El teixit adipós blanc (WAT) exerceix un paper crític en el control del metabolisme de l'energia. En efecte, modificacions en la seva capacitat d'emmagatzematge o la seva funció endocrina, com en cas de l'obesitat i lipodistròfia, estan associades al desenvolupament de desordres metabòlics com resistència de la insulina i diabetis del tipus 2. Múltiples factors de transcripció i coreguladors modulen el desenvolupament apropiat i la funció del WAT. A més d'estar expressat en WAT, el paper de PGC-1β en aquest teixit encara no s'ha descrit. Per estudiar la seva funció en WAT, hem generat ratolins que manquen PGC-1β en teixits adiposos (PGC1β-FAT-KO) així com també un model in vitro en el qual PGC-1β es va silenciar en adipòcits 3T3-L1. L'anàlisi del perfil d'expressió gènica de WAT de ratolins de PGC1β-FAT-KO va revelar que PGC-1β regula gens mitocondrials implicats en la fosforilació oxidativa (OxPhos) i en el cicle de Krebs (TCA). Els nostres resultats mostren una correlació entre nivells mRNA disminuïts de gens de OXPHOS i els nivells de proteïnes codificades per aquests gens. A més, hem estudiat l'efecte down-regulació de gens diana de PGC-1β en la funció de mitochondrial. Hem analitzat l'activitat d'alguns enzims mitochondrials i hem trobat que l’activitat citrat sintasa i cytochrome c oxidasa disminueixen en WAT de ratolins PGC1β-FAT-KO, suggerint una disfunció mitochondrial. WAT és també el principal objectiu de les tiazolidinediones (TZDs), que es creu exerceixen el seu efecte sobre la sensibilització a la insulina mitjançant l'augment de la biogènesi mitocondrial en adipòcits. Un dels objectius d'aquest treball és el d'elucidar la contribució de PGC-1β per a aquest procés. Els nostres resultats mostren que PGC-1β s'indueix en WAT per estímuls farmacològics com TZDs, i també que PGC-1β, però no PGC-1α, és el principal mediador de l'augment de l'expressió de gens mitocondrials i la funció oxidativa induïda per TZDs en adipòcits blancs. De fet, l'ús de siRNA cobtra PGC-1β va demostrar que aquest coregulator es requereix per a l'augment d'expressió dels gens mitocondrials, el consum d'oxigen i l’oxidació de palmitat dependents de TZDs en cèl·lules 3T3-L1. A més, la supressió de PGC-1β en WAT va confirmar que PGC-1β és necessari per mediar el efectes de les TZDs sobre la inducció dels gens mitocondrials OxPhos, TCA i l'oxidació dels àcids grassos. No obstant això, els nostres resultats mostren que PGC-1β no és necessari per intervenir els efectes de les TZDs sobre biogènesi mitocondrial malgrat el seu paper de regulació transcripcional en processos oxidatius, ja que els ratolins augmenten normalment el seu mtDNA en resposta a la TZDs. D'altra banda, el treball actual és el primer a demostrar que no cal un ple metabolisme oxidatiu en WAT per la capacitat sensibilitzant de la insulina de les TZDs. A més dels adipòcits blancs, una proporció variable de adipòcits brite (cèl·lules capaces de dur a terme termogènesi) poden trobar-se en WAT. Per estudiar el paper de PGC-1β en el reclutament d'adipòcits marrons en WAT, hem exposat ratolins PGC1β-FAT-KO a CL-316,234, un β3-adrenergic agonista que és un potent inductor del reclutament de brite. Diverses evidències exposades en aquest treball donen suport al requisit de PGC-1β per a l'expressió de marcadors tipics d’adipocit marró en WAT. Per exemple, el tractament amb CL-316,234 indueix l’expressió de PGC-1β en paral·lel a l'expressió gens termogènics a WAT. Així mateix, l’estimulació β3-adrenèrgica millora l'expressió de gens OxPhos, TCA i de l’oxidació de lipids, a causa del elevat contingut mitocondrial dels adipòcits brite. L'absència de PGC-1β en WAT impedeix l’up-regulació β-adrenèrgic-dependent d'aquests mateixos gens, suggerint un paper de PGC-1β en l'expressió de marcadors de l'adipòcit marró en els adipòcits brite. En conjunt els nostres resultats indiquen que PGC-1β és important per a la funció mitocondrial basal i induïda per TZDs en WAT, que la capacitat oxidativa mitocondrial completa no és essencial per als efectes insulinosensibilitzants de les tiazolidinediones. D'altra banda, els nostres resultats suggereixen que PGC-1β és necessàri per a la diferenciació d'adipòcits brite en WAT induïda per diversos estímuls com les TZD i els β-adrenèrgics. / White adipose tissue (WAT) plays a critical role in the control of energy metabolism. Indeed, alterations in its storage capacity or its endocrine function, as in the case of obesity and lipodystrophy, are associated with the development of metabolic disorders such as insulin resistance and type 2 diabetes. Multiple transcription factors and coregulators modulate proper development and function of WAT. Besides being expressed in WAT, the role of the coactivator PGC-1β in this tissue has not been addressed yet. To study its function in WAT, we have generated mice that lack PGC-1β in adipose tissues (PGC1β-FAT-KO mice) as well as an in vitro model in which PGC-1β was knocked down in 3T3-L1 adipocytes. Gene expression profiling analysis of WAT from PGC1β-FAT-KO mice revealed that PGC-1β regulates mitochondrial genes involved in Oxidative Phosphorylation (OxPhos) and Tricarboxylic Acid Cycle (TCA). Our results show a correlation between decreased mRNA levels of OxPhos genes and the levels of proteins encoded by these genes. In addition, we have studied the effect of down-regulation of PGC-1β-target genes on mitochondrial function. We have analyzed the activity of some mitochondrial enzymes and have found that citrate synthase and cytochrome c oxidase activity are decreased in WAT of PGC1β-FAT-KO mice, suggesting a mitochondrial dysfunction. WAT is also the main target of thiazolidinediones (TZDs), which are thought to exert their insulin-sensitizing effects by promoting mitochondrial biogenesis in adipocytes. One of the objectives of this work is to elucidate the contribution of PGC-1β to this process. Our results show that PGC-1β is highly inducible in WAT by pharmacological stimuli like TZDs, and also that PGC-1β, but not PGC-1α, is the main mediator of the increase in mitochondrial gene expression and oxidative function induced by TZDs in white adipocytes. Indeed, the use of short interfering RNA against PGC-1β demonstrated that this coregulator is required for TZDs-dependent increases in mitochondrial gene expression, oxygen consumption and palmitate oxidation in 3T3-L1 cells. Additionally, targeted deletion of PGC-1β in WAT confirmed that PGC-1β is necessary to mediate TZDs-induction of mitochondrial genes related to OxPhos, TCA cycle and fatty acid oxidation. However, our results show that PGC-1β is not necessary to mediate the effects of TZDs on mitochondrial biogenesis despite its role in transcriptional regulation of oxidative pathways, since mice normally increase mtDNA in response to TZDs. Moreover, the current work is the first to show that full mitochondrial gene expression and oxidative metabolism in WAT is not required for the insulin-sensitizing capacity of TZDs. In addition to white adipocytes, a variable proportion of brite adipocytes (cells capable of carrying on thermogenesis) can be found in WAT. To study the role of PGC-1β in recruitment of brown adipocytes within WAT, we have exposed PGC1β-FAT-KO mice to the β3-adrenoceptor agonist CL-316,234, a potent inductor of brite recruitment. Several evidences exposed in this work support the requirement of PGC-1β for the expression of brown-characteristic markers in white adipose tissue. For instance, CL-316,234 treatment up-regulated PGC-1β in parallel to thermogenic gene expression in WAT. Likewise, β3-adrenergic stimulation enhanced the expression of OxPhos, TCA and lipid oxidation genes, owing to the elevated mitochondrial content of brite adipocytes. The absence of PGC-1β in WAT prevented β-adrenergic-dependent up-regulation of these same genes, suggesting a role of PGC-1β in the expression of brown adipocyte markers in brite adipocytes. Taken together our findings indicate that PGC-1β is important for basal and TZDs-induced mitochondrial function in WAT, and that induction of mitochondrial oxidative capacity is not essential for the insulin-sensitizing effects of thiazolidinediones. Moreover, our results suggest that PGC-1β is required for the differentiation of brite adipocytes within WAT induced by diverse stimuli like TZDs and β-adrenergic agonists.

