Diacylglycerol (DAG) is required for the generation of transport carriers at the Golgi complex. Several enzymatic reactions have been found to contribute to the maintenance of DAG levels at this organelle. However, the specific metabolic pathways that, under physiological conditions, are regulated to produce the DAG required for the membrane trafficking at the Golgi complex are not known. In the first part of this work we worked on the hypothesis that phospholipid synthesis can control DAG levels at the Golgi complex for the generation of transport carriers at the Golgi complex. To study this, we altered phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol synthesis for a short period of time in CHO cells to evaluate the changes in DAG and its effects in membrane trafficking at the Golgi. We found that cellular DAG rapidly increased when PC synthesis was inhibited at the non-permissive temperature for the rate-limiting step of PC synthesis in CHO-MT58 cells. DAG also increased when choline and inositol were not supplied. The major phospholipid classes and triacylglycerol remained unaltered for both experimental approaches. The analysis of Golgi ultrastructure and membrane trafficking showed that 1) the accumulation of the budding vesicular profiles induced by propanolol was prevented by inhibition of PC synthesis, 2) the density of KDEL receptor-containing punctated structures at the endoplasmic reticulum-Golgi interface correlated with the amount of DAG, and 3) the post-Golgi transport of the yellow fluorescent temperature-sensitive G protein of stomatitis virus and the secretion of a secretory form of HRP were both reduced when DAG was lowered. We confirmed that DAG-consuming reactions of lipid synthesis were present in Golgi-enriched fractions. We conclude that phospholipid synthesis pathways play a significant role to regulate the DAG required in Golgi-dependent membrane trafficking. In the second part of this work we investigate the role of phospholipase Cγ1 (PLCγ1), a DAG-producing signalling enzyme, on the membrane traffic at the Golgi complex and in the maintenance of its structure in HeLa cells. We based our work on the effects of the silencing and overexpression of PLCγ1. We found that PLCγ1 is required for post-Golgi trafficking of transmembrane and soluble proteins, that the catalytic activity of PLCγ1 is necessary to maintain the morphology of the Golgi complex, in particular the trans-Golgi compartments, and that PLCγ1 contributes to DAG homeostasis at the Golgi, measured by the localization of the DAG-sensing construct C1-PKCθ-GFP to the Golgi complex. Finally we show that cargo arrival at the Golgi complex increases the DAG production and that PLCγ1 is required for this increase of DAG localized at the Golgi. Our results show for the first time that a physiologic event along the secretory pathway, such as cargo arrival at the Golgi complex, triggers DAG production at this organelle for membrane traffic. We also provide evidence for a pivotal role of PLCγ1 at the Golgi: PLCγ1 mediates the DAG production triggered by cargo arrival and is required for the Golgi structure and membrane traffic at the trans-Golgi compartment. The main conclusions of this work are that: 1- Metabolic pathways for the synthesis of phospholipids that consume DAG regulate its levels at the Golgi complex. 2.- Phospholipid synthesis controls the levels of DAG needed for both retrograde and anterograde trafficking at the Golgi complex. 3.- Cargo arrival at the Golgi complex promotes DAG production. 4.- PLCγ1 is involved in the production of DAG triggered by cargo arrival at the Golgi complex. 5.- PLCγ1 is needed for post-Golgi transport and maintenance of the structure of the Golgi complex.

El carcinoma d'endometri (CE) és la neoplàsia més freqüent del tracte genital femení en els països desenvolupats. El CE és una malignització de les cèl·lules epitelials que revesteixen l'úter en el seu interior. Tot i que quan està confinat l’úter té bon pronòstic, quan surt de la cavitat uterina es torna una malaltia pràcticament incurable, per la qual cosa requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques a més dels mecanismes moleculars d’actuació d’aquests fàrmacs en aquesta neoplàsia, té una gran rellevància translacional. Si es compara amb els tractaments tradicionals, quimioteràpia o radioteràpia, la teràpia contra dianes moleculars presenta un gran avantatge per la seva especificitat, tant en la relació fàrmac‐diana com diana‐tumor. Això permet reduir la toxicitat indiscriminada dels tractaments anticancerosos, i addicionalment, actuar de forma dirigida contra determinats subgrups de tumors. Per altra banda, aquests fàrmacs poden actuar de forma sinèrgica entre ells o en combinació amb tractaments clàssics. L’augment del coneixement sobre l’etiologia del càncer ha permès descobrir noves dianes alterades específicament en les cèl·lules tumorals, com és el cas de les HDACs. Aquest fet ha motivat, per exemple, el desenvolupament del Vorinostat, un inhibidor de les HDACs. Els resultats obtinguts en aquesta tesi demostren que el Vorinostat és efectiu i selectiu per a les cèl·lules tumorals de CE. A nivell molecular, el Vorinostat en el CE indueix l’acetilació de les histones i altres proteïnes cooperant en el procés d’apoptosi caspasa-dependent. A més a més, el Vorinostat és eficient a l’hora de reduir la viabilitat, proliferació i induir una parada en el cicle cel·lular. El tractament juntament amb antioxidants rescata la mort induïda pel Vorinostat, fet que conclou que l’efecte letal del Vorinostat està relacionat amb l’estrès oxidatiu a través de la producció de ROS. Estudis previs demostren que la vitamina D (VD) és un factor d’inhibició tumoral en molts tipus de neoplàsies, però, la relació causa-efecte de presentar baixos nivells de VD en sèrum i desenvolupar càncer segueix estan incompleta. Els nostres estudis fets amb tissues microarrays (TMA) demostren que els casos de CE presentaven nivells baixos de CYP24A1 (enzim mitocondrial que degrada els metabòlits de la VD) juntament amb nivells baixos de VDR (receptor de la VD) nuclear i citoplasmàtic; els casos més agressius de CE, el tipus III, podien presentar nivells baixos de CYP27A1 (enzim que converteix la VD en 25(OH)D) o nivells alts de CYP24A1 en comparació amb els endometris normals (EN) analitzats. El tractament amb VD3, colecalciferol, de les línies cel·lulars de CE va ser suficient a l’hora de disminuir la capacitat clonogènica de les cèl·lules i la seva viabilitat a més d’induir efectes antiproliferatius. Globalment, els treballs que constitueixen aquesta tesi doctoral suposen una contribució important en el coneixement del mecanisme molecular d’acció del Vorinostat, antioxidants i la VD, fàrmacs que podrien ser efectius pel tractament/prevenció/atenuació del CE. / El