This Thesis studies different cellular and cell population processes driven by non-linear and stochastic dynamics. The problems addressed here gravitate around the concepts of transient dynamics and relaxation from a perturbed to a steady state. In this regard, in all processes studied, stochastic fluctuations, either intrinsically present in or externally applied to these systems play an important and constructive role, by either driving the systems out of equilibrium, interfering with the underlying deterministic laws, or establishing suitable levels of heterogeneity. The first part of the Thesis is committed the analysis of genetically regulated transient cellular processes. Here, we analyse, from a theoretical standpoint, three genetic circuits with pulsed excitable dynamics. We show that all circuits can work in two different excitable regimes, in contrast to what was previously speculated. We also study how, in the presence of molecular noise, these excitable circuits can generate periodic polymodal pulses due to the combination of two noise induced phenomena: stabilisation of an unstable spiral point and coherence resonance. We also studied an excitable genetic mechanism for the regulation of the transcriptional fluctuations observed in some pluripotency factors in Embryonic Stem cells. In the embryo, pluripotency is a transient cellular state and the exit of cells from it seems to be associated with transcriptional fluctuations. In regard to pluripotency control, we also propose a novel mechanism based on the post-translational regulation of a small set of four pluripotency factors. We have validated the theoretical model, based on the formation of binary complexes among these factors, with quantitative experimental data at the single-cell level. The model suggests that the pluripotency state does not depend on the cellular levels of a single factor, but rather on the equilibrium of correlations between the different proteins. In addition, the model is able to anticipate the phenotype of several mutant cell types and suggests that the regulatory function of the protein interactions is to buffer the transcriptional activity of Oc4, a key pluripotency factor. In the second part of the Thesis we studied the behaviour of a computational cell signalling network of the human fibroblast in the presence of external fluctuations and signals. The results obtained here indicate that the network responds in a nontrivial manner to background chatter, both intrinsically and in the presence of external periodic signals. We show that these responses are consequence of the rerouting of the signal to different network information-transmission paths that emerge as noise is modulated. Finally, we also study the cell population dynamics during the formation of microbial biofilms, wrinkled pellicles of bacteria glued by an extracellular matrix that are one of the simplest cases of self-organised multicellular structures. In this Thesis we develop a spatiotemporal model of cellular growth and death that accounts for the experimentally observed patterns of massive bacterial death that precede wrinkle formation in biofilms. These localised patterns focus mechanical forces during biofilm expansion and trigger the formation of the characteristic ridges. In this sense, the proposed model suggests that the death patterns emerge from the mobility changes in bacteria due to the production of extracellular matrix and the spatially inhomogeneous cellular growth. An important prediction of the model is that matrix productions is crucial for the appearance of the patterns and, therefore for winkle formation. We have also experimentally validated validated this prediction with matrix deficient bacterial strains, which show neither death patterns nor wrinkles. / En aquesta Tesi s’estudien diferents processos intracel·lulars i de poblacions cel·lulars regits per dinàmica estocàstica i no lineal. El problemes biològics tractats graviten al voltant el concepte de dinàmica transitòria i de relaxació d’un estat dinàmic pertorbat a l’estat estacionari. En aquest sentit, en tots els processos estudiats, les fluctuacions estocàstiques, presents intrínsecament o aplicades de forma externa, hi tenen un paper constructiu, ja sigui empenyent els sistemes fora de l’equilibri, interferint amb les lleis deterministes subjacents, o establint els nivells d’heterogeneïtat necessaris. La primera part de la Tesi es dedica a l’estudi de processos cel·lulars transitoris regulats genèticament. En ella analitzem des d’un punt de vista teòric tres circuits genètics de control de polsos excitables i, contràriament al que s’havia especulat anteriorment, establim que tots ells poden treballar en dos tipus de règim excitable. Analitzem també com, en presència de soroll molecular, aquests circuits excitables poden generar polsos periòdics i multimodals degut a la combinació de dos fenòmens induïts per soroll: l’estabilització estocàstica d’estats inestables i la ressonància de coherència. D’altra banda, estudiem com un mecanisme genètic excitable pot ser el responsable de regular a nivell transcripcional les fluctuacions que s’observen