La integridad del ADN del espermatozoide es de vital importancia, dado que puede comprometer la viabilidad del embrión. Para cuantificar la fragmentación en el ADN espermático se han desarrollado distintas técnicas, que han servido para relacionar dicha fragmentación con la esterilidad de origen masculino. Teniendo en cuenta que algunos de los individuos estériles van a someterse a técnicas de reproducción asistida, se ha valorado si la fragmentación en el ADN espermático i) disminuye tras procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, ii) tiene algún impacto sobre los resultados clínicos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, iii) se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos y/o anomalías cromosómicas en espermatozoides y iv) puede disminuir utilizando columnas MACS® para procesar la muestra seminal o acortando el periodo de abstinencia sexual. Los distintos resultados han concluido que el porcentaje de fragmentación en el ADN disminuye al procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, es independiente de los resultados clínicos obtenidos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, no se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos ni anomalías cromosómicas en espermatozoides y disminuye tanto procesando la muestra seminal mediante MACS como acortando el periodo de abstinencia. Estos resultados nos han permitido un mejor asesoramiento a los pacientes que presentan un alto porcentaje de fragmentación en el ADN espermático y ofrecer herramientas para disminuirlo. / Sperm DNA integrity is of vital importance, since it may jeopardize the viability of the embryo. To quantify the sperm DNA fragmentation various techniques have been developed which have been used to correlate the said fragmentation with male sterility. Given that some of the sterile individuals will undergo assisted reproductive techniques, it has been assessed whether the fragmentation in the sperm DNA i) decreases after processing the ejaculate by means of density gradients, ii) has any impact on clinical outcomes after an IVF cycle iii) correlates with the presence of abnormal meiotic spermatocytes and/or chromosomal abnormalities in sperm and iv) may decrease using MACS columns to process the semen sample or shortening the period of sexual abstinence. Our results have concluded that the percentage of fragmented DNA decreases if the ejaculate is processed by means of density gradient, is independent of the IVF cycle outcome, does not correlate with the presence of meiotic abnormalities in spermatocytes and chromosomal abnormalities in sperm, and can decrease by processing the ejaculate with MACS or shortening the period of abstinence. These results have allowed us to give a better advice to the patients with a high percentage of sperm DNA fragmentation and to provide tools to decrease it.

El Teixit adipós epicàrdic (TAE) és un dipòsit de greix visceral inusual amb continuïtat anatòmica i funcional amb les artèries coronàries i amb el miocardi. S’ha vist que en condicions fisiològiques el TAE mostra propietats cardioprotectores però en condicions patològiques el TAE pot afectar localment a les artèries coronàries a través de la secreció de substancies proinflamatòries i pot estar implicat en la patogènesi de l'aterosclerosi. L’objectiu d’aquest estudi es determinar el paper del TAE en la fisiopatologia de l’aterosclerosi i l’efecte de la senyalització dels receptors Toll like (TLR). S’analitzen en el TAE i en el teixit adipós subcutani (TAS) els tipus de poblacions, la secreció de citocines i d’adipocines, l’activació dels STATs i els nivells d’expressió gènica dels pacients amb aterosclerosi (CAD) i individus control (NCAD) en estat basal i després de l’estimulació amb lligands TLR. A més també s’analitza la secreció de citocines i adipocines en mostres de sang perifèrica dels dos tipus de pacients. Els resultats van mostrar que el TAE dels pacients amb CAD presenta importants infiltrats compostos per limfòcits B, limfòcits T i macròfags i més producció de citocines inflamatòries i menys producció de adiponectina i leptina comparat els individus NCAD. En el TAE dels pacients amb CAD els nivells d’activació basals de STAT1 es troben més elevats i els nivells d’activació basals de STAT3 es troben més baixos comparat els individus NCAD. Es detecten per immunohistoquímica presencia de cèl·lules mesotelials en el TAE i s’observa major expressió gènica de IL18, IL13-RA2, de queratines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) i de microRNAs (MIR-492 i MIR-622) en el TAE dels pacients amb CAD que reforcen la implicació de les cèl·lules mesotelials en la regulació del TAE i la seva implicació en la patologia CAD. A més en el TAS dels pacients amb CAD s’observa menor expressió gènica de varis membres de la família de RNAs petits nucleolar (snoRNAs): SNORD i SNORA. A mes, s’observa un perfil més proinflamatori del TAE en comparació el TAS, més marcat en els pacients amb CAD, tan a nivell basal com desprès de la resposta inflamatòria induïda pel lligands TLR. L’efecte de l’estimulació del teixit adipós a nivell d’expressió gènica mostra que la via canònica de l’interferó es trobava induïda exclusivament per LPS i no per FSL-1 i la xarxa integrada del PPAR-γ es troba reprimida exclusivament en el TAE i no en el TAS. A més en els pacients amb CAD mostren que els gens induïts tan a nivell basal com desprès de l’estimulació amb lligands TLR estan relacionats funcionalment amb la immunitat i per altra banda els individus NCAD inclouen gens induïts relacionats en el metabolisme Els nostres resultats mostren que tan el TAE com el TAS són capaços de respondre de manera adequada a l’estimulació dels lligands TLR, encara que el TAE mostra un perfil més inflamatori i disminució de l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme. Per altra banda hem vist que la presència de cèl·lules immunes en el TAE dels pacients amb CAD pot alterar el metabolisme normal amb major producció de citocines inflamatòries, menor producció de adipocines i diferent activació dels STATs. Aquestes dades semblen indicar que en el TAE dels pacients