carcinoma de endometrio (CE) es la neoplasia más frecuente del aparato genital femenino en los países desarrollados. El CE incluye un conjunto de variantes malignas que provienen de las células epiteliales que revisten el útero en su interior. Aunque cuando se encuentra confinado en el útero, tiene buen pronóstico, cuando sale de la cavidad uterina se transforma en una enfermedad prácticamente incurable, por lo que requiere la búsqueda de nuevos fármacos. La identificación de nuevas dianas terapéuticas además de los mecanismos moleculares de actuación de estos fármacos en esta neoplasia, tiene una gran relevancia translacional. Si se compara con los tratamientos tradicionales, quimioterapia o radioterapia, la terapia contra dianas moleculares presenta una gran ventaja por su especificidad, tanto en la relación fármaco-diana como diana-tumor. Esto permite reducir la toxicidad indiscriminada de los tratamientos anticancerosos, y adicionalmente, actuar de forma dirigida contra determinados subgrupos de tumores. Por otra parte, estos fármacos pueden actuar de forma sinérgica entre ellos o en combinación con tratamientos clásicos. El aumento del conocimiento sobre la etiología del càncer ha permitido descubrir nuevas dianas alteradas específicamente en las células tumorales, como es el caso de las HDAC. Este hecho ha motivado, por ejemplo, el desarrollo del Vorinostat, un inhibidor de las HDACs. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que el Vorinostat es efectivo y selectivo para las células tumorales de CE. A nivel molecular, el Vorinostat en el CE induce la acetilación de las histonas y otras proteínas cooperando en el proceso de apoptosi caspasa-dependiente. Además el Vorinostat es eficiente a la hora de reducir la viabilidad, proliferación e inducir una parada en el ciclo celular. El tratamiento junto con antioxidantes revierte la muerte inducida por el Vorinostat, hecho que sugiere, que el efecto letal de Vorinostat está relacionado con el estrés oxidativo de las células mediante la producción de ROS. Estudios previos demuestran que la vitamina D (VD) es un factor de inhibición tumoral en muchos tipos de neoplasias, sin embargo, la relación causa-efecto de presentar bajos niveles de VD en suero y desarrollar cáncer sigue siendo incompleta. Nuestros estudios hechos con tissues micro arrays (TMA) demuestran que los casos de CE presentaban niveles bajos de CYP24A1 (enzima mitocondrial que degrada los metabolitos de la VD) junto con niveles bajos de VDR (receptor de la VD) nuclear y citoplasmático; los casos más agresivos de CE, el tipo III, podían presentar niveles bajos de CYP27A1 (enzima que convierte la VD 25(OH)D) o niveles altos de CYP24A1 en comparación con los endometrios normales (EN) analizados. El tratamiento de las líneas celulares de CE con VD3, colecalciferol, es suficiente para disminuir la capacidad clonogénica de las células y su viabilidad además de inducir efectos antiproliferativos. Globalmente, los trabajos que constituyen esta tesis doctoral suponen una contribución importante en el conocimiento del mecanismo molecular de acción del Vorinostat, antioxidantes y la VD, fármacos que podrían ser efectivos para el tratamiento/atenuación/prevención del CE. / Endometrial carcinoma (EC) is the most common malignancy of the female genital tract in developed countries. EC implicates the epithelium inside the uterine cavity, and has a good prognosis when confined to the uterus. However, once outside the uterine cavity, EC becomes an incurable disease by current available drugs. Therefore, the identification of new therapeutic targets for this neoplasm as well as the molecular mechanisms of action of these drugs in this neoplasm is an issue of high translational relevance. Indeed, therapy against specific molecular targets presents an important advantage over chemotherapy or radiotherapy for their specificity. Thereby reducing their indiscriminate cellular toxicity and, more significantly, acting against specific subsets of tumors, or acting synergistically when administered in combination with traditional treatments. Increased understanding of the etiology of cancer has uncovered new targets specifically altered in tumor cells, such as the HDACs. This has led to the development of drugs as Vorinostat, an inhibitor of HDCAs. This thesis work demonstrates that Vorinostat is an effective and selective anti EC agent. At the molecular level, Vorinostat induces acetylation of histones and other proteins helping in the process of caspase-dependent apoptosi. Besides Vorinostat treatment is efficient in reducing the viability, proliferation and induces cell cycle arrest. Co-treatment with antioxidants rescues Vorinostat-induced cell death suggesting that the lethal effect of Vorinostat results from oxidative stress caused by ROS production. An additional contribution of this thesis work is the anti-EC actions of vitamin D (VD). Numerous epidemiological studies have linked VD deficiency with a higher cancer risk, but the cause-effect link low serum levels of VD and an accelerated development of cancer is still incomplete. In vitro studies in EC cell lines demonstrated that VD3 (cholecalciferol) treatment was sufficient to reduce their viability, proliferation rates and clonogenic capacity because these cells express CYP27A1 and CYP2R1, the enzymes that can convert VD3 into 25-hydroxyVD3/25(OH)D, a direct activator of VDR antiproliferative actions. Furthermore, tissue micro arrays (TMA) analysis revealed higher expression of both CYP27A1 and CYP2R1 but low VDR in EC compared to normal endometrium. These findings together with the low levels of CYP24A1 (the enzyme that degrades VD metabolites) in early stages of EC support the potential for effective antiproliferative actions with appropriate VD supplementation. Both reductions in CYP27A1 and CYP2R1 and increases in CYP24A1 limit VD inhibition of EC growth in more advanced stages. Overall, this thesis work provides an important contribution to our understanding on the molecular mechanisms of action of Vorinostat, antioxidants and VD, all of which might be effective for the treatment/attenuation/prevention of EC.