experimentalment en alguns factors de pluripotència en cèl·lules mare embrionàries. En l’embrió, la pluripotència és un estat cel·lular transitori i la sortida de les cèl·lules d’aquest sembla que està associada a fluctuacions transcripcionals. En relació al control de la pluripotència, presentem també un nou mecanisme basat en la regulació post-traduccional d’un petit conjunt de 4 factors de pluripotència. El model teòric proposat, basat en la formació de complexos entre els diferents factors de pluripotència, l’hem validat mitjançant experiments quantitatius en cèl·lules individuals. El model postula que l’estat de pluripotència no depèn dels nivells cel·lulars d’un únic factor, sinó d’un equilibri de correlacions entre diverses proteïnes. A més, prediu el fenotip de cèl·lules mutants i suggereix que la funció reguladora de les interaccions entre les quatre proteïnes és la d’esmorteir l’activitat transcripcional d’Oct4, un dels principals factors de pluripotència. En el segon apartat de la Tesi estudiem el comportament d’una xarxa computacional de senyalització cel·lular de fibroblast humà en presència de senyals externs fluctuants i cíclics. Els resultats obtinguts mostren que la xarxa respon de forma no trivial a les fluctuacions ambientals, fins i tot en presència d’una senyal externa. Diferents nivells de soroll permeten modular la resposta de la xarxa, mitjançant la selecció de rutes alternatives de transmissió de la informació. Finalment, estudiem la dinàmica de poblacions cel·lulars durant la formació de biofilms, pel·lícules arrugades d’aglomerats de bacteris que conformen un dels exemples més simples d’estructures multicel·lulars autoorganitzades. En aquesta Tesi presentem un model espai-temporal de creixement i mort cel·lular motivat per l’evidència experimental sobre l’aparició de patrons de mort massiva de bacteris previs a la formació de les arrugues dels biofilms. Aquests patrons localitzats concentren les forces mecàniques durant l’expansió del biofilm i inicien la formació de les arrugues característiques. En aquest sentit, el model proposat explica com es formen els patrons de mort a partir dels canvis de mobilitat dels bacteris deguts a la producció de matriu extracel·lular combinats amb un creixement espacialment heterogeni. Una important predicció del model és que la producció de matriu és un procés clau per a l’aparició dels patrons i, per tant de les arrugues. En aquest aspecte, els nostres resultats experimentals en bacteris mutants que no produeixen components essencials de la matriu, confirmen les prediccions.

Ret és un Receptor Tirosina Cinasa (RTK) que regula el desenvolupament del sistema genito-urinari i el desenvolupament del sistema nerviós perifèric. A més, les mutacions de guany de funció d’aquest receptor cursen amb el desenvolupament del Carcinoma Medul•lar de Tiroide (MTC), una neoplàsia de la glàndula tiroide que deriva de les cèl•lules C, productores de calcitonina. En mamífers, la família de Sprouty (Spry) està composta per quatre gens diferents (Spry1-4). Diferents anàlisis genètics en ratolins demostren que els gens Spry són inhibidors de la senyalització de Ret durant el desenvolupament dels ronyons i del sistema nerviós entèric. D’altra banda, alguns membres de la família de Spry s’han proposat com a possibles gens supressors de tumors en una gran varietat de patologies cancerígenes. A la primera part del nostre treball, hem volgut estudiar si la proteïna Sprouty1 pot actuar com un gen supressor de tumors al MTC. En primer lloc hem analitzat les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 i observem que desenvolupen una hiperplàsia de les cèl•lules C, una lesió precancerosa al desenvolupament del MTC. A més a més, demostrem que l’expressió de Spry1 redueix la proliferació d’una línia cel•lular derivada d’un MTC humà, la línia TT, degut a la inducció de la senescència cel•lular. Finalment, hem descobert que el promotor de Sprouty1 es troba freqüentment metilat en mostres humanes de MTC, cosa que provoca la disminució dels nivells d’expressió de Spry1 en aquest tipus de càncer. A la segona part del nostre treball, hem observat que la pèrdua de Spry1 provoca un augment del tamany de la tiroide dels ratolins a causa d’un increment de la proliferació de les cèl•lules fol•liculars. D’altra banda, les tiroides dels ratolins knockout per Spry1 mostren una disminució dels marcadors de senescència cel•lular, on s’hi inclou la reducció de la secreció dels factors que activen i mantenen el fenotip secretor associat a la senescència cel•lular (SASP). Finalment, hem observat una disminució de l’activació de la via NF-kB a la tiroide dels ratolins Spry1-/-, fet que correlaciona amb la disminució de la secreció dels factors IL-6 i KC. Com que la senescència cel•lular s’ha proposat com una potent barrera pel desenvolupament tumoral, hem volgut analitzar si la pèrdua de Spry1 pot accelerar el procés de tumorigènesi en ratolins susceptibles al desenvolupament tumoral. Els ratolins doble mutants per Pten i Spry1 mostren un augment de la incidència de tumors a la tiroide i a la glàndula adrenal si ho comparem amb els ratolins Pten+/-. Tot i que la pèrdua de