amb CAD l’augment de l’estat inflamatori provocaria una disminució de l’activitat metabòlica normal, sembla que l’estimulació del TAE aproparia els mecanismes fisiològics que ocorrien en la patologia de l’aterosclerosi. Aquestes dades recolzen la idea que el TAE dels pacients amb CAD estaria amb un estat de inflamació que es caracteritzaria per l’augment de les respostes immunes i una disminució de l’activitat metabòlica normal. / Epicardial adipose tissue (TAE) is an unusual visceral fat depot with anatomical and functional continuity with the coronary arteries and myocardium. Under physiological conditions TAE shows cardioprotective properties but in pathological conditions TAE can affect locally the coronary arteries by secretion of proinflammatory substances and may be involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to determine the role of TAE in the pathophysiology of atherosclerosis and the effect of Toll-like receptor signaling (TLR). We analyzed in TAE and subcutaneous adipose tissue (TAS) types of cells, cytokine and adipokines production, STAT activation and gene expression in patients with atherosclerosis (CAD) and control subjects (NCAD) in the basal state and after stimulation with TLR ligands. In addition, we also analyzed cytokine and adipokines secretion of peripheral blood samples in both types of patients. The results showed that the TAE of patients with CAD has lymphocyte infiltrates composed of B and T lymphocytes and macrophages and produce more inflammatory cytokines and less production of adiponectin and leptin compared NCAD subjects. We detected in TAE of patients with CAD higher activation of STAT1 and lower activation of STAT3 compared to NCAD subjects. We detected by immunohistochemistry mesothelial cells in TAE and higher gene expression of IL18, IL13-RA2, keratins (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) and microRNA (MIR-492 and MIR-622) in TAE of patients with CAD, this results reinforce the involvement of mesothelial cells in the regulation of TAE and its implication in the disease of CAD. Furthermore, we observed in TAS of patients with CAD lower gene expression of several members of the small nucleolar RNAs family (snoRNAs): SNORD and SNORA. We detected that TAE has higher proinflammatory profile compared to TAS, more marked in patients with CAD, both baseline and after stimulation by TLR ligands. The effect of stimulation with TLR ligands in adipose tissue gene expression shows that the canonical pathway of interferon was induced only by LPS and not by FSL-1 and integrated network of PPAR-γ is suppressed only in TAE and not in the TAS. Also, in patients with CAD genes induced at both baseline and after stimulation with TLR ligands are functionally related to immunity and in NCAD subject induced genes related to metabolism Our results show that TAE and TAS are able to respond appropriately to stimulation of TLR ligands, although the TAE shows more inflammatory profile and decreased expression genes related to metabolism. Furthermore, we have seen that the presence of immune cells in the TAE of patients with CAD may alter the normal metabolism with increased production of inflammatory cytokines, with lower production of adipokines and different activation of STATs. These data suggest that patients with CAD, has increased TAE inflammatory profile would cause a decrease in the normal metabolic activity, it appears that stimulation TAE approaching physiological mechanisms that happened in the pathology of atherosclerosis. These data support the idea that the TAE patients with CAD would be a state of inflammation characterized by increased immune responses and decreased of normal metabolic activity.

El desarrollo de biomateriales para ingeniería de tejido es un campo muy complejo y prolífico que en el que se combinan la ingeniería de materiales, la química, la biología celular y la medicina. Cada año se publican nuevas y prometedoras ideas que requieren de estudios in vivo e in vitro antes de realizar pruebas clínicas. Por desgracia, las condiciones in vitro son muy diferentes a las de la vida real y muchas de estas prometedoras ideas fracasan cuando son probadas en animales. El número de combinaciones posibles de tipos celulares, factores y biomateriales es inmenso, por lo que sería de gran ayuda establecer plataformas que permitan identificar las combinaciones óptimas para la obtención de características clave, como podría ser la capacidad angiogénica, o la inducción de la diferenciación celular a un determinado linaje. En esta tesis se demuestra el gran potencial de la imagen bioluminescente no invasiva (BLI) para analizar las interacciones célula‐scaffold in vivo. BLI permite monitorizar en tiempo real el número de células y su distribución en el scaffold, así como cambios en la expresión de ciertos genes mediante el uso de promotores inducibles tejido‐específicos. Esto proporciona información muy útil sobre el comportamiento in vivo del scaffold y sobre qué características deberían ser mejoradas para obtener los resultados deseados. Combinando esta información en tiempo real con otras tecnologías de imagen es posible obtener una visión completa sobre el comportamiento del material. Como “prueba de principio” de la aplicación de BLI para la evaluación de scaffolds para reparación tisular se han utilizado dos materiales muy diferentes, desarrollados por nuestros colaboradores. En el primer caso se ha demostrado la capacidad angiogénica de un nuevo material compuesto de ácido poliláctico (PLA) y vidrio de fosfato cálcico (CaP). Los resultados de BLI, que muestran que la inclusión de las partículas de CaP mejora la capacidad angiogénica del material, fueron validados mediante inmunohistoquímica. En el segundo caso se ha evaluado un scaffold de fibrina diseñado para liberar factores de crecimiento (GFs) utilizando un modelo murino de regeneración ósea. Los resultados de BLI mostraron que este scaffold induce la diferenciación osteoblástica, pero no endotelial, en células mesenquimales (MSCs) centinela. Estos resultados fueron corroborados mediante μCT, que mostró que la liberación de GFs da lugar