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB) / Ack1 es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que pertenece a la familia de proteínas Ack que está formada por 9 miembros. Ack1 está compuesta por varios dominios de interacción proteína-proteína y un dominio catalítico tirosina quinasa cuya autofosforilación regula parcialmente la función de la proteína (Lougheed et al., 2004). Ack1 se encuentra altamente expresada en cerebro (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006), principalmente en las zonas del hipocampo, corteza cerebral, bulbo olfativo y cerebelo (Urena et al., 2005). Además, se ha demostrado que Ack1 se localiza tanto en dendritas como en regiones presinápticas y su expresión se regula a la alza por un incremento de actividad neuronal (Urena et al., 2005). Las funciones fisiológicas de Ack1 son bastante desconocidas. En conjunto, los datos publicados hasta la actualidad destacan la capacidad de la proteína Ack1 para interaccionar con una gran variedad de proteínas, que indica que Ack1 puede participar en diferentes rutas de transducción de señales, y por tanto, participar en diferentes procesos fisiológicos de las células. Por ejemplo, se ha descrito que puede participar en la regulación del citoesqueleto de actina (Burbelo et al., 1995), en los procesos de endocitosis (Teo et al., 2001), en las cascadas de señalización que resultan de la adhesión celular (Bourdoulous et al., 1998), en la migración celular (Modzelewska et al., 2006), en la proliferación (Nur et al., 2005) y en la supervivencia (Mahajan et al., 2005). La mayoría de funciones de Ack1 conocidas se deducen de las interacciones moleculares de ésta y hasta la actualidad se dispone de muy pocos datos respecto a las competencias biológicas de esta proteína, especialmente a nivel de SNC. Por eso, en esta tesis hemos intentado determinar el papel de la tirosina quinasa Ack1 en las funciones del SNC mediante 5 capítulos de resultados. En el capítulo I explicamos la producción de un anticuerpo monoclonal contra Ack1 que produjimos con el objetivo de poder estudiar la proteína Ack1 a nivel funcional. Este anticuerpo lo produjimos contra la región rica en prolinas de Ack1 con el fin que nos permitiera aumentar la especificidad de nuestros experimentos. En el capítulo II caracterizamos la proteína Ack1 a nivel más funcional. Demostramos que Ack1 es un componente de la vía de señalización de las neurotrofinas, siendo fosforilada en respuesta a neurotrofinas e interaccionando con sus receptores Trk. Además, también describimos que cambios de expresión de Ack1 alteran la neuritogénesis en células PC12 y los patrones de ramificación axonal y dendrítico en neuronas de hipocampo y células granulares de cerebelo. En el capítulo III examinamos la interacción de Ack1 con las proteínas de la densidad postsináptica CaMKII y PSD-95, su fosforilación en respuesta a los estímulos excitadores NMDA y glutamato, y la afectación de los botones axonales de las ramas colaterales de Schaffer por una falta de expresión de Ack1. Los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a una posible implicación de Ack1 a nivel de terminales sinápticos. En el capítulo IV nos centramos en estudiar la interacción de Ack1 con la proteína FAK y su participación en procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1. Los datos obtenidos sugieren una interacción entre ambas proteínas, que Ack1 se fosforila en respuesta a Netrina-1 y una implicación de la proteína Ack1 en los procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1 en células de hipocampo. Finalmente, siendo las proteínas Ack1 y FAK unas proteínas que dependen de su estado de fosforilación para regular su actividad, en el capítulo V de resultados de esta tesis estudiamos las dianas de fosforilación y posibles proteínas de interacción de ambas proteínas, mediante la técnica de espectrometría de masas en muestras de cerebro de ratón en desarrollo, de cerebro de ratón adulto y de cerebro de ratón adulto hiperestimulado. - Bibliografía Bourdoulous S, Orend G, MacKenna DA, Pasqualini R, Ruoslahti E (1998) Fibronectin matrix regulates activation of RHO and CDC42 GTPases and cell cycle progression. The Journal of cell biology 143:267-276. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. The Journal of biological chemistry 270:29071-29074. La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Mahajan NP, Whang YE, Mohler JL, Earp HS (2005) Activated tyrosine kinase Ack1 promotes prostate tumorigenesis: role of Ack1 in polyubiquitination of tumor suppressor Wwox. Cancer research 65:10514-10523. Modzelewska K, Newman LP, Desai R, Keely PJ (2006) Ack1 mediates Cdc42-dependent cell migration and signaling to p130Cas. The Journal of biological chemistry 281:37527-37535. Nur EKA, Zhang A, Keenan SM, Wang XI, Seraj J, Satoh T, Meiners S, Welsh WJ (2005) Requirement of activated Cdc42-associated kinase for survival of v-Ras-transformed mammalian cells. Mol Cancer Res 3:297-305. Teo M, Tan L, Lim L, Manser E (2001) The tyrosine kinase ACK1 associates with clathrin-coated vesicles through a binding motif shared by arrestin and other adaptors. The Journal of biological chemistry 276:18392-18398. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132. / Ack1 is a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in Central Nervous System (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006) that has several protein-protein interaction domains and a catalytic domain that is autophosphorylated, and this process regulates, at least in part, the action of this protein (Lougheed et al., 2004). Moreover, it has been demonstrated that Ack1 is localized in dendrites and presynaptic regions and that its expression is up-regulated by an increase of neuronal activity (Urena et al., 2005). Most of the known functions of Ack1 have been elucidated from interactions of Ack1 with several proteins. But, most of the physiologically functions of Ack1 remain to be described, especially in CNS. For this reason, the aim of this thesis has been to unravel some of these functions on CNS that are described through 5 chapters. In the 1st chapter we have explained the production of a monoclonal antibody against Ack1 that allowed us to improve the specificity of our experiments and to study Ack1 at a functional level. In the 2nd chapter we have demonstrated that Ack1 is a component of the neurotrophin pathway, because it is phosphorylated as a response to neurotrophins and interacts with Trk receptors. Moreover, we also have described how changes in Ack1 expression alter neuritogenesis and axonal and dendritic ramification. In the 3th chapter we have analyzed the interaction of Ack1 with the postsynaptical proteins CaMKII and PSD-95, its phosphorylation in response to excitatory stimulus such as NMDA or glutamate and we have described that a lack of Ack1 expression decrease the size of axonal buttons. These data suggest an implication of Ack1 at a synaptic level. In the 4th chapter we focused on the determination of the interaction of Ack1 and FAK, the Ack1 phosphorylation in response to Netrin-1 and the effect of Ack1 in chemoattraction regulated by Netrin-1. Finally, in the 5th chapter we studied the phosphorylation sites and the possible interacting proteins of FAK and Ack1 by mass spectrometry in samples of mice brain in development, of adult mice brain and of adult mice overstimulated brain. - Bibliography La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.

