetizados abarcando la zona de adhesión celular y la unión de heparina, las cuales son esenciales para la viabilidad celular. Dichos motivos han sido utilizados para funcionalizar la superficie de la aleación TiNbHf. Dos métodos de unión diferentes han sido estudiados: fisisorción y silanización. La silanización es un método que no se ha utilizado hasta el momento para inmovilizar fragmentos de fibronectina sobre superficies metálicas y en la presente tesis su idoneidad ha sido demostrada. Finalmente, estudios celulares in vitro se han llevado a cabo con cada fragmento y con diferentes combinaciones de ambos, lo cual ha mostrado la importancia de la zona de unión de heparina para obtener una respuesta celular equivalente a la obtenida con la molécula de fibronectina en cuanto a adhesión celular, proliferación y diferenciación.

El control del ciclo celular está altamente regulado mediante diferentes CDKs asociadas a ciclinas. En Saccharomyces cerevisiae, la CDK esencial Cdc28 es la que regula mayoritariamente este proceso. En la fase G1 del ciclo celular, otra CDK, Pho85, también colabora en este proceso asociada a las ciclinas Pcl1 y Pcl2. Pho85 se considera un enzima accesorio con funciones redundantes básicamente porqué: 1) su delección no da un fenotipo de letalidad (como si lo hace Cdc28) y 2) porqué los substratos descritos para Cdc28 lo son a su vez para Pho85. En esta tesis, hemos demostrado que, aunque es cierto que ambas CDKs regulan a los mismos substratos, lo hacen en condiciones ambientales distintas y que esto es facilitado por un mecanismo de destrucción de proteínas diverso. Hasta el inicio de este trabajo, se conocía el complejo SCF como el único capaz de degradar las ciclinas de G1 pero hemos observado que Dma1, otra E3 ligasa, es la que regula específicamente a Pcl1. Esta ciclina es ubiquitinada in vitro e in vivo por Dma1 y esto es necesario para la correcta degradación de Pcl1 in vivo. Como el SCF, Dma1 también se basa en una pequeña secuencia presente en sus sustratos a la que hemos llamado DDD, sin la cual, Pcl1 no era ubiquitinado correctamente in vitro y no era correctamente degradada in vivo. La fosforilación de Pcl1 mediante Pho85 en la Thr39 y la Ser43 es necesaria para su destrucción in vivo. Además, hemos podido demostrar que este mecanismo regulado mediante fosforilación y ubiquitinación, tiene un sentido fisiológico dado que en condiciones pobres en nutrientes, Pcl1 es la ciclina principal de la fase G1 del ciclo, siendo así acordes unos niveles mas bajos de la E3 ligasa Dma1. Por lo tanto, los complejos Pho85-Pcl1 ayudan a rearrancar el ciclo cuando no hay suficientes nutrientes en el medio y Cdc28 está downregulada y Dma1 es un mecanismo de degradación dependiente y controlado por la presencia de nutrientes en el medio. Así también, Pho85-Pho80 enlazan la regulación del metabolismo con la fase G1 del ciclo al fosforilar a Cln3 en presencia de fosfato, estabilizando a la ciclina mediante fosforilación. Hemos observado que esta fosforilación se da en lugares diversos a la que realiza su CDK Cdc28, seguramente dado que Pho85 la regula como sustrato y no como ciclina. Esto, nos llevó a sospechar que la degradación de Cln3 pudiese darse por un mecanismo diferente a la que sufre cuando es controlada por su propia CDK. Sabiendo que Pho85 está regulando también de diferentes maneras la autofagia, quisimos comprobar que no fuera este mecanismo el mecanismo de degradación de Cln3. Tras observar que no era así, también buscamos la posible E3 ligasa que estuviese ubiquitinando a esta proteína y, aunque no conseguimos encontrar, cabe destacar que observamos que Ubc4 se encuentra relacionada con el proceso de destrución de Cln3.