no sólo a la formación de hueso más grueso, sino también a la formación de estructuras vasculares más densas. Mediante la combinación de BLI y μCT se pudo comprobar que las MSCs centinelas no se diferencian a linaje endotelial pero tienen un papel relevante en la inducción de conexiones intravasculares. Entender la respuesta de las células a cambios físicos (fuerzas de cizalla, hipoxia, etc.) dentro de los scaffolds puede ayudar al desarrollo de scaffolds para aplicaciones específicas. Inspirados por estas consideraciones iniciamos un ambicioso proyecto para desarrolla un minibioreactor para el análisis de las interacciones entre scaffolds y las células sin tener que recurrir a animales vivos. Este biorreactor, basado en la misma plataforma de bioluminiscencia, permite el análisis en tiempo real de la supervivencia y la diferenciación celular dentro de los biomateriales bajo flujo dinámico, pudiendo ser utilizado como paso intermedio entre los estudios in vitro e in vivo, agilizando los ciclos de diseño ‐ prueba‐rediseño de los scaffolds. Por otra parte, los biorreactores son cada vez más importantes en la ingeniería de tejidos ya que permiten la producción segura y reproducible de tejidos para aplicaciones clínicas. Este dispositivo, monitorizado por BLI, puede ser una herramienta muy útil para optimizar la siembra de células en los scaffolds, permitiendo la cuantificación de la supervivencia celular y la visualización de su distribución a lo largo del scaffold bajo condiciones de cultivo customizables. Se ha diseñado un prototipo de biorreactor utilizando un scaffold modelo y se ha utilizado para visualizar satisfactoriamente la siembra de MSCs, su distribución y su supervivencia bajo diferentes condiciones, así como su diferenciación en respuesta a agentes inductores. / Biomaterial development for Tissue Engineering is a very complex and prolific research field overlapping material engineering, chemistry, cell biology and medicine fields; every year promising new devises comprising materials, growth factors and cells are reported that require in vitro and in vivo studies previous to clinical evaluation. Unfortunately, in vitro conditions are very far removed from those in real life and many initially promising devices fail when tested in live animals. The number of possible combinations between cell types, factors and biomaterials is so large that testing platforms that can rapidly screen and identify optimal formulas, e.g., that emphasize key characteristics such as angiogenic capacity or promotion of differentiation to specific lineages would facilitate devise development. In this thesis we demonstrated the potential of noninvasive bioluminescence imaging (BLI) to analyze cellscaffold interactions in live animals. BLI allows the real‐time monitoring of cell number and distribution within the scaffolds. Furthermore, by using tissue‐specific inducible promoters, changes in expression of specific genes related to cell differentiation or hypoxic state can also be monitored. This provides very useful information about the scaffold behavior in vivo and about what characteristics should be improved to obtain the desired results. By combining the real‐time data from this bioluminescence platform with other end point imaging technologies, it is possible to obtain a full vision of the biomaterial behavior. We used two very different biomaterials developed by collaborators to illustrate as “proof of principle” the application of in vivo BLI technology in the evaluation of bio‐engineered scaffolds for tissue repair. In the first case we proved the angiogenic capacity of a new composite biomaterial comprising poly(lactic acid) (PLA) and calcium phosphate (CaP) glass. Our BLI results, indicating that inclusion of CaP particles on PLA improved the angiogenic capacity of the material, were also validated using standard immunofluorescent staining and histological procedures for vessel quantification. In the second case, we evaluated a GF‐delivering fibrin scaffold engineered for bone repair using a mice bone regeneration model. Our BLI results indicated that the GF‐delivering material had the capacity to induce osteoblastic, but not endothelial, differentiation in sentinel mesenchymal stem cells. Our BLI results were corroborated by μCT analysis that showed not only that thicker bone, but also denser vascular structures were induced by the delivery of GF. Again, the combination of BLI and μCT analysis indicated that sentinel cells while not differentiating to the endothelial lineage, did have a relevant paracrine role inducing abundant intervascular connections. Understanding the response of cells within biomaterials to changing physical parameters (e.g.: response to shear stress, hypoxia etc.) is valuable information to guide the development of scaffolds for specific applications. Inspired by these considerations we initiated an ambitious approach to develop a minibioreactor system useful for the analysis of cell‐scaffold interactions without having to resort to live animals. This bioreactor system, based in the same bioluminescent platform, allows real‐time analysis of cell survival and differentiation within the biomaterial under dynamic flow conditions and it could be considered as an intermediate step between in vitro and in vivo studies, facilitating the biomaterial design‐test‐redesign cycle. This type of device is important due to additional considerations. Bioreactors are becoming increasingly more important as they allow safe and reproducible production of scaffold‐tissue composites for clinical applications. Thus, BLI monitored system could also be a useful tool for designing and optimizing cell seeding of scaffolds; allowing the quantification of cell survival, and the visualization of cell distribution along the scaffold under customizable culture conditions. We have made progress in this area also, and a small bioreactor prototype comprising a model biomaterial was constructed and successfully used to illustrate cells distribution and survival under dynamic seeding conditions, as well as proliferation and differentiation in response to inducing agents.