Sprouty1 per si sola no és suficient per promoure la formació de tumors, accelera la tumorigènesi en el context d’una haploinuficiència de Pten. / Ret es un Receptor Tirosina Quinasa (RTK) que regula el desarrollo del sistema genitourinario y del sistema nervioso periférico. Además, las mutaciones de ganancia de función de estos receptores cursan con el desarrollo del Carcinoma Medular de Tiroides (MTC), una neoplasia de la glándula tiroides que deriva de les células C, productoras de calcitonina. En los mamíferos, la familia de Sprouty (Spry) está compuesta por cuatro genes distintos (Spry1-4). Análisis genéticos en ratones demuestran que los genes Spry son inhibidores de la señalización por Ret durante el desarrollo de los riñones y del sistema nervioso entérico. Por otra parte, algunos miembros de la familia de Spry se han propuesto como posibles genes supresores de tumores de una gran variedad de patologías cancerígenas. En la primera parte de nuestro trabajo, hemos querido estudiar si la proteína Sprouty1 puede actuar como un gen supresor de tumores del MTC. En primer lugar hemos analizado las tiroides de los ratones knockout para Spry1 y observamos que desarrollan una hiperplasia de las células C, una lesión precancerosa al desarrollo del MTC. Además, hemos demostrado que la expresión de Spry1 reduce la proliferación de una línea celular derivada de un MTC humano, la línea TT, por causa de la inducción de la senescencia celular. Finalmente, hemos descubierto que el promotor de Sprouty1 se encuentra frecuentemente metilado en muestras de MTC humanas, hecho que provoca la disminución de los niveles de expresión de Spry1 en este tipo de cáncer. En la segunda parte de nuestro trabajo, hemos observado que la perdida de Spry1 provoca un aumento del tamaño de la tiroides de los ratones a causa de un incremento de la proliferación de les células foliculares. Por otra parte, las tiroides de los ratones knockout para Spry1 muestran una disminución de los marcadores de senescencia celular, dónde se incluye la reducción de la secreción de los factores que activan y mantienen el fenotipo secretor asociado a la senescencia celular (SASP). Finalmente, hemos observado una disminución de la activación de la vía NF-kB a la tiroides de los ratones Spry1-/-, que correlaciona con la disminución de la secreción de los factores IL-6 i KC. La senescencia celular se ha propuesto como una potente barrera para el desarrollo tumoral, por eso hemos querido analizar si la pérdida de Spry1 puede acelerar el proceso de tumorigénesis en ratones susceptibles al desarrollo tumoral. Los ratones doble mutantes por Pten i Spry1 muestran un aumento de la incidencia de tumores a la tiroides y a la glándula adrenal si se compare con los ratones Pten+/-. La pérdida de Sprouty1 por si sola no es suficiente para promover la formación de tumores, pero acelera la tumorigénesis en el contexto de una haploinuficiencia de Pten. / Ret is a Receptor Tyrosine Kinase (RTK) that regulates several aspects of the development of the genito-urinary system and the peripheral nervous system. Moreover, gain-of-function mutations of this receptor cause the development of Medullary Thyroid Carcinoma (MTC), a rare neoplasm arising from the calcitoninproducing C-cells of the thyroid gland. Sprouty (Spry) family of genes is composed of four members in mammals (Spry1-4). Genetic analyses on mice demonstrate that Spry genes are inhibitors of Ret signalling during the development of kidneys and enteric nervous system. Moreover, some Spry family members have been proposed as candidate tumour-suppressor genes in a variety of cancerous pathologies. In the first part of our work, we wanted to elucidate whether Spry1 could act as a tumour suppressor gene in MTC. We analysed the thyroid gland of Spry1 null-mice and found that they develop C-cell hyperplasia, a precancerous lesion preceding MTC. In addition, we demonstrate that expression of Spry1 restrains proliferation of the MTCderived cell line TT by inducing cellular senescence. Finally, we found that the Spry1 promoter is frequently methylated and its expression decreased in human MTC. In the second part of our work, we found that Spry1 knockout mice present enlarged thyroid glands due to increased proliferation of follicular cells. Moreover, thyroids from Spry1 knockout mice show decreased markers of cellular senescence, including a reduction in secretion of factors that activate and maintain the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Finally, we determine that a defective activation of NF-kB signalling in Spry1 null thyroids underlie the observed effects on secretion of SASP factors IL-6 and KC. Since cellular senescence has been proposed as a potent barrier to tumorigenesis, we wanted to assess whether loss of Spry1 could accelerate the onset of tumorigenesis in a tumour-prone mouse. Pten and Spry1 double mutant mice show increased incidence of tumours of the thyroid and adrenal glands when compared to Pten+/- mice. Thus, although loss of Spry1 by itself might not be sufficient to promote tumour formation, it does accelerate tumorigenesis in the context of Pten haploinsufficiency.