The aim of this doctoral thesis was to unravel mechanisms underlying primary resistance to trastuzumab regarding a putative new breast cancer subtype with mixed basal & ErbB2+ molecular features. Using the JIMT-1 breast cancer cell line as a model, we have been able to identify several candidate mechanisms responsible for trastuzumab resistance in basal/ErbB2+ breast cancer cells: 1) overexpression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein family member; 2) Overactivation and sub-cellular re-localization of IGF-1R, a growth factor receptor involved in cellular proliferation and metastasis; and 3) Over-representation of breast cancer cells bearing the CD44+CD24-/low mesenchymal phenotype, which are enriched with putative breast cancer stem cells (CSCs) due to the activation of epithelia-to-mesenchymal transition (EMT) phenomena / El motiu d’aquesta tesi doctoral és l’estudi dels possibles mecanismes de resistència intrínseca al trastuzumab en el marc d’un nou subtipus intrínsec de càncer de mama basal/ErbB2+. Gràcies a l’ús de la línia cel·lular de càncer de mama JIMT-1 com a model d’estudi, hem identificat els possibles mecanismes pels quals el càncer de mama basal/ErbB2+ no respon al tractament amb trastuzumab: 1) augment dels nivells de survivina (una proteïna inhibidora de l’apoptosi), 2) augment dels nivells, activació, i canvi de localització del receptor IGF-1R (receptor implicat en la proliferació cel·lular i formació de metàstasi), i 3) augment de la subpoblació de cèl·lules mesenquimals amb fenotip de cèl·lules mare tumorals CD44+CD24-/low (CMTs) generades mitjançant la transició epiteli-mesènquima (TEM)

The initial molecular events that take place at biomaterials interface mimic to a certain extent the natural interaction of cells with the extracellular matrix (ECM). In this thesis we describe the fate of adsorbed type IV collagen (Col IV) - the main structural component of the basement membrane (BM) - as an important target in vascular tissue engineering. We studied the adsorption kinetic of Col IV on different model surfaces varying in wettability, chemistry and charge, and followed how it alters the molecular organization of the adsorbed protein layer. We strived to learn how it will affect the subsequent cellular interaction. AFM studies revealed specific substratum– dependent adsorption pattern of Col IV ranging from single molecular deposition to fine meshwork formation at high coating concentrations, which is characteristic for hydrophilic and NH2 functionalized substrates. Conversely, the formation of a complex networks consisting of molecular aggregates were found on hydrophobic and COOH modified surfaces. Complex structures were found also when a family of model substrates with tailored density of OH, CH3 and NH2 functions were used. Human umbilical endothelial cells (HUVEC) and fibroblasts were employed to study the biological response on these substrata. We found that fibroblast not only interact with adsorbed Col IV but also tend to reorganize it in fibril like pattern, which is strongly dependent on the materials surface properties. Following the trend of adsorption NH2>CH3>COOH>OH the reorganization pattern of Col IV improve with lowering the amount of protein. However, the cells interact better with hydrophilic and NH2 surfaces, thus acting independently on the amount of adsorbed Col IV. This trend was confirmed by the quantitative measurements of cell adhesion and spreading, as well as, the expression of p-FAK, α1 and α2 integrins – all reflecting the proper functioning of cell adhesion machinery. This is the first study that addresses the relationship between microscopic observation for remodeling of surface associated Col IV and it´s dynamic behavior in nano scale. We found that cells remodel Col IV in two ways: by mechanical reorganization and via proteolytic degradation. We identify the role of FN in the reorganization process and the involvement of MMP2 and MMP9 in the pericellular degradation activity of both HUVEC and fibroblasts. The later was further quantified via FITC labeled Col IV release and zymography. We found that in hydrophobic environment the degradation activity can override the Col IV organization process, which corroborates with the altered cell morphology, abrogated cell adhesion machinery and altered capability of HUVEC to form capillary-like structures. Taken together these results support our view that the ability of cells to remodel surface associated proteins affects strongly the biological performance of a biomaterial. They also show that the appropriate chemical functionalization (NH2, OH), combined with Col IV pre-adsorption, comprises a prospective biomimetic modification that might provide insights for the improved endothelization of cardiovascular implants.

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L'objectiu principal d'aquest treball ha estat la caracterització del procés demort cel·lular en la isquèmia en els cardiomiòcits. En el nostre estudi hem demostratque l'expressió de les principals proteïnes reguladores de la mort cel·lular dependentde caspases es reprimeix durant el desenvolupament cardíac. En correlació ambaquest fet hem observat que la mort cel·lular induïda per isquèmia és dependent decaspases als cardiomiòcits embrionals, mentre que els cardiomiòcits postmitòticsmoren de forma independent de caspases. En el nostre treball també hem demostratque Endonucleasa G (EndoG) és la principal nucleasa responsable de la degradacióde l'ADN, i en particular del senyal positiu de TUNEL, als cardiomiòcits postnatalsdurant la isquèmia, mentre que Apoptosis-inducing Factor (AIF) podria protegir lasupervivència dels cardiomiòcits