Durante el ictus, los niveles elevados de glutamato extracelular, el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central, aumentan y se unen al receptor de NMDA promoviendo la excitotoxicidad. Esta situación genera que un flujo excesivo de Ca2+ pase a través del receptor de NMDA aumentando sus concentraciones intracelulares activando toda una serie de cascadas de señalización que pueden actuar directamente sobre las mitocondrias, promoviendo varios programas de muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que constantemente se fusionan y dividen, cambiando de forma y localización. El equilibrio entre la fisión y la fusión es importante para la función mitocondrial y es un regulador clave de la progresión de la muerte celular. Las proteínas que conforman el proceso de fusión mitocondrial y de fisión están formadas por un grupo de GTPasas. La fusión de la membrana mitocondrial interna está mediada por OPA1. Dos mitofusinas (Mfn1 y 2) median la fusión de la membrana externa mitocondrial. Por otro lado, la fisión mitocondrial está mediada por Drp1, una proteína citoplasmática que es reclutada a la superficie mitocondrial después de ser modificada a nivel post-traduccional. Los problemas relacionados con la dinámica mitocondrial se han descrito en múltiples enfermedades neurodegenrativas así como también en cáncer y sida. En esta Tesis hemos demostrado que Mfn2 juega un papel muy importante en el mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial y la supervivencia neuronal. En excitotoxicidad es la única proteína de la maquinaria de fusión/fisión que disminuye su expresión en dos modelos in vitro distintos y también en un modelo in vivo. Hemos identificado dos fases de fragmentación mitocondrial en excitotoxicidad. La primera y que cursa en poco tiempo depende de la activación y reclutamiento de Drp1 mientras que la fase tardana que se inicia 4 horas después del insulto, parece depender de la reducción de los niveles proteicos de Mfn2. Esta fase tardía es irreversible y parece condenar a la neurona. La disminución de Mfn2 genera alteraciones en la homeóstasis del Ca2+, disminuye el potencial de membrana mitocondrial, empeora la comunicación entre las mitocondrias y el retículo endoplasmático, aumenta la traslocación de Bax a las mitocondrias y favorece la liberación del citocromo c. Hemos encontrado que la reducción en la expresión de Mfn2 durante la excitotoxicidad se da a nivel transcripcional y depende del factor de transcripción MEF2 que regula a Mfn2 a nivel basal en neuronas. En excitotoxicidad, MEF2 es degradado y causa la disminución de Mfn2. Este contexto hace pensar que Mfn2 podría ser una diana a tener en cuenta para futuros desarrollos de drogas y poder, de este modo, incrementar la pequeña ventana terapéutica que existe actualmente para el ictus. / Mitochondrial fusion and fission is a dynamic process critical for the maintenance of mitochondrial function and cell viability. During excitotoxicity neuronal mitochondria are fragmented, but the mechanism underlying this process is poorly understood. Here, we show that Mfn2 is the only member of the mitochondrial fusion/fission machinery whose expression is reduced in in vitro and in vivo models of excitotoxicity. Whereas in cortical primary cultures, Drp1 recruitment to mitochondria plays a primordial role in mitochondrial fragmentation in an early phase that can be reversed once the insult has ceased, Mfn2 downregulation intervenes in a delayed mitochondrial fragmentation phase that progresses even when the insult has ceased. Downregulation of Mfn2 causes mitochondrial dysfunction, altered calcium homeo- stasis, and enhanced Bax translocation to mitochondria, resulting in delayed neuronal death. We found that transcription factor MEF2 regulates basal Mfn2 expression in neurons and that excitotoxicity- dependent degradation of MEF2 causes Mfn2 downregulation. Thus, Mfn2 reduction is a late event in excitotoxicity and its targeting may help to reduce excitotoxic damage and increase the currently short therapeutic window in stroke.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Els trastorns mentals com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor i l’ansietat són unes patologies amb un gran impacte i una alta prevalença en la nostra societat. Una de les característiques d’aquestes patologies són els problemes de plasticitat sinàptica, com per exemple, la neurogènesi del gir dentat, que a més s’ha relacionat amb problemes cognitius i també amb patologies psiquiàtriques. En els darrers anys s’ha suggerit que la desregulació de processos del desenvolupament neuronal, ja sigui per alteracions genètiques o factors ambientals, poden ser la clau per explicar l’etiologia d’aquestes malalties. La Reelina és una proteïna de matriu extracel·lular essencial pel desenvolupament neuronal, a més de regular processos de plasticitat sinàptica i transmissió glutamatèrgica, tant en el cervell en desenvolupament com a l’adult, a més d’estar disminuïda en patologies com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor, tot i que el paper que aquesta hi juga encara no està descrit. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat investigar el paper de la Reelina en les malalties psiquiàtriques, tant el possible paper en l’etiologia com en la protecció d’aquestes malalties, a més d’investigar si tenia un paper en la correcta generació de noves neurones. Per tal de portar a terme aquest objectiu, vam utilitzar un ratolí que sobreexpressa Reelina al cervell anterior adult i el vam sotmetre a una bateria de testos de comportament per modelar aspectes de malalties psiquiàtriques com el cap obert, la caixa blanca i negra, el test de natació forçada després d’un tractament crònic de corticosterona, la sensibilització a la cocaïna o dèficits en la inhibició per pre-pols induïda per l’administració d’antagonistes dels receptors N- metil-D-aspartat (NMDAR). Amb aquests testos vam comprovar que la sobreexpressió de Reelina protegia de l’aparició de comportaments esquizofrènics i depressius i que aquesta resiliència es produïa per un una disminució de la transmissió glutamatèrgica a través de la subunitat NR2B dels receptors NMDA. A més de demostrar-ne un paper protector, amb la utilització d’un ratolí transgènic floxed dab1 hem comprovat que una disminució transitòria durant el desenvolupament de l’efector intracel·lular de la via de senyalització de la Reelina, Dab1, provoca alteracions permanents en la laminació del còrtex i hipocamp. A més, la regulació transitòria a la baixa durant el desenvolupament d’aquesta via provoca alteracions de comportament en els ratolins adults com dèficits de memòria, cura maternal, inhibició per pre-pols o sensibilització a la cocaïna, i que alguns d’aquests dèficits ja estaven presents durant l’adolescència. A més, hem pogut rescatar els dèficits cognitius amb un potenciador de la neurotransmissió glutamatèrgica com és la D-cicloserina. Per acabar, vam voler comprovar si un procés de plasticitat alterat en patologies psiquiàtriques com la neurogènesi adulta estava regulat pels nivells de Reelina. Amb la utilització del marcatge específic de les noves neurones mitjançant retrovirus, vam poder veure que la Reelina també controla aquest procés. Hem vist que la via de senyalització és essencial pel correcte desenvolupament, ja que la manca de senyalització d’aquesta via provoca la formació de neurones aberrants, molt menys complexes i amb una gran quantitat de dendrites basals pròpies de processos patològics, i tot i aquesta morfologia alterada, aquestes