La superfamília de receptors scavenger rics en cisteïna (SF-SRCR) és un grup de proteïnes de membrana i/o secretades molt antic i conservat al llarg de l’evolució. Els membres de la SF-SRCR es caracteritzen per la presència d’una o més repeticions d’un domini anomenat SRCR, d’aproximadament 100 aminoàcids (aa) i ric en cisteïna. Malgrat l’alt grau de conservació del domini SRCR, no s’ha descrit una funció o lligand comú per tots els membres de la SF-SRCR. Els estudis realitzats a llarg d’aquesta tesi han permès caracteritzar molecular i funcionalment dos membres solubles relativament nous de la SF-SRCR, S5D-SRCRB (soluble 5 domains-SRCR of group B) i S4D-SRCRB (soluble 4 domains-SRCR of group B). A més, s’ha aprofundit en la descripció del paper que juga DMBT1/Hensin en la diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó. S5D-SRCRB és una glicoproteïna secretòria altament glicosilada, formada per cinc dominis SRCR, espaiats per pèptids rics en els aa Pro, Ser, Thr (PST), a més d’un domini C terminal de tipus mucina. Les glicosilacions que S5D-SRCRB presenta són del tipus N i O. Al seu torn, S4D-SRCRB és una glicoproteïna formada per quatre dominis SRCR també espaiats per pèptids PST, però únicament conté glicosilacions de tipus O. A més de la caracterització bioquímica dels dos membres, la generació d’anticossos monoclonals contra S5D-SRCRB va permetre estudiar el patró d’expressió tissular d’aquesta proteïna. L’estudi va desvetllar que S5D-SRCRB s’expressava principalment als epitelis, on el tracte urogenital presentava els nivells d’expressió més importants a nivell protèic i d’ARN. Pel que fa la funció de S5D-SRCRB i S4D-SRCRB, es va observar que ambdues proteïnes s’unien de manera dosi-depenent a proteïnes de la matriu extracel•lular (fibronectina i laminina). S5D-SRCRB, a més, interaccionava amb galectina-1 i galectina-3, mitjançant els seus dominis d’unió a lectines. D’altra banda, S5D-SRCRB i S4D-SRCRB interactuaven amb components de la paret bacteriana (peptidoglicà i lipopolisacàrids) i fúngica (glucans lineals), actuant com a reconeixedors dels patrons moleculars associats a patògens (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Les dues proteïnes eren també capaces d’agregar cultius bacterians (E. coli i S. aureus) i fúngics (C. albicans). Per tant, S5D- i S4D-SRCRB podien actuar com a receptors duals capaços de reconèixer estructures endògens i exògenes, i participar en el manteniment de la homeòstasi de l’organisme. La possibilitat que S5D-SRCRB jugués un paper en la defensa dels epitelis contra infeccions es va estudiar amb més detall en el tracte urogenital, emprant models in vitro i in vivo. Els resultats van revelar que l’expressió de S5D-SRCRB augmentava tant en cultius de la línia cel•lular clone C tipus ß expossats a components de la paret bacteriana, com en els ronyons de ratolins a un model d’infecció en el tracte urinari (urinary tract infection, UTI). El patró d’expressió de S5D-SRCRB també canviava durant el procés de diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó, i durant l’espermatogènesi en els túbuls seminífres. Per aquest motiu s’ha proposat que S5D-SRCRB pot jugar un paper en la diferènciació cel•lular, com s’ha demostrat que passa en el cas de DMBT1/Hensin. La secreció de DMBT1/Hensin és clau en el procés de diferenciació terminal que pateixen les cèl•lules intercalades en condicions d’acidosi, i pel qual passen d’expressar un fenotip de cèl•lula intercalada tipus ß a un de tipus α. / The scavenger receptor cysteine-rich superfamily (SRCR-SF) members are transmembrane and/or secreted receptors exhibiting one or several repeats of a cysteine-rich protein module of +/-100 aa, named scavenger receptor cysteine-rich (SRCR). Despite the high degree of conservation of SRCR domain, non a shared function neither a ligand has been described for all the SRCR-SF members. Studies conducted on this work characterized two relatively new members of the SRCR-SF: S5D-SRCRB (soluble 5-SRCR domains of group B) and S4D-SRCRB (soluble 4-SRCR domains of group B). In addition, we better described the role of DMBT1/Hensin in terminal differentiation of renal intercalated cells. S5D-SRCRB is a highly glycosylated secretory glycoprotein, consisting of five SRCR domains, spaced by peptides rich in Pro, Ser, Thr (PST), and a mucin-like domain at the C terminal extreme. S5D- SRCRB contains N- and O- glycosylations. On the other hand, S4D-SRCRB is a glycoprotein consisting of four SRCR domains also spaced by PST peptides, but only contains O-glycosylations. S4D- and S5D-SRCRB were shown to bind endogenous extracellular matrix proteins (laminin fibronectin), as well as Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) present on Gram-positive and Gram-negative bacteria and fungi. PAMP binding by S4D- and S5D-SRCRB induced microbial aggregation and changes in PAMP-induced cytokine release. These abilities suggest that S4d- and S5D-SRCRB might play a role in the innate defense and homeostasis of certain specialized epithelial surfaces. Immunohistochemical and real-time PCR analysis showed significant S5D-SRCRB expression in murine genitourinary and digestive tracts. S5D-SRCRB expression increased when collecting duct cells were infected. S5D-SRCRB expression pattern also changed during terminal differentiation of renal intercalated, and during spermatogenesis in the seminiferous tubule. It has been proposed that S5D-SRCRB may play a role in cell differentiation, in a similar way it does DMBT1/Hensin. This work has shown that DMBT1/Hensin secretion is required during terminal differentiation carried out by intercalated cells in conditions of acidosis, which drives type ß- intercalated cells to α- intercalated cells.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly, with more than 25 million people affected worldwide. First described in 1907 by the German physician Alois Alzheimer, AD is a neurodegenerative disease characterized by a dramatic progressive loss of synapses and neuronal populations, initially affecting medial temporal lobe structures and finally resulting in diffuse cortical atrophy. The earliest clinical symptoms are episodic memory loss, especially in remembering new items (anterograde amnesia). As the disease progresses, amnesia occurs in conjunction with major executive dysfunctions, such as impairment of language (aphasia), object use (apraxia), recognition of faces or objects (agnosia), abstract reasoning, step-by-step planning, and decision making. This gradual erosion of cognition slowly increases in severity until the symptoms eventually become incapacitating, and at the histological level it is reflected by the progressive spread of specific pathological lesions in a non-random manner across various brain regions. At the histopathological level AD shows two main hallmarks: amyloid plaques and neurofibrillary tangles, occurring in a context of vascular damage, inflammation, oxidative stress, synaptic loss and neurodegeneration. Reelin is an extracellular matrix protein crucial for neural development. In addition, recent studies have shown that in the adult brain Reelin controls distinct plasticity events, including synaptic plasticity and adult neurogenesis. The Reelin signalling cascade has been previously related to Alzheimer Disease (AD) pathogenesis. However, the exact role that Reelin itself plays on the disease is not fully understood. The main aim of this thesis is to investigate the involvement of Reelin in AD aetiology, addressing the question of whether Reelin could act as a protective factor, with eventual therapeutic implications, or rather if it might favour the onset of the pathology. To this end established an strategy to purifiy Reelin protein and to study in vitro its involvement in the process of amyloid fibrils formation. By this approach we found in vitro that