durant la reoxigenació. La rellevància d'ambduesmolècules correlaciona amb els nostres resultats en què AIF i EndoG augmenten laseva expressió durant el desenvolupament cardíac. Per últim, hem determinat queBNIP3, membre de la família de Bcl2, controla el procés de degradació d'ADNdependent d'EndoG en la isquèmia cardíaca sense impedir l'alliberament d'aquestaproteïna del mitocondriFa més d'una dècada que es va suggerir per primera vegada la rellevància dela mort apoptòtica al cor en contraposició a la mort necròtica. Tot i que s'ha suggeritla implicació de la via apoptòtica dependent de receptors de mort, així com la viamitocondrial i, fins i tot s'ha descartat la implicació de caspases en la mortisquèmica, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats enaquests procés. En aquest context el nostre treball és rellevant perquè: descarta laimplicació de les caspases en la mort cardíaca durant la isquèmia, identifica aEndonucleasa G com a un executor de mort durant la isquèmia cardíaca i identifica aBNIP3 com a proteïna mitocondrial que indueix aquest mecanisme de mort. Lesnostres dades poden ajudar a interpretar la sortida de citocrom c i el senyal positiu deTUNEL, ja que hem determinat que Endonucleasa G origina el senyal de TUNEL enels cardiomiòcits i que la sortida de citocrom c no activa mort dependent de caspasesen els cardiomiòcits postnatals. / El objetivo principal de este trabajo ha sido la caracterización del proceso demuerte celular en cardiomiocitos durante la isquemia. En nuestro estudio hemosdemostrado que la expresión de las principales proteínas reguladoras de muertecelular dependiente de caspasas se reprime durante el desarrollo cardíaco. Encorrelación con este hecho hemos observado que la muerte celular inducida porisquemia es dependiente de caspasas en cardiomiocitos embrionales, mientras que loscardiomiocitos postmitóticos mueren de forma independiente de caspasas. En nuestrotrabajo hemos demostrado también que Endonucleasa G (EndoG) es la principalnucleasa responsable de la degradación de ADN en los cardiomiocitos postnatalesdurante la isquemia, y en particular de la señal positiva de TUNEL, mientras queApoptosis-inducing factor (AIF) podría proteger la supervivencia de loscardiomiocitos durante la reoxigenación. La relevancia de ambas moléculascorrelaciona con nuestros resultados en los que EndoG y AIF aumentan su expresióndurante el desarrollo cardíaco. Por último, hemos determinado que BNIP3, miembrode la familia de Bcl2, induce el proceso de degradación de ADN dependiente deEndoG durante la isquemia cardiaca sin impedir la salida de esta proteína de lamitocondria.Hace más de una década que se sugirió por primera vez la relevancia de lamuerte apoptótica en el corazón en contraposición a la muerte necrótica. A pesar deque se ha sugerido la implicación de la vía apoptótica dependiente de receptores demuerte, así como de la vía mitocondrial, e incluso se ha descartado la implicación decaspasas en la muerte isquémica, hoy en día aún se desconocen muchos de losmecanismos implicados en este proceso. Dentro de este contexto nuestro trabajo esrelevante porque: descarta la implicación de las caspasas en la muerte cardiacadurante la isquemia, identifica a Endonucleasa G como a un ejecutor de muertedurante la isquemia cardiaca e identifica a BNIP3 como a una proteína mitocondrialque puede controlar este mecanismo de muerte. Nuestros datos pueden ayudar ainterpretar la salida de citocromo c y la señal positiva de TUNEL, ya que hemosdeterminado que Endonucleasa G origina la señal de TUNEL en los cardiomiocitos yque la salida de citocromo c no activa muerte dependiente de caspasas encardiomiocitos postnatales. / Our main objective has been the characterization of the cell death mechanismin cardiomyocytes under ischemic conditions. In our research we demonstrated thatthe whole caspase-dependent pathway is silenced during heart development. Incorrelation to these results, we showed that ischemia-induced cell death is caspasedependentin embryonic cardiomyocytes, yet postmitotic cardiomyocytes die in acaspase-independent manner. Our work also disclosed that Endonuclease G (EndoG)is the main nuclease responsible for DNA degradation in postnatal cardiomyocytesand induces the TUNEL-positive labeling, while Apoptosis-Inducing Factor (AIF)plays a prosurvival role in cardiomyocytes during reoxygenation. The relevance ofboth molecules correlates with the observation that AIF and EndoG are upregulatedduring heart development contrary to the genes involved in caspase-dependent celldeath. Finally, our results show that BNIP3, a pro-death Bcl2 family member,induces EndoG-dependent DNA degradation without preventing EndoG release frommitochondria during ischemia.More than one decade ago, the relevance of apoptotic cell death wassuggested in heart in opposition to necrotic cell death. Death receptors and themitochondrial intrinsic pathway have been suggested to be involved in ischemiainducedcell death. Several authors have refused the implication of caspases inischemic cell death. However most of the mechanisms involved in that process arestill unknown. In that context our study is relevant because: it discards theinvolvement of caspases in ischemia-induced cardiac cell death, it identifiesEndonuclease G as a cell death executor during cardiac ischemia, and it identifiesBNIP3 as a mitochondrial protein controlling this cell death mechanism. Our datacontribute to understand cytochrome c release and TUNEL-positive labeling, as wehave determined that Endonuclease G produces TUNEL labeling in cardiomyocytesand that cytochrome c release doesn't activate caspase-dependent cell death inpostmitotic cardiomyocytes.