neurones aconseguien integrar-se en el circuit. A més, hem comprovat que un augment dels nivells de Reelina provoca l’acceleració del procés de maduració. En resum, hem vist que la Reelina té un paper essencial en la protecció envers el desenvolupament de malalties psiquiàtriques, ja que mentre la falta de senyal provoca l’aparició de fenotips, l’augment en provoca la resistència. A més, hem comprovat que un procés alterat en aquestes patologies com és la neurogènesi adulta, també està regulat per la Reelina. / Schizophrenia, mood, and anxiety disorders are devastating diseases with high prevalence and comorbidity rates in our society. Dysregulation of key developmental processes, caused by environmental and/or genetic risk factors, is associated with the pathogenesis of neuropsychiatric diseases. One feature of these diseases are alterations in synaptic plasticity like adult neurogenesis. Reelin is an extracellular matrix protein essential for the neurodevelopment, and has been shown to regulate glutamatergic neurotransmission in both developing and adult neurons. Moreover, Reelin expression is decreased in psychiatric disorders. The aim of this thesis was to rule out the role of Reelin in psychiatric disease, in the aetiology and a possible protection role, and study how Reelin pathway regulates adult neurogenesis. To do that, we used a transgenic mouse that overexpress Reelin in the adult forebrain and we subjected it to a battery of behavioural tests to model some aspects of psychiatric disorders such as schizophrenia, mood, and anxiety disorders. Interestingly, overexpression of Reelin lead to a resistance against behaviours related to psychiatric diseases, thanks to a reduction of NMDA NR2B-mediated synaptic transmission. Next we used a floxed dab1 allele to study whether a transient decreased in Dab1 during development, a key component of the Reelin pathway, is sufficient to induce behavioural deficits related to psychiatric disorders. We found that transient Dab1 downregulation during perinatal stages leads to permanent abnormalities of structural layering and behaviour impairments in the adult mice. Finally, using retroviral reporters in our two model mouse we show that whereas overexpression of Reelin accelerate adult neurogenesis, cell-autonomous inactivation of Dab1 in the new granule cells resulted in aberrant migration, decreased dendrite development, formation of ectopic dendrites in the hilus and the establishment of aberrant circuits. All together these data points an important role of Reelin against the development of neuropsychiatric, overexpression of Reelin protects against this disorders and the disruption of Reelin pathway leads to the development of them. Moreover, Reelin is a key regulator of adult neurogenesis, a process related to the pathogenesis of several neurological and psychiatric disorders.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Los cuerpos lipídicos (CLs) son los principales orgánulos encargados del almacén de lípidos, siendo el mayor reservorio energético de las células. Están formados por un núcleo de lípidos neutros hidrófobos separados del citoplasma por una monocapa de fosfolípidos en la que se anclan determinadas proteínas. Fueron descritos a finales del siglo XIX por Hanstein, Altmann y Wilson en diferentes publicaciones y originalmente fueron llamados liposomas o microsomas. Desde entonces estos orgánulos han sido denominados de múltiples maneras: cuerpos lipídicos, gotas lipídicas, adiposomas, gránulos, inclusiones lipídicas, triglicéridos intramiocelulares, partículas lipídicas, oleosomas o cuerpos de aceite. Inicialmente fueron considerados como simples orgánulos estáticos únicamente implicados en el almacén lipídico y básicamente importantes en tejidos especializados como el tejido adiposo. No obstante, la presencia de CLs no es exclusiva de tejidos especializados como el adiposo, sino que sucede en todas las células eucariotas y en muchos procariotas. En la última década el número de estudios sobre estos orgánulos ha incrementado exponencialmente especialmente desde el descubrimiento de la perilipina, la primera proteína residente en CLs descrita, en el laboratorio de C. Londos en 1991. Poniendo de manifiesto que se trata de orgánulos complejos, recientemente se ha descrito la implicación de los CLs en múltiples procesos como el metabolismo energético, la síntesis de lípidos y hormonas, la señalización celular, el almacén y la degradación de proteínas, la secreción de lipoproteínas, la respuesta inflamatoria, el ciclo vital de algunos patógenos, el cáncer o la longevidad. Además, la acumulación excesiva de CLs es una característica común en múltiples patologías asociadas con la obesidad como el síndrome metabólico, la esteatosis hepática y la ateroesclerosis, subrayando la relevancia del estudio de la biología de estos orgánulos.

In this thesis we develop a multi-scale model of the evolutionary dynamics of a population of cells, which accounts for the mapping between genotype and phenotype as determined by a model of the gene regulatory network. We study topological properties of genotype-phenotype networks obtained from the multi-scale model. Moreover, we study the problem of evolutionary escape and survival taking into account a genotype-phenotype map. An outstanding feature of populations with genotype-phenotype map is that selective pressures are determined by the phenotype, rather than genotypes. Our multi-scale model generates the evolution of a genotype-phenotype network represented by a pseudo-bipartite graph, that allows formulate a topological definition of the concepts of robustness and evolvability. We further study the problem of evolutionary escape for cell populations with genotype-phenotype map, based on a multi-type branching process. We present a comparative analysis between genotype-phenotype networks obtained from the multi-scale model and networks constructed assuming that the genotype space is a regular hypercube. We compare the effects on the probability of escape and the escape rate associated to the evolutionary dynamics between both classes of graphs. We further the study of evolutionary escape by analysing the long term survival conditioned to escape. Traditional approaches to the study of escape assume that the reproduction number of the escape genotype approaches infinity, and, therefore, survival is a surrogate of escape. Here, we analyse the process of survival upon escape by taking advantage of the fact that the natural setting of the escape problem endows the system with a separation of time scales: an initial, fast-decaying regime where escape actually occurs, is followed by a much slower dynamics within the (neutral network of) the escape phenotype. The probability of survival is analysed in terms of topological features of the neutral network of the escape phenotype. / En aquesta tesi es desenvolupa un model multi-escala de la dinàmica evolutiva d'una població de cèl·lules, tenint en compte la correspondència entre el genotip i el fenotip determinat per un model de la xarxa de regulació genètica. Estudiem les propietats topològiques de les xarxes genotip-fenotip obtingudes a partir del model multi-escala. D'altra banda, s'estudia el problema de la fugida evolutiva i la supervivència, tenint en compte una aplicació entre genotip i fenotip. Una característica destacable de les poblacions amb aplicació genotip-fenotip és que les pressions selectives actuen sobre els fenotips, en lloc dels genotips. El nostre model multi-escala genera l'evolució d'una xarxa