Reelin delays amyloid- (Aβ42) fibril formation until it is recruited into amyloid fibrils. Further, Reelin protects against both Aβ42-oligomer induced neuronal death and synaptic loss. We also generated AD mouse models overexpressing Reelin, to address in vivo the impact of Reelin overexpression on the main hallmarks of the disease, such as amyloid fibril formation and phosphorylation of Tau. In detail, we crossed a model of conditional Reelin overexpression (TgRln) from our lab (Pujadas et al., 2010) with two models of AD pathology: J20 and Tet/GSK-3β mice. J20 mice constitutionally express a mutated form of human APP, bearing both the Swedish and the Indiana mutation (hAPP we/Ind) (Mucke et al., 2000), thus being a good model to analyse Aβ pathology. The generated J20 mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/J20. Tet/GSK-3β is a conditional transgenic model of overexpression of GSK-3β, the main kinase for Tau protein, thus being a good model of Taupathology. In TgRln/J20 we showed that Reelin transgene expression delays amyloid plaque formation in vivo. The generated Tet/GSK-3β mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/GSK-3β. Moreover, we show that overexpression of Reelin in J20 AD mice rescues the dendritic spine loss documented for this mouse strain with consequent rescue of the cognitive deficits associated to this AD model, such as non-spatial recognition tasks (assessed by Novel Object Recognition test). Additionally, both aged TgRln and TgRln/J20 mice behaved better than aged wild-type mice, indicating that Reelin protects also from the impairments due to physiological aging. In TgRln/GSK-3β mice we show that Reelin decreases Tau phosphorylation and reduces cognitive deficits in a non-spatial recognition task (Novel Object Recognition). All together these data indicate that by delaying Aβ plaque formation, protecting against neuronal death and synaptic loss, reducing Tau phosphorylation and preventing AD cognitive deficits the Reelin pathway should be considered a therapeutic strategy for the treatment and amelioration of AD pathogenesis and cognitive deficits in normal aging. / La Reelina es una proteína de la matriz extracelular crucial para el desarrollo neural. Además, estudios recientes han demostrado que en el cerebro adulto Reelina controla eventos de plasticidad sináptica y neurogénesis. La cascada de señalización de Reelina ha sido previamente relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA). Sin embargo, aún no se conoce exactamente el papel que Reelina juega en la enfermedad. La EA es la forma más común de demencia en personas mayores y se caracteriza por una dramática pérdida progresiva de sinapsis y poblaciones neuronales. A nivel histopatológico se han descrito dos características principales: los ovillos neurofibrilares (paquetes intracelulares de la proteína Tau hiperfosforilada ) y las placas amiloides (depósitos extracelulares de péptido Aβ). El péptido Aβ se genera por el corte proteolítico de la proteína transmembrana APP (Amyloid precursor protein) por la acción secuencial de las proteasas de membrana β- y γ-secretasa. El Aβ monomérico comienza a agregarse en especies oligoméricas solubles, capaces de provocar disfunción sináptica en la EA. El proceso de agregación termina con la formación de fibrillas amiloides, los constituyentes principales de las placas. En esta tesis se demuestra que Reelina retrasa in vitro la formación de fibrillas amiloides, hasta que queda secuestrada en las mismas, perdiendo su actividad biológica. Además, Reelina protege contra la muerte neuronal y el daño sináptico inducidos por oligómeros de Aβ. También se generan modelos murinos de EA sobreexpresantes de Reelina. En uno de estos modelos (TgRln/J20) se demuestra que la expresión transgénica de Reelina disminuye in vivo la deposición de placas amiloides, previene la pérdida de espinas dendríticas y rescata el deterioro cognitivo asociado a este modelo de EA. En otro modelo (TgRln/GSK-3β) la sobreexpresión de Reelina reduce la fosforilación de Tau. El conjuntos de datos presentados en esta tesis indica que, al disminuir la formación de placas amiloides, al proteger contra la muerte neuronal y la pérdida sináptica, al reducir la fosforilación de Tau y al prevenir el deterioro cognitivo de la EA, la vía de Reelina debe ser considerada una estrategia terapéutica para el tratamiento y la mejora de la patogénesis de la EA.

Olfactory ensheathing cells (OECs) implantation has emerged as a promising therapy for spinal cord injury (SCI), but their regenerative properties seem to depend on the presence of a substrate permissive to cell migration. Studies demonstrate that when transplanted after SCI, the migratory properties of OECs are reduced compared to transplantation in not-injured spinal cords. As after SCI, inhibitory molecules such as myelin associated inhibitors (MAIs) are overexpressed in the site of lesion. Therefore we thought that these molecules could modulate OECs migration capacity. We used a rodent clonal OEC line, TEG3, and we demonstrated that these cells express all the components of the NgR-complex. This complex resulted to be active since TEG3s activated RhoA and increased ERK1-2 phosphorylation in response to acute stimuli of myelin. Indeed, myelin inhibited OECs migration over glass surfaces and also over linearly elastic PAA gels. Moreover using traction force microscopy (TFM), we quantitatively demonstrate that TEG3s largely decrease their traction stress over myelin. This decrease in traction force correlated with decreased focal contacts and redistribution the of F-actin cytoskeleton. In fact, OECs cultured on myelin largely reduced the number of protrusions, stress fibers and FAs. Finally we observed that the incubation of TEG3s with the NgR1 blocking peptide NEP1-40 mainly overcame MAIs-mediated migratory inhibition, restoring the traction forces of these cells and their cytoskeletal organization. Altogether these data suggested us that a cell-based strategy, using TEG3s that has the capacity to overcome the inhibitory action of MAIs, is required in other to enhance their migratory properties after SCI transplantation. Indeed in order to overcome the effects of MAIs over TEG3 we tested two strategies. First we investigated whether a particular type of magnetic nanoparticle (MNP) could be used to control the localization and migration of TEG3s. We confirmed that, in vitro, magnetized TEG3s can survive well without exhibiting stress-associated cellular responses. Moreover, their migration can be modulated by magnetic fields and their transplantation in organotypic culture of spinal cord and peripheral nerve, a model more similar to an in vivo situation, showed positive integration in the model. Second we genetically modified OEC to express the NgR(Ecto)coupled with a GFP using a lentiviral based system in order to visualize them. The NgR(Ecto), contains the amino acids 1–310 of NgR1 and blocks the signaling of myelin and previous studies demonstrated that its presence enhances axonal regeneration after SCI. Engineered OEC were able to express and secrete at high levels the ectodomain in vitro. Moreover, by time lapse analysis we could observe that these cells migrate longer distances than normal OEC over a myelin substrate. To observe the behavior of NgR(Ecto)-OECs in vivo we did a preliminary experiment where cells were implanted in a not-lesioned spinal cord of adult rats. The NgR(Ecto)-OECs migrated more distance both caudal and rostral from the site of injection in comparison with normal OEC. These data suggest a therapeutic potential of both strategies tested for SCI. NgR(Ecto)-OECs once implanted after SCI would migrate more and this would enhance their regeneration capacity. Moreover the secreted ectodomain would interfere with the myelin present at the lesion site improving