La citocina TWEAK pertany a la família del TNF i està implicada en diverses activitats biològiques com la proliferació, la diferenciació, la inflamació, la migració, i fins i tot la mort cel•lular; i senyalitza a través del seu receptor Fn14. Aquesta citocina es troba unida a la membrana (mTWEAK) o bé en forma soluble (sTWEAK) després d'un processament proteolític. Els nivells de sTWEAK estan disminuïts en malalties cardiovasculars. A més, s'ha descrit que sTWEAK pot interferir de forma negativa en l'activitat proinflamatòria de TNFα. Les dades que es mostren a continuació indiquen que TWEAK i Fn14 es sobreexpressen en el teixit adipós d'obesos severs. Curiosament, els adipòcits del teixit adipós subcutani d'aquests pacients mostren una major expressió de Fn14, mentre que els macròfags de tipus M2 expressen mTWEAK. A més, vam demostrar que TWEAK actua com una citocina proinflamatòria sobre l'adipòcit i que només la inflamació, però no la hipòxia ni l'estrès de reticle, pot regular l'expressió de TWEAK al macròfag i de Fn14 en l'adipòcit. Malgrat aquesta capacitat inflamatòria, hem demostrat una activitat competitiva de sTWEAK amb TNFα, en interferir amb aquest en esdeveniments de senyalització en l'adipòcit, provocant una modulació de la resposta inflamatòria induïda pel TNFα sobre aquest tipus cel•lular. Pel que fa a sTWEAK, la disminució observada en sèrum dels pacients amb obesitat severa podria afavorir la resposta inflamatòria del TNFα en aquest context. Els resultats que recull aquesta tesi apunten que l'eix TWEAK/Fn14 té un paper rellevant en la fisiopatologia de l'obesitat. / La inflamación sistémica crónica que existe en la obesidad está mediada por la presencia de citocinas proinflamatorias, tanto a nivel sistémico como local. Esta inflamación se ve favorecida por la presencia de hipoxia local y estrés de retículo endoplasmático en el tejido adiposo. TWEAK es una citocina de la familia del TNF implicada en diversas actividades biológicas como proliferación, diferenciación, inflamación, migración, incluso muerte celular, y señaliza a través de su receptor Fn14. Esta citocina se encuentra unida a membrana (mTWEAK) o en forma soluble (sTWEAK) tras un procesamiento proteolítico. Los niveles de sTWEAK están disminuidos en enfermedades cardiovasculares. Además, se ha descrito que sTWEAK puede interferir de forma negativa en la actividad proinflamatoria de TNFα. Los datos que se muestran a continuación indican que TWEAK y Fn14 se sobreexpresan en el tejido adiposo de obesos severos. Curiosamente, los adipocitos del tejido adiposo subcutáneo de éstos pacientes muestran una mayor expresión de Fn14, mientras que los macrófagos de tipo M2 expresan mTWEAK. Además, demostramos que TWEAK actúa como una citocina proinflamatoria sobre el adipocito y que sólo la inflamación, pero no la hipoxia ni el estrés de retículo pueden regular la expresión de TWEAK en el macrófago y de Fn14 en el adipocito. A pesar de esta capacidad inflamatoria, hemos demostrado una actividad competitiva de sTWEAK con TNFα, al interferir con éste en eventos de señalización en el adipocito, provocando una modulación de la respuesta inflamatoria inducida por TNFα sobre este tipo celular. Respecto a sTWEAK, la disminución observada en suero de los pacientes con obesidad severa podría favorecer la respuesta inflamatoria de TNFα en dicho contexto. Los resultados que recoge esta tesis apuntan a que el eje TWEAK/Fn14 tiene un papel relevante en la fisiopatología de la obesidad. / Chronic systemic inflammation in obesity is mediated by the presence of pro-inflammatory cytokines. This inflammation is favored by the presence of local hypoxia and endoplasmic reticulum stress in the adipose tissue. TWEAK is a TNF family member cytokine involved in various biological activities such as proliferation, differentiation, inflammation, migration, and even cell death. TWEAK signals through its receptor, Fn14. This cytokine is found as membrane-bound (mTWEAK) form or in soluble form (sTWEAK) due to proteolytic processing. sTWEAK levels are decreased in cardiovascular diseases. Morevoer, sTWEAK may interfere negatively on the proinflammatory activity of TNFα. The data presented in this Thesis indicates that TWEAK and Fn14 are overexpressed in adipose tissue of severely obese subjects. Interestingly, the adipocytes isolated from subcutaneous adipose tissue of these patients showed increased expression of Fn14, while M2 macrophages expresed mTWEAK form. Furthermore, we demonstrate that TWEAK acts as a proinflammatory cytokine over the adipocyte. Only inflammatory stimuli can regulate the expression of TWEAK in the macrophage and Fn14 on the adipocyte, not hypoxia or reticulum stress stimuli. Despite the inflammatory capacity observed for TWEAK, we have observed a competitive activity of sTWEAK over TNFα, interfering with signaling events in the adipocyte, causing a modulation of TNFα induced inflammatory response in this cell type. Regarding sTWEAK, the decrease in serum levels observed in severely obese subjects may favor the inflammatory response of TNFα in this context. The data from this Thesis suggest that TWEAK/Fn14 axis plays an important role in the pathophysiology of obesity.