genotip-fenotip representada per un graf pseudo-bipartit, el qual permet formular una definició topològica dels conceptes de robustesa y capacitat evolutiva. A més a més, estudiem el problema de fugida evolutiva de poblacions de cèl¿lules amb una aplicació genotip-fenotip, basat en en un procés de ramificació multi-tipus. Presentem un anàlisi comparatiu entre les xarxes de genotip-fenotip obtingudes a partir del model multi-escala i les xarxes construïdes assumint un espai de genotips de tipus hipercub regular. Comparem els efectes de la probabilitat de fugida i la freqüència d'escapament associades a la dinàmica evolutiva entre ambdues classes de grafs. Anem més enllà de l'estudi de fugida evolutiva mitjançant l'anàlisi de la supervivència a llarg plaç condicionat a fugir. Els enfocaments tradicionals per a l'estudi de la fugida o escapament suposen una taxa de reproducció en el genotip de fugida propera a infinit. Per tant, la supervivència és equivalent a la fugida. Aquí analitzem el procés de supervivència suposant fugida aprofitant el fet que l'entorn natural del problema de fugida dota al sistema amb una separació d'escales de temps: un règim inicial, de temps ràpid, on la fugida realment es produeix; seguit d'una dinàmica molt més lenta dins de la (xarxa neutra del) fenotip de fugida. La probabilitat de supervivència s'analitza en termes de les característiques topològiques de la xarxa neutra del fenotip de fugida

L’estudi citogenètic de les neoplàsies hematològiques és de gran importància en la pràctica clínica des del punt de vista diagnòstic, pronòstic i patogenètic. La identificació d’alteracions citogenètiques en les proliferacions limfoides és dificultosa degut al baix índex mitòtic dels limfòcits B madurs, a l’obtenció de metafases normals sovint no corresponents a la clona maligna o amb d’alteracions submicroscòpiques/críptiques impossibles d’identificar en metafase mitjançant les tècniques de bandeig G, i a la mala qualitat cromosòmica de les proliferacions agudes. Mitjançant les tècniques d’estimulació i separació cel·lular i la hibridació in situ fluorescent (FISH) s’han estudiat diferents neoplàsies que es desenvolupen al llarg de la limfopoesi B com la leucèmia limfoblàstica aguda B (LLA-B), la leucèmia limfàtica crònica (LLC), i neoplàsies de cèl·lules plasmàtiques (CP) com la gammapatia monoclonal de significat incert (GMSI) i el mieloma múltiple (MM). En la LLA-B s’han identificat dues translocacions amb implicació del gen IGH no descrites fins al moment. Són la t(2;14)(q14.3;q32) i la t(14;17)(q32;q21) i contribueixen a la formació d’un nou subgrup de pacients en la classificació de la WHO. En la LLC s’ha comparat la FISH interfàsica (I-FISH) en cultius de sang perifèrica estimulats amb phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA) i en cèl·lules mononucleades deseparades per gradient de densitat (CMGD) per a la detecció d’alteracions cromosòmiques. La I-FISH-TPA ha incrementat el percentatge de nuclis patològics i ha identificat més alteracions que la I-FISH-CMGD i s’ha observat que la I-FISH-TPA és especialment útil en els pacients amb un recompte de limfòcits baix. A més, s’ha avaluat la supervivència lliure de tractament (SLT) i la supervivència global, i s’ha observat que la I-FISH-TPA prediu millor la SLT que la I-FISH-CMGD, incrementant el valor pronòstic de la I-FISH. També els cultius estimulats amb TPA han permès analitzar la metafase i caracteritzar les delecions 13q14 identificada mitjançant I-FISH-TPA. S’ha observat que les delecions 13q14 monoal·lèlica i submicroscòpica són les més freqüents. Les delecions grans s’observen únicament dins les monoal·lèliques i les submicroscòpiques associades a translocació són més freqüents dins les bial·lèliques i semblen degudes a evolució clonal. S’han identificat quatre translocacions 13q14 no descrites fins al moment amb deleció associada. Aquestes són la der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), la t(1;5;13)(p36;q31;q14), la t(9;13)(q31;q14-21) i la t(10;13)(p14-15;q12). En les neoplàsies de CP s’ha realitzat la I-FISH en CP (I-FISH-CP) separades amb partícules immunomagnètiques MACS i, en els casos amb delecions 13q, s’ha comparat la detecció de les alteracions respecte la I-FISH en cultius de MO (I-FISH-MO). El percentatge de nuclis patològics observat mitjançant I-FISH-CP és superior que en I-FISH-MO, la qual només detecta el 26% dels casos patològics. Es conclou que la I-FISH-CP és la tècnica d’elecció per a la detecció de les alteracions especialment en casos amb baixa infiltració de CP en MO. / Cytogenetic studies in haematological malignancies are important in clinical practice from the diagnostic, prognosis to pathogenetics point of view. The Identification of chromosomal aberrations in lymphoid proliferations is hampered by the low mitotic index of mature B-cells, the presence of normal metaphases that frequently do not correspond to the malignant clone or hidden submicroscopic/cryptic deletions that escape from G-banding resolution, and poor chromosome quality in acute proliferations. Using cell stimulation and separation techniques and fluorescence in situ hybridisation (FISH) we have studied several lymphoid neoplasms that develop along B-cell lymphopoiesis such as B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (BCP-ALL), chronic lymphocytic leukaemia (CLL), and plasma cell neoplasms such as monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and plasma cell myeloma (MM). In BCP-ALL, we have identified two novel translocations involving the IGH gen located at 14q32, namely t(2;14)(q14.3;q32) and t(14;17)(q32;q21), and contribute to the formation of a new group of patients in the WHO classification. In CLL, we have compared interphase FISH (I-FISH) on cultured peripheral blood (PB) stimulated with phorbol-12-miristate-13-acetate (TPA) and on PB mononuclear cells separated by density gradient (PBMC) for the detection of chromosomal aberrations. I-FISH-TPA has increased the percentage of abnormal nuclei and the detection of chromosome abnormalities compared to I-FISH-PBMC. We have observed that I-FISH-TPA is especially useful in patients with low lymphocyte count. Additionally, we have evaluated treatment-free survival (TFS) and overall survival (OS) and we observed that I-FISH-TPA provided a better prediction of TFS and OS than I-FISH-PBMC, improving the prognostic value of I-FISH. Moreover, TPA-stimulated cultures have allowed to analyse metaphases and the characterization of 13q14 deletions identified by I-FISH-TPA. We observed that the most frequent deletions are monoallelic and submicroscopic deletions. Large deletions are only observed within the monoallelic group, and translocation-associated deletions are more frequent in the biallelic group, which seems to be related to clonal evolution. Among these cases we identified four 13q translocations with deletion not previously described such as der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), t(1;5;13)(p36;q31;q14), t(9;13)(q31;q14-21) and t(10;13)(p14-15;q12). In plasma cell neoplasms, we have performed I-FISH on plasma cells (PC) isolated by MACS immunomagnetic beads, and in cases with 13q deletion, we have analysed with I-FISH bone marrow cultures (BM) for the detection of 13q abnormalities. The percentage of abnormal nuclei observed by I-FISH-PC was higher than I-FISH-BM, which only detects the 26% of abnormal cases. Consequently, I-FISH-PC is the technique of choice for the detection of chromosomal abnormalities especially in those cases with low PC infiltration in BM.