intrinsic axonal regeneration. We could combine the use of these modified cells with MNPs. With the design of specific magnetic sources we could concentrate OECs near the lesion site and therefore increase their possible interaction with damaged axons. Indeed, further studies are necessary the behavior of this modified cells in a SCI model. / La implantación de OECs ha surgido como una terapia prometedora para lesiones medulares, pero sus propiedades regenerativas parecen depender de la presencia de un sustrato permisivo para la migración celular. En esta Tesis Doctoral demostramos que los inhibidores asociados a mielina (IAMs) pueden modular la capacitad migración de las OECs través la interacción y activación del complejo receptor de NgR (el receptor común para los IAMs). Con el uso de la microscopia de tracción, demostramos cuantitativamente que las OECs disminuyen en gran medida su fuerza de tracción sobre la mielina. Además, esta disminución se pudo correlacionar con una disminución de las adhesiones focales y la redistribución del citoesqueleto de F-actina. La incubación con el péptido NEP1-40, que bloquea NgR1, restableció in gran parte la capacitad migratoria, las fuerzas de tracción de estas células y su organización citoesqueletal. En base a los resultados obtenidos exploramos la viabilidad de dos estrategias diferentes para mejorar las propiedades migratorias de la OECs. Una de ellas trataba del posible uso de nanoparticulas magnéticas para guiar a las células. Aunque esta técnica no aumenta la velocidad intrínseca de migración de las células, permite la concentración y la guía de las mismas hace a un área específica después de la implantación in vivo. Pudimos comprobar que las OECs marcada con NPM no exhiben respuestas celulares asociadas al estrés, y pueden ser guiadas por un campo magnético in vitro. Además comprobamos que las células se integraban bien después de su trasplante de en un modelo organotípico de regeneración de médula espinal/nervio ciático. La segunda estrategia consistió en modificar genéticamente las OECs para que expresaran un ectodomínio por el NgR1 para bloquear los efectos negativos de los IAMs sobre su migración. Pudimos observar que las células modificadas migran más in vitro sobre un sustrato de mielinas comparadas con OECs normales. Además, una vez implantadas en una médula no lesionada, las células modificadas se integran bien en el modelo y migran más que células normal. Los resultados obtenidos indican un potencial terapéutico de ambas estrategias.

In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1β. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity. / En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1β. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad.

OBJETIVOS: 1. Evaluar la capacidad del EE2 de provocar una respuesta estrogénica en vivo en ejemplares macho de dorada 2. Evaluar la capacidad del EE2 de alterar la fisiología y la respuesta inmunitaria local de la gónada 3. Evaluar la habilidad del EE2 de alterar la respuesta inmunitaria sistémica, analizando actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico, el perfil de expresión de macrófagos y la capacidad en vivo de responder a un reto inmunológico. 4. Realizar una caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G tanto in vitro como in vivo. METODOLOGÍA: Se llevo realizó una experimentación in vivo e in vitro. Se usaron ejemplares sanos de dorada (Sparus aurata L.), especie hermafrodita protándrica y de puesta estacional, mantenidos en el Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). La experimentación in vivo se llevo a cabo exponiendo a los ejemplares a EE2 o G1 a diferentes dosis y tiempos. En algunos casos, la exposición se simultaneó con una inmunización programada. A continuación, se realizaron, entre otros, análisis de supervivencia, de calidad del esperma, histológicos, determinación de hormonas e IgM en suero, de expresión génica y de citometría de flujo. La experimentación in vitro se desarrollo, principalmente, tratando con leucocitos de riñón cefálico con EE2 o G1 (para la activación específica de la señalización de GPER para su caracterización funcional) a diferentes dosis y tiempos y analizando actividades inmunitarias como fagocitosis y explosión respiratoria y el perfil de expresión génica. CONCLUSIONES: 1. La exposición in vivo a EE2 promueve una respuesta estrogénica evidente caracterizada por un descenso en el IGS, alteración en los niveles séricos de E2, T y 11KT y una inducción en la expresión hepática de vtg. Estos efectos son más evidentes cuando el EE2 se administra en la dieta que cuando se administra en el agua del baño. Además, estos efectos dependen, ligeramente, del estado de desarrollo de los ejemplares. 2. El EE2 incrementa la sensibilidad a estrógenos en gónada y en riñón cefálico ya que aumenta la expresión del REα. 3. La exposición in vivo a EE2 interrumpe la espermatogénesis e induce en el testículo la morfología característica de la etapa de post-puesta. Aunque los túbulos seminíferos continúan llenos de espermatozoides se observa una reducción en el volumen y motilidad de los espermatozoides. Además, el EE2 genera un proceso pro-inflamatorio en la gónada, promoviendo una infiltración masiva de leucocitos y un incremento en la expresión de citoquinas y moléculas implicadas en el reconocimiento y presentación de antígenos. 4. El EE2 disminuye la capacidad de los ejemplares de responder a un estímulo inmunológico in vivo ya que inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias tras una inmunización aunque no se comporta como inmunosupresor. Además, el EE2 inhibe in vitro las actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico y dirige hacia un fenotipo anti-inflamatorio en macrófagos. 5. EL GPER se expresa en tejidos reproductores e inmunitarios de dorada y su expresión no es modulada por su activación. 6. Los granulocitos acidófilos son las células del riñón cefálico que tienen un mayor nivel de expresión de GPER. Éstos expresan un GPER funcional cuya activación in vitro dirige, de manera general, hacia un fenotipo anti-inflamatorio. Dichos efectos son regulados, en parte, por la activación de la ruta de señalización AMPc/PKA/CREB. 7. La activación de GPER no promueve una respuesta estrogénica aunque provoca, en general, un efecto anti-inflamatorio y modula ligeramente la respuesta inmunitaria adaptativa. / OBJETIVES: 1. To evaluate the ability of EE2 to provoke an estrogenic response in vivo in male gilthead seabream. 2. To evaluate the ability of EE2 to alter the physiology and the local immune response of the gonad. 3. To evaluate the ability of EE2 to alter the systemic immune response, analysing immune activities of head kidney leukocytes, the expression profile of macrophages and the in vivo capabilities to respond to an immune challenge. 4. To perform a functional characterization of the G protein-coupled estrogen receptor, GPER, both in vitro and in vivo. METHODOLOGY: In vivo and in vitro experimentation was carried out. For this, healthy specimens of gilthead seabream (Sparus aurata L.) were bred and kept at the Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). In vivo experiments were carried out by exposing the specimens to EE2 or G1 at different doses and times. In some cases, the exposure was simultaneous to a scheduled immunization. Afterwards, analysis of survival, sperm quality, histological, determination of hormones and IgM in serum, gene expression and flow cytometry were performed. In general, for the in vitro experiments, leukocytes from head kidney (bone marrow equivalent) were treated with several doses of EE2 and G1 (to specifically activate GPER signalling) at different time points, and analyzing immune activities such as phagocytosis and respiratory burst and gene expression profile. CONCLUSIONS: 1. Exposure to EE2 in vivo promotes an evident estrogenic response characterized by decreased GSI, altered serum levels of E2, T and 11KT, and induced hepatic expression of vtg. These effects are more evident when EE2 is administered in the diet than when is administered in bath water. In addition, its effects slightly depend on the development stage of the specimens. 