Los puntos cuánticos son nanopartículas semiconductoras que exhiben unas propiedades ópticas y electrónicas dependientes del tamaño. Debido a sus dimensiones en el rango de 1-100 nm, la relación superficie-volumen de estos materiales llega a ser enorme y sus estados electrónicos se vuelven discretos. Además, por el hecho de que el tamaño del nanocristal es más pequeño que el de un excitón, las cargas están espacialmente confinadas y esto eleva sus energías en lo que se conoce como confinamiento cuántico. Así, las propiedades optoelectrónicas están atribuidas a este efecto de confinamiento y esto permite calibrar la emisión. Los puntos cuánticos tienen una fluorescencia muy estable en comparación con los fluoróforos orgánicos que la pierden en cuestión de minutos. Además, y contrariamente a los fluoróforosogánicos, estos nanocristales tienen una amplia excitación y una emisión estrecha lo que los hace extremadamente aplicables para visualización multicolor. Calibrar la longitud de onda de emisión de los puntos cuánticos es simplemente una cuestión de calibrar su tamaño. Por todo estas razones, explicadas en el capítulo 1, los puntos cuánticos han desplazado a los fluoróforos convencionales como método para visualización en los últimos 5 años. Estos puntos cuánticos son tóxicos y necesitan ser encapsulados para prevenir envenenamiento por metales pesados cuando son usados en bioaplicaciones. Un trabajo previo en nuestro laboratorio, detallado en el capítulo 2, encontró un método de síntesis capa-a-capa para obtener nanocebollas, que consisten en varias capas de sílica rellenas con diferentes puntos cuánticos. Esta disposición es muy útil para tener diferentes colores, como si fuesen viales diferentes, confinados en unos pocos nanómetros. La matriz de sílica juega un papel importante para hacer a los puntos cuánticos solubles en agua y proteger su fotoluminiscencia del efecto de apagado, al menos en el rago de pH útil para las aplicaciones viológicas. Cuanto mayor es el grosor de la capa de sílica o mayor el número de capas, mayor es la protección ofrecida a los puntos cuánticos del interior. Basándonos en este principio, mostramos que estas nanocebollas, que nosotros llamamos nanocebollasmulticódigo (Quantum-onion-multicode, QOM), pueden ser usadas como sensor de pH, como se detalla en el capítulo 3. Se ha demostrado que la relación entre la intensidad de fotoluminiscencia entre dos poblaciones de puntos cuánticos se corresponde con el valor de pH del medio, haciendo que nuestro sistema confiera un carácter potencialmente aplicable como sensor ratiométrico de pH. Además, el desarrollo de puntos cuánticos dentro de espferas de sílica como sondas biomoleculares puede dar nuevas percepciones para paliar algunas limitaciones que tienen los puntos cuánticos por sí mismos de forma individual como marcadores biológicos, por ejemplo: mejor fotostabilidad si están dentro de la matriz, mayor superficie disponible para reacciones químicas, mejor capacidad de unión de las esferas, menor toxicidad, y mejor manipulación. Sin embargo, la mayoría de las nanopartículas orgánicas requieren de una funcionalización química con silano, tiol, amino, carboxilo u otros grupos con el fin de otorgarles propiedades aplicables para ser suministradas a células, como son: buena compatibilidad, gran afinidad entre el transportador y la carga, marcaje celular, estabilidad y mayor tiempo de circulación. En el pasado, los hidróxidos de doble capa, también conocidos como materiales tipo hidrotalcita o arcillas aniónicas, han sido la excepción a esta regla. Estos materiales consisten en capas de nanoláminas cargadas positivamente en estructura tipo brucita neutralizada por aniones en el espacio interlaminar. Desde un punto de vista médico, se han publicado muchos cambios interesantes con estos materiales para albergar fármacos y biomoléculas ya sea por intercambio aniónico o por proceso de delaminación-relapilamiento. Este tipo de material has sido usado para transportar puntos cuánticos solubles en agua hechos de teulro de cadmio (capítulo 4) o nanopalos (capítulo 5). Por una parte, las hidrotalcitas intercalan a los puntos cuánticos de teluro de cadmio muy rápido y no se necesitan delaminarse previamente. El material híbrido muestra una alta estabilidad en medio fisiológico a diferentes pH, convirtiéndolo en una herramienta de visualización aplicable para el diagnóstico en nanomedicina. Notoriamente, las propiedades ópticas de los puntos cuánticos sufrieron un salto hacia el azul, atribuido a diferentes factores, como se detalla en el capítulo 4. Sin embargo, este efecto es reversible tras la disolución de la transportador sólido, la hidrotalcita. Con lo que podemos decir que los puntos cuánticos de teluro de cadmio muestran un efecto de memoria óptica. Estas transiciones ópticas se detienen cuando rodeamos los puntos cuánticos de una capa de sílica, preparando puntos cuánticos@silica/hidrotalcita, siendo la capa de sílica una barrera entre las nanopartículas y las arcillas. Esta combinación conduce a una barrera eficiente para los procesos de liberación de puntos cuánticos al medio biológico, tratándose por tanto de un andamiaje inorgánico nanoestructurado que evita toxicidad a la vez que permite una visualización múltiple y un diagnóstico simultáneo en sistemas terapéuticos