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia metabòlica causada per la destrucció selectiva de les cèl·lules β pancreàtiques productores d’insulina per part del sistema immunitari. Actualment no hi ha cura ni prevenció per restaurar la secreció endògena d’insulina als pacients amb DT1. Per tant, un important repte biomèdic és el desenvolupament de noves teràpies per recuperar la tolerància immunològica. Una immunoteràpia ideal hauria d’inhibir la resposta autoimmunitària, sense efectes sistèmics adversos, i permetre la regeneració de les cèl·lules insulars per tal de recuperar la massa β. Hi ha mecanismes fisiològics que contribueixen a mantenir la tolerància immunològica. D’una banda, les cèl·lules apoptòtiques són una important font d’autoantígens que indueixen tolerància després de ser fagocitades per les cèl·lules presentadores d’antigen a través d’un procés anomenat eferocitosi. D’altra banda, les cèl·lules dendrítiques (CDs) són potents presentadores d’antigen amb capacitat de mantenir la tolerància immunològica. Basant-nos en aquestes dues característiques de la resposta immunitària, la hipòtesi del present treball és que les característiques tolerogèniques adquirides per les cèl·lules presentadores d’antigen després de l’eferocitosi poden ajudar a recuperar la tolerància perduda durant l’autoimmunitat. El principal objectiu ha estat generar una immunoteràpia antigen-específica basada en les propietats tolerogèniques inherents a l’apoptosi, per tal de restablir la tolerància a les cèl·lules β en la diabetis autoimmunitària. Amb aquesta finalitat, hem generat una immunoteràpia cel·lular amb CDs que havien capturat cèl·lules β apoptòtiques. Després de l’eferocitosi, les CDs van mostrar un canvi de patró molecular cap a un fenotip tolerogènic i una baixa producció de citocines proinflamatòries, mostrant també una disminució de la seva capacitat d’estimular la proliferació de cèl·lules T autòlogues. Això es va observar fins i tot després d’un estímul proinflamatori, fet que recolza l’estabilitat d’aquestes CDs tolerogèniques. A més, l’eferocitosi va promoure funció supresora en les CDs, un fenomen mediat -al menys en part- per la prostaglandina E2. L’administració d’aquesta immunoteràpia al model més utilitzat de DT1, el ratolí no-obès diabètic (NOD), va aturar la progressió de la insulitis i va prevenir la diabetis. Malgrat això, no va ser possible revertir la malaltia en ratolins diabètics. Degut a la dificultat en obtenir i estandarditzar les cèl·lules β apoptòtiques, vam dissenyar una estratègia sintètica, basada en les micropartícules liposomals. Els liposomes són vesícules formades per una bicapa lipídica amb un nucli hidrofílic. Una característica clau en el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques és l’exposició a la membrana de la molècula fosfatidilserina (FS), que genera el principal senyal de reconeixement per l’eferocitosi. Per tant, vam generar FS-liposomes amb pèptids d’insulina a l’interior -com a autoantígens-, per tal de simular el reconeixement de les cèl·lules apoptòtiques per part de les cèl·lules presentadores d’antigen. Aquests liposomes van ser fagocitats per les CDs, resultant en la inducció de tolerància i disminuint la capacitat d’induir proliferació en els limfòcits T autoreactius, de manera similar a la teràpia cel·lular de CDs. A més, aquesta immunoteràpia sintètica va ser capaç d’aturar l’atac autoimmunitari, reduint la severitat del infiltrat insular i prevenint la DT1 en ratolins NOD. Les característiques tolerogèniques de l’apoptosi ens van portar a dissenyar una teràpia cel·lular i posteriorment, a encapsular autoantígens en liposomes per induir una immunosupressió específica. El mimetisme de l’apoptosi utilitzant liposomes pot oferir una solució a la complexitat de la teràpia cel·lular, amb avantatges en quant a baix cost i la possibilitat de producció a gran escala, estandardització i personalització. Malgrat cal aprofundir molt en aquest camp, l’aportació al camp clínic de les immunoteràpies presentades en aquest treball pot ser molt important, donat el seu potencial translacional en situacions que requereixen el restabliment de la tolerància immunològica, com ara les malalties autoimmunitàries. / Type 1 diabetes (T1D) is a metabolic disease that results from the autoimmune attack against insulin-producing β-cells in the pancreatic islets of Langerhans. Currently, there is no treatment to restore endogenous insulin secretion in patients with T1D, so the development of new therapies to induce long-term tolerance has been an important medical health challenge. An ideal immunotherapy should inhibit the autoimmune attack, avoiding systemic side effects and allowing islet regeneration to improve β-cell function. There are physiological mechanisms that contribute to the maintenance of immune tolerance. On one hand, apoptotic cells are a source of autoantigens that induce tolerance after its removal by antigen presenting cells through a process called efferocytosis. On the other, dendritic cells (DCs) are powerful antigen presenting cells capable of maintaining immunological tolerance. Based on these two traits of the immune system, we hypothesized that tolerogenic features acquired by antigen presenting cells after efferocytosis can help to restore tolerance lost in autoimmunity. The main goal of this study was to generate an antigen-specific immunotherapy based on the inherent tolerogenic properties of apoptosis to reestablish tolerance to β-cells in T1D. To that aim, we generated a cell-based immunotherapy with DCs loaded with apoptotic β-cells. After the uptake of apoptotic β-cells, DCs displayed a molecular switch to a tolerogenic phenotype, low secretion of proinflammatory cytokine and impaired ability to stimulate autologous T cell proliferation even after proinflammatory stimuli, thus demonstrating their stability. Moreover, efferocytosis promoted suppressive ability in DCs, mediated at least in part by prostaglandin E2. The administration of the DC-based immunotherapy to the gold standard animal model for T1D, the non-obese diabetic (NOD) mouse, impaired the progress of insulitis, resulting in the prevention of the disease. However, it was not able to reverse the disease in overtly diabetic in mice. Due to the difficulties in obtaining and standardizing β-cell apoptotic cells, we designed a synthetic strategy, based on liposomal microparticles. Liposomes are vesicles composed of a lipid bilayer with a hydrophilic center. A central event on the surface of apoptotic cells is the exposure of phosphatidylserine (PS), which provide the main signal for efferocytosis. Therefore, PS-liposomes loaded with insulin peptides -as autoantigens- were generated to simulate the PS recognition of apoptotic cells by antigen presenting cells. These liposomes were phagocyted by DCs resulting in tolerance induction and impairing autoreactive T cell proliferation, in a similar way than the DC-based immunotherapy. In addition, this synthetic immunotherapy arrested the autoimmune aggression, reduced the severity of insulitis and prevented T1D in NOD mice. The fact that efferocytosis contributes to the maintenance of self-tolerance led us to design a cell therapy and later, to encapsulate β-cell autoantigens in liposomes to induce specific immunosuppression. Apoptotic mimicry using liposomes can offer a solution to the complexity of cell-therapy with design benefits like low-cost and easy to standardize, large-scale production and customization. Although further research is needed, the clinical relevance of the herein proposed immunotherapies could prove to be very important, as it has translational potential in situations that require the reestablishment of immunological tolerance, such as autoimmune diseases.