2. EE2 increases the sensitivity to estrogens in the gonad and the head kidney by increasing the expression of the gene coding for ERα. 3. Exposure to EE2 in vivo disrupts spermatogenesis and induces a characteristic morphology of the post-spawning in the testis. However, the seminiferous tubules were filled with sperm, causing a reduction in the volume and sperm motility. Moreover, EE2 also generates a pro-inflammatory process in the gonad, promoting a massive infiltration of leukocytes and an increased expression of the genes encoding cytokines and molecules involved in antigen recognition and presentation. 4. EE2 decreases the ability of specimens to respond to an immune stimulus in vivo by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines after immunization but does not behave as an immunosuppressor. Moreover, EE2 inhibits in vitro the immune activities of head kidney leukocytes and direct primary macrophages towards an anti-inflammatory phenotype. 5. GPER is expressed in reproductive and immune tissues in gilthead seabream and its expression is not modulated by its activation. 6. Acidophilic granulocytes are the head kidney cells with a higher level of expression of GPER. They express a functional GPER whose activation in vitro leads, in general, to an anti-inflammatory phenotype. These effects are regulated, in part, by activation of the cAMP/PKA/CREB signalling pathway. 7. GPER activation in vivo does not promote an estrogenic response, although in general, provokes an anti-inflammatory effect and slightly modulates the adaptive immune response.

En els darrers anys, el coneixement dels mixozous (Fílum Myxozoa) al Mediterrani ha crescut gràcies a la creixent necessitat de solucionar els problemes sanitaris que aquests paràsits ocasionen en cultius de peixos d'interès comercial. En aquest sentit, Enteromyxum leei és un dels patògens més importants per a l'aqüicultura al Mediterrani tant a nivell sanitari com econòmic. Això és degut a la susceptibilitat que presenten algunes espècies d'interès per l'aqüicultura al Mediterrani com els espàrids. D'altra banda, el seu control és difícil per la capacitat d'E. leei de transmetre's horitzontalment, per l'existència de possibles reservoris de la malaltia en els sistemes sublitorals mediterranis (Padrós i col. 2001), i pel desconeixement del seu cicle de vida i la falta d'estudis sobre el seu tractament i prevenció (Yokoyama i Shirakashi 2007).Per tal d'avaluar la situació de l'enteromixosi produïda per E. leei en els cultius d'espàrids al Mediterrani i per tal de desenvolupar mesures de prevenció i control es va plantejar el projecte europeu MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722). La present tesi doctoral contribueix als objectius generals del projecte MyxFishControl en l'estudi de la transmissió, patogènia i desenvolupament d'E. leei dins dels seus hostes. En primer lloc, s'ha realitzat una descripció dels principals estadis de desenvolupament d'E. leei observats en orades (Sparus aurata) i en morrudes (Diplodus puntazzo) mitjançant tècniques d'estudi tradicional al microscopi òptic i electrònic de transmissió i tècniques citoquímiques complementàries com la detecció d'hidrats de carboni mitja o la detecció de lípids. Aquest estudi ha permès descriure cinc estadis de desenvolupament del paràsit i, a més, ha permès establir una possible seqüència temporal d'aquests estadis basada en les observacions del seu creixement i de la seva maduració.D'altra banda, s'ha realitzat un estudi comparatiu al microscopi òptic de l'establiment, la progressió de la infecció i la patogènia d'E. leei en diferents situacions experimentals. Aquest estudi ha permès avaluar estadísticament l'efecte que tenen la metodologia usada per infectar l'hoste, la seva edat i l'espècie a la que pertany, en les característiques de la infecció. En general, s'ha pogut establir que mentre que les lesions que provoca el paràsit són independents d'aquestes variables, la resposta inflamatòria, les taxes d'infecció i la progressió de la infecció sí que en depenen.Per últim, durant el transcurs de les infeccions experimentals en orada es va detectar un organisme desconegut de morfologia semblant a la d'un mixosporidi ancorat a les microvellositats dels entèrocits de l'epiteli intestinal. Per tal de definir la seva identitat i estudiar les característiques de la infecció en el seu hoste s'ha realitzat un estudi al microscopi òptic i electrònic que ha permès descartar la possibilitat que aquest mixosporidi sigui Leptotheca sparidarum o Ceratomyxa sparusaurati. D'altra banda, com aquest mixosporidi comparteix algunes característiques (com la localització o la patogènia) amb E. fugu, s'han realitzat una sèrie proves de PCR per tal d'avaluar la hipòtesi que aquest nou mixosporidi sigui en realitat E. fugu. Aquests estudis, però, no han permès confirmar la identitat d'aquest mixosporidi. / In last years, the knowledge about Mediterranean myxozoans (Phylum Myxozoa) has grown because of the rising necessity to solve the sanitary problems that these parasites cause in cultured commercial fish species. To date Enteromyxum leei is considered a risk to the development of Mediterranean aquaculture due to the high susceptibility showed by some important cultured species like the sparids, the fish-to-fish transmission of this parasite, the difficulty to apply prevention measures and the absence of effective treatments. In order to evaluate the situation of the enteromyxosis caused by E. leei in cultured sparids in the Mediterranean basin and to establish prevention and control measures, the European project MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722) was developed. The present PhD thesis contributes to the main objectives of the MyxFishControl project in studying the transmission, pathogenesis and development of E. leei in their fish hosts. The developmental stages of E. leei in gilthead seabream (Sparus aurata) and sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) were described at light and electron transmission microscopes. In addition to traditional ones, some cytochemical techniques were used to detect carbohydrates and lipid inclusions. This morphological study let us to describe five developmental stages of E. leei inside their fish hosts and to propose a life cycle based on the growth and maturation of these stages. Moreover, a comparative study about the establishment, proliferation and pathogenesis of E. leei in different experimental conditions was carried out. Some statistical analyses were performed in order to evaluate the effect of the infection methodology, fish species and size. Although inflammatory reaction, prevalence and progression of the infection depend on these variables, the main pathological changes caused by E. leei in their fish host do not.Finally, during the experimental trials conducted with gilthead seabream, an unknown organism similar to a myxosporean was detected on the epithelial surface of the intestinal mucosa. Morphological and molecular studies were conducted in order to identify this new parasite and to describe the main infection characteristics. The observations at light and electron microscopes let us to rule out the hypothesis that this organism was Ceratomyxa sparusaurati or Leptotheca sparidarum. Although this unknown mixosporean shared some characteristics with Enteromyxum fugu, molecular studies didn't show an acceptable specificity. As a result, to date this mixosporean remain without identify.