avanzados. Por otro lado, se prepararon hidrotalcitas cargadas con partículas elongadas luminiscentes de CdSe@CdS, siendo la delaminación el mejor proceso para la carga debido al mayor tamaño de las nanopartículas, como se detalla en el capítulo 5. Este material híbrido resultó tener más luminiscencia y mayor tiempo de vida que cuando estaba cargado con puntos cuánticos, lo que supone una ventaja y un requisito para observaciones in vitro de tiempos prolongados. En consecuencia, se requieren una menor cantidad de nanopartículas y una menor excitación, lo que implica una menor toxicidad o daño a las células. Con estos resultados remarcamos que la combinación de dos campos como son el óptico y el de los nanomateriales, puede crear herramientos potentes para bioaplicaciones. En el capítulo 6, se usan cultivos celulares incubados con los materiales híbridos detallados en los capítulos 4 y 5 para demostrar la utilidad de esta clase de materiales como agentes de visualización. Observamos una dependencia respecto al diámetro de las nanopartículas y la calidad de los resultados, pero se necesitan más pruebas para esclarecer si esta correlación es verdadera o otros factores como la estructura del material transportador están implicados. Finalmente, en el capítulo 7, detallo como, combinando la especificidad de interacciones biomoleculares y la capacidad de calibrado de las propiedades ópticas de puntos cuánticos y fluoróforos, hemos desarrollado por primera vez un sistema in vitro para detectar fibrosis quística tanto de forma cualitativa (1nanoSi) como cuantitativa (2nanoSi). La novedad de nuestro sistema es el uso de procesos de transferencia de energía (FRET), cuyo mecanismo describe como se produce transferencia de energía de un dador (inicialmente en su estado electrónico excitado) y un aceptor a través de un emparejamiento dipolo-dipolo no radiativo. Para que se dé este proceso debe de haber un buen solapamiento entre la emisión del dador y la absorción del aceptor. Además, es un proceso muy dependiente y limitado por la distancia. Hemos anclado un péptido corto previamente marcado con un derivado de rodamina llamado TAMRA a la superficie de las nanoesferas rellenas de un tipo (1nanoSi, rellenas con CdSe540) o dos tipos (2nanoSi, rellanas con CdSe540 y CdSe660, siendo los números las longitudes de emisión) puntos cuánticos. Estas esferas se funcionalizaron con grupos amino para unir los péptidos marcados con TAMRA. Las secuencias de los péptidos diferían en un solo aminoácido: uno tiene prolina y el otro arginina en su lugar. La gente con fibrosis quística tiene mala digestión de péptidos porque los enzimas proteolíticos tienen problemas para llegar al duodeno, que es donde estos enzimas son activos. Elegimos la tripsina como enzima proteolítico por su especificidad de corte, ya que solo corta tras lisina y arginina pero no si estos van seguidos por prolina. Por tanto, en condiciones sanas, la secuencia peptídica sufrirá corte y no se observará FRET en el péptido que no tiene prolina. Al observar los espectros de emisión de los sistemas 1nanoSi vimso que había FRET debido a un buen solapamiento entre la emisión de los puntos cuánticos verdes (CdSe540) y la absorción del fluoróforo TAMRA. Cuando se produce el corte del péptido por la acción de la tripsina, se rompe este proceso de transferencia de energía y la relación entre la fluorescencia entre el dador y el aceptor cambia: el pico del TAMRA decrece mientras que el de los puntos cuánticos verdes aumenta durante la digestión. Pero estos es solo cualitativo, el sistema necesita un tercer componente que no se vea afectado por el FRET para ser cuantitativo. Decidimos usar puntos cuánticos rojos (CdSe660). Ahora nuestro sistema tenia dos capas (2nanoSi), la más interna rellena con puntos cuánticos rojos y la más externa con puntos cuánticos verdes. Tras observar los espectros de emisión vimos que solo cambiaban los picos de los puntos cuánticos verdes y fluoróforo, en cambio el pico de los puntos cuánticos rojos no variaba, lo que significa que solo se producía FRET entre los CdSe540 y el TAMRA. A pesar del pequeño solapamiento entre la emisión del TAMRA y la absorción de los puntos cuánticos rojos, la distancia entre ellos es demasiado grande y no se produce el FRET. Observamos diferentes comportamientos dependiendo de la concentración de tripsina. Usamos la relación entre la intensidad de fluorescencia entre las dos poblaciones de puntos cuánticos como sensor ratiométrico. Dibujando los valores de esta relación de intensidades a través del tiempo obtuvimos las cinéticas de la digestión para diferentes concentraciones de tripsina. A mayor concentración, más rápida era la digestión. La recta patrón resultante de dibujar los valores experimentales de la relación de intensidades I540/I660 para un tiempo de digestión de 10 minutos demostró una buena linearidad que permite determinar la concetración de enzima a niveles clínicamente relevantes para poder diagnosticar la fibrosis quística. En global, estos resultados nos permiten proponer el sistema 2nanoSi como un sensor ratiométrico de fluorescencia y herramienta para calcular la concentración de tripsina, siendo además un método para detectar la fibrosis quítica y otras enfermedades relacionadas con el páncreas fácil de usar, rápido y no invasivo.