El complejo de Golgi participa en el procesamiento, la distribución y el transporte de lípidos y proteínas hacia su destino final dentro de la célula. El transporte desde el Golgi está mediado por intermediarios de transporte (ITs), principalmente vesículas y túbulos. La formación de ITs se inicia con la gemación de la vesícula o el túbulo, a continuación se produce su elongación y finalmente tiene lugar su fisión. Este proceso requiere de una compleja maquinaria molecular en la que intervienen las llamadas proteínas de cubierta, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto, y los lípidos de las membranas. Respecto al papel de los lípidos, éstos pueden actuar tanto en el reclutamiento de proteínas citosólicas que participan en la formación de los ITs, como dotando a la membrana de las propiedades físicas óptimas para su deformación en vesículas o túbulos. La curvatura de membrana está facilitada por lípidos con estructura cónica como el ácido lisofosfatídico (LPA), el ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG). El DAG cumple una doble función en la formación de ITs desde el Golgi: por una parte actúa en el reclutamiento y la activación de la proteína cinasa D (PKD), necesaria para la correcta fisión de vesículas desde la red trans-Golgi (TGN). Por otra parte ayuda a la formación de curvatura negativa. El DAG en el Golgi está estrechamente regulado por diferentes vías que controlan su formación y metabolismo. Una de estas vías está mediada por las llamadas fosfatasas del ácido fosfatídico (PAPs), que producen DAG a partir de defosforilar el PA. Existen dos familias de proteínas que actúan como fosfatasas del ácido fosfatídico. Las enzimas de la familia PAP1son citosólicas, su actividad catalítica es dependiente de Mg+2, se inhiben por N-etilmaleimida (NSF) y el PA es su único sustrato. Las enzimas PAP2 son proteínas transmembrana, independientes de Mg+2 e insensibles a NSF. Las PAP2 también se conocen como fosfatasas de lípidos fosfato (LPPs), ya que además del PA pueden también catalizar la defosforilación de otros lípidos como la ceramida-1-fosfato (C1P), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y el ácido lisofosfatídico (LPA), aunque con diferentes afinidades (PA ~ LPA > C1P > S1P). La inhibición de las PAP por el agente farmacológico propanolol, indica que el DAG que proviene de esta vía es necesario para la formación de ITs desde el Golgi al retículo endoplasmático (RE). En esta tesis hemos demostrado que uno de los miembros de la familia PAP2, la enzima PAP2b, también conocida como LPP3, se localiza en diferentes compartimentos de la vía secretora, desde los sitios de salida del RE (ERES) hasta el complejo de Golgi. El silenciamiento de LPP3: (i) reduce la formación de túbulos desde el compartimento intermedio entre el RE y el Golgi (ERGIC) y el complejo de Golgi, y a su vez incrementa la longitud de aquéllos túbulos formados desde el Golgi; (ii) causa un retraso en el transporte dependiente de Rab6 de la subunidad B de la toxina Shiga desde el Golgi al RE, sin afectar al transporte anterógrado de RE a Golgi; y (iii) a nivel ultraestructural incrementa el número de perfiles vesiculares asociados a las cisternas del Golgi. El silenciamiento de la LPP3 también reduce la síntesis de novo de DAG y los niveles de DAG en el Golgi. Además, también hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante catalíticamente inactivo de la LPP3 reproduce los efectos observados tanto con el silenciamiento de la LPP3, como al inhibir la actividad catalítica de las PAP2 por el propanolol. De forma conjunta, nuestros resultados demuestran que la LPP3, a partir de regular la homeostasis de DAG, participa en la formación de ITs en diferentes compartimentos de la vía secretora, regulando el transporte retrógrado entre el RE y el Golgi. / The Golgi complex is involved in the processing, sorting and transport of membrane components (lipids and proteins) to appropriate subcellular destinations, and is also a membranous platform for signalling, metabolic and cytoskeleton proteins. Transport to and from the Golgi complex is mediated by transport carriers (vesicles and/or tubules), which are generated in sequential stages beginning with the formation of a bud, followed by its elongation, constriction and final fission. Lipids play an essential role in this process through different mechanisms: they can recruit cytosolic proteins, modulate protein functions and modify the architecture and physical properties of the membrane bilayer. Thus, membrane curvature is facilitated by conical lipid molecules such as lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG). In previous results of our group we have demonstrated that the DAG produced by the phosphatidic acid phosphatase type 2 family of proteins (PAP2) is necessary for the retrograde transport from the Golgi to the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis we have demonstrated that that the PAP2 family member lipid phosphate phosphatase 3 (LPP3, also known as PAP2b) localizes in compartments of the secretory pathway from ER export sites to the Golgi complex. The depletion of human LPP3: (i) reduces the number of tubules generated from the ER–Golgi intermediate compartment and the Golgi, with those formed from the Golgi being longer in LPP3-silenced cells than in control cells; (ii) impairs the Rab6-dependent retrograde transport of Shiga toxin subunit B from the Golgi to the ER, but not the anterograde transport of VSV-G or ssDsRed; and (iii) induces a high accumulation of Golgi-associated membrane buds. LPP3 depletion also reduces levels of de novo synthesized DAG and the Golgi-associated DAG contents. Remarkably, overexpression of a catalytically inactive form of LPP3 mimics the effects of LPP3 knockdown on Rab6-dependent retrograde transport. We conclude that LPP3 participates in the formation of retrograde transport carriers at the ER–Golgi interface, where it transitorily cycles, and during its route to the plasma membrane.