Stroke and traumatic brain injuries are common causes of disability, with loss of nerve tissue due to secondary degeneration, gliosis, and often the formation of cavities that inhibit neural cell growth. Recent attempts at neural cell regeneration have therefore focused on the use of engineering materials that mimic the adult neural stem cell (NSC) niche, in order to establish an adequate environment for neurogenesis and differentiation. However, because the adult mammalian NSC niche has limited regenerative capacities, effective regeneration of the central nervous system (CNS) requires the reconstitution of its embryonic counterpart. Radial glia are bipolar cells with 1-2 µm-thick shafts that form a palisade and span the entire CNS parenchyma serving as substrates for neuronal migration. They contain high levels of glycogen and release L-lactate. Cerebral energy metabolism is a highly compartmentalized and complex process. The adult brain normally uses glucose as its primary energy source. However, before and immediately after birth, lactate is also an important energy source because at this time the level of glucose is low. Over the past decade, a role for lactate in fuelling the energetic requirements of neurons has emerged, not only during the perinatal period but also in adulthood. Initial evidence suggests that the metabolisms of NSC, neurons and astrocytes differ and that energy-dependent processes may influence the balance between NSC self-renewal and differentiation. The main goal of this thesis was to design an implantable biomaterial scaffold that reproduces the organization and supportive function of embryonic radial glia. Here we tested two types of poly L/DL lactic acid (PLA95/5 and PLA70/30), a biodegradable material permissive for neural cell adhesion and growth, as materials for nerve regeneration. PLA95/5 films were highly crystalline, stiff (GPa), and did not degrade significantly in the period analyzed in culture. In contrast, PLA70/30 films were more amorphous, softer (MPa) and degraded faster, releasing significant amounts of lactate into the medium. PLA70/30 performed better than PLA95/5 for primary cortical neural cell adhesion, proliferation and differentiation, maintaining the pools of neuronal and glial progenitor cells in vitro. Finally, for in vivo studies, we designed 3D cell-free biomimetic scaffolds consisting of electrospun PLA70/30 nanofibers. Radially aligned scaffolds released L-lactate and reproduced the 3D organization and supportive function of radial glia. These scaffolds implanted into cavities made in mouse brain fostered complete implant vascularization, sustained neurogenesis, and allowed the long-term survival and integration of the newly generated neurons. Our results suggest that PLA70/30 scaffolds mimic some of the physical and biochemical characteristics of the NSC niche. Overall, our results show that the endogenous CNS is capable of regeneration through the in vivo dedifferentiation induced by biophysical and metabolic cues, with no need for exogenous cells, growth factors, or genetic manipulation. / Las lesiones cerebrales son causas comunes de discapacidad que conllevan pérdida de tejido nervioso debido a la degeneración secundaria, la gliosis, y con frecuencia la formación de cavidades que inhiben el crecimiento neuronal. Recientemente, las terapias neuroregenerativas se han centrado en el uso de la ingeniería de materiales. Durante el desarrollo del SNC, las células de glia radial son las principales CMN que generan neuronas y glía y son retenidas en el cerebro adulto de especies que regeneran. Durante la neurogénesis temprana, los vasos sanguíneos invaden el SNC e interactúan con las CMN, dando lugar al nicho neurovascular. En el cerebro adulto, la glia radial puede ser recuperada al menos en cierta medida después de una lesión, lo que indica un intento endógeno en la reconstitución del nicho embrionario. Las células de glía radial son bipolares con 1-2 micras de espesor que forman una empalizada que abarca todo el parénquima del SNC sirviendo como sustrato para la migración neuronal. Esta glía radial contiene altos niveles de glucógeno liberando al exterior L-lactato. El metabolismo energético cerebral es un proceso altamente compartimentado y complejo. El cerebro adulto normalmente usa glucosa como fuente de energía primaria. Sin embargo, antes e inmediatamente después del nacimiento, el lactato es también una fuente de energía importante, debido a que los niveles de glucosa son bajos. En la última década, se ha visto que el lactato juega un papel importante como factor energético para las neuronas, no sólo durante el período perinatal sino también en la edad adulta. Nuevas evidencias sugieren que el metabolismo de las CMN, neuronas y astrocitos son diferentes y que los procesos dependientes de energía pueden influir en el equilibrio entre la auto-renovación y diferenciación de las CMN. El objetivo principal de esta tesis ha sido diseñar un andamio implantable que reprodujera la organización y función de soporte de la glía radial embrionaria. Para ello, hemos probado dos tipos de ácido poli L/DL láctico (PLA95/5 y PLA70/30), material biodegradable y permisivo para la adhesión y el crecimiento neuronal. Las películas de PLA95/5 eran cristalinas, rígidas (GPa), y no se degradaban significativamente en el período analizado durante el cultivo in vitro. Sin embargo, las películas de PLA70/30 eran más amorfas, menos rígidas (MPa) y se degradaban más rápido, liberando cantidades significativas de lactato en el medio. A diferencia del PLA95/5, en el 70/30 había una mejor adhesión neuronal, así como la proliferación y el mantenimiento de los progenitores neuronales y gliales in vitro. Finalmente, para los estudios in vivo, diseñamos andamios biomiméticos en 3D libres de células que consistían en nanofibras de PLA70/30. Los andamios radialmente alineados reproducían la organización 3D y la función de apoyo de la glía radial. Estos andamios implantados en la corteza cerebral del ratón ayudaron a la completa vascularización del implante, permitiendo la supervivencia y la integración a largo plazo de las neuronas recién generadas. Nuestros resultados sugieren que los andamios de PLA70/30 imitan algunas de las características físicas y bioquímicas del nicho neurovascular. En conclusión, nuestros resultados muestran que el SNC es capaz de regenerar de manera endógena a través de la des-diferenciación in vivo inducida por las señales biofísicas y metabólicas, sin necesidad de células exógenas, factores de crecimiento o manipulación genética

Estudi de l'avaluació de la possible contaminació de tipus genotòxic en l'abocador de Garraf (Barcelona), el qual recull els residus urbans de Barcelona i de les seves rodalies. Es va dur a terme el "Comet Test" (o SCGE: "Single Cell Gel Electrophoresis Assay") i el Test dels Micronuclis (MNT) en mostres de sang d'Apodemus sylvaticus (capturats a diferents àrees de l'abocador, i en una zona control lluny de la influència d'aquest i que pertany al Parc Natural del Garraf). Al mateix temps, es va aplicar la tècnica del Comet test en mostres de celomòcits d'exemplars d'Allolobophora caliginosa exposats a mostres de sòls procedents de l'abocador (5 zones situades a diferents distàncies d'aquest), i a mostres control. Per a les dues espècies utilitzades i els dos assaigs realitzats (SCGE i MNT en Apodemus, i SCGE en Allolobophora) es van obtenir valors majors de dany al DNA en les mostres de les zones d'influència de l'abocador respecte a les mostres control. No es va poder establir, pel cas dels lumbrícids, una relació del nivell de dany en relació a la distància a l'abocador (s'esperava una disminució dels valors, un apropament als valors control, quan les mostres fossin recollides més lluny de l'abocador). Mentre que en el cas dels ratolins, els valors corresponents a la zona més allunyada eren significativament menors que els obtinguts al voltant de la bassa de lixiviats. Les dues espècies, autòctones i abundants, poden servir com a bons sentinelles per a l'avaluació de la contaminació en l'abocador (tot i que en el cas dels lumbrícids utilitzats la interpretació pot ser més complicada).Un altre estudi es va centrar en l'avaluació de la contaminació de tipus genotòxic en mostres de sòl de Doñana, recollides l'any 2000 en diferents zones afectades pel vessament tòxic de l'accident de les mines d'Aznalcóllar de l'abril del 1998. Es van exposar varis exemplars d'Allolobophora caliginosa a les diverses mostres de sòl, i es va dur a terme el SCGE en celomòcits. Al mateix temps es van comparar els resultats obtinguts pel SCGE amb la concentració de metalls pesants mesurada en les mostres de sòl. Les mostres contaminades pel vessament tòxic i les mostres de referència de la mateixa zona (suposadament no afectades pel vessament) indiquen valors superiors amb el "Comet test" als de les mostres control. Una part molt important del treball realitzat es va basar en aspectes tècnics de l'assaig del cometa ("Comet test"), per poder conèixer una mica més el seu funcionament a nivell fisiològic i molecular. Així es van realitzar diversos estudis "in vitro" i "in vivo" per veure la possible interferència de la divisió cel·lular en els resultats del SCGE. Altres proves han estat dirigides a veure la relació que pot existir entre els resultats del SCGE i els estats d'apoptosi i necrosi de les cèl·lules, els quals podrien causar una interferència (de tipus citotòxic) en els resultats de l'assaig. Un altre estudi està centrat en el seguiment de la cinètica de reparació. A determinades dosis d'una substància genotòxica (òxid d'estirè) a les que es podia observar un nivell de dany al DNA (mesurat amb el "Comet test"), al cap d'un determinat temps es podia veure una disminució d'aquest dany, atribuïble a la reparació, tant en experiments "in vivo" com "in vitro". La incubació de les mostres amb l'enzim de reparació Endonucleasa III permetia augmentar la sensibilitat del test, detectant lesions de tipus oxidatiu, i d'altres, a més de les normalment detectades amb el "Comet test" sense l'ús d'aquests enzims. En aquests experiments es va poder detectar la dosi/dependència de l'efecte genotòxic de l'òxid d'estirè.