Peripheral neuropaties are one of the major complications of the Peripheral Nervous System. Depsite the big importance of those pathologies, less drugs are effective for their treatment, and most of the prescribed drugs are based on the inhibition of pain. Nucleo CMP forte is a drug mainly composed of nucleotides (UMP, UDP, UTP and CMP), prescribed to patients with Peripheral Nervous System disorders. But their exact mechanism of action is still unknown. Because extracellular nucleotides can act as signalling molècules, our research group focus the studies in which are the effects of the Nucleo CMP forte drug and the triphosphate nucleotides in Schwann cells, one of the most important population in the regeneration of the Peripheral Nervous System. In response to peripheral nerve injury, Schwann cells adopt a migratiory phenotype and modify the extracellular matrix to make it permissive for cell migration and axonal regrowth. UTP and other nucleotides are released during nerve injury and activate purinergic receptors expresed on the Schwann cell surface, but little is known on the involvement of purine signalling in wound healing. Our results demonstrated that UTP treatment induces Schwann cell migration and wound healing, through the activation of the P2Y2 receptor. P2Y activation induces a biphasic MAPK activation (Early and Late) and also the activation of an extracellular metalloproteinase (MMP-2). Knockdown of the P2Y2 receptor or of MMP-2, using specific shRNAs, highly reduced cell migration and wound closure induced by UTP. MMP-2 activation evoked by injury or UTP was also mediated by the phosphorylation of all three major mitogen-activated protein kinases (MAPKs: ERK ½, p38 and JNK). Inhibition of these MAPKs decreased both MMP-2 activation and cell migration. Interestingly inhibition of MMP-2 activity, selectively blocked the late, but not the early MAPKs activation. These results suggest that MMP-2 activation and the late MAPKs phosphorylation are part of a positive feedback mechanism to maintain the migratory phenotype for wound healing. Moreover, treatment with UTP stimulates Schwann cell migration and wound repair through a MMP-2-dependent mechanism via P2Y receptors and MAPKs pathway activation.

Els objectius assolits en aquest treball de Tesi Doctoral han permés aprofondir coneixements dins l'àrea de recerca de la Immunologia de la Reproducció. En primer lloc, hem estudiat la funcionalitat de l'espermatozoide de mamífer en el procés de la capacitació i de la reacció acrosòmica mitjançant la utilització d'anticossos monoclonals específics de proteïnes de l'espermatozoide. En segon lloc hem demostrat la presencia d'anticossos anti-endometri en el sèrum de dones estèrils, en particular en el sèrum de dones amb endometriosi.En la primera part, describim anticossos monoclonals (mAbs) produïts contra diferents proteïnes del plasma seminal. Aquestes proteïnes resten adherides a la membrana plasmática de l'espermatozoide en el moment de l'ejaculació i són alliberades al llarg de la capacitació. Així hem estudiat la disociació de l'antígen reconegut pel mAb SEM-12 en l'espermatozoide humà, com varia la seva localització al llarg de la capacitació. Com a resultat més significatiu, hem descrit que el mAb SEM-12 inhibeix la reacció acrosòmica, la qual cosa ressalta la importancia que té la dissociació d'aquest tipus d'antígens de la membrana de l'espermatozoide. Amb anticossos monoclonals contra l'espermadhesina porcina AWN-1 hem establert, en un model in vivo, com aquesta disociació que observem in vitro, realment també succeeix in vivo. Aquest estudi funcional de l'espermatozoide, s'ha complertat amb experiments sobre l'efecte que la sortida de colesterol de la membrana té sobre la reacció acrosòmica, utilitzant una molécula acceptora de colesterol com és la b-ciclodextrina. Aquesta molécula afavoreix una sortida de colesterol de gairebé el 50% en un temps curt (10-30'), i es tradueix en reacció acrosòmica a partir de les 2 hores. Ambdos procesos, l'alliberament de proteïnes del plasma seminal adherides a la membrana plasmática i la sortida de colesterol estan relacionades entre si i en el temps al llarg de la capacitació de l'espermatozoide.En la segona part de la Tesi, aportem una técnica de ELISA per la determinació d'anticossos anti-endometri (AEA) en el sèrum de pacients estèrils. Aquesta técnica ha estat validada utilitzant cèl.lules endometrials provinents de biòpsies, i amb diferentes linies cel.lulars d'endometri, utilitzant uns sèrums de dones fértils com a controls per establir un llindar de negativitat pels AEA. Així hem establert que en patologies ginecològiques que cursen amb resposta inflamatòria hi han presents AEA, com per exemple en obstruccions de les trompes de Falopi (aproximadament el 60% de les pacients). Aquests AEA semblen ser conseqüència del desenvolupament de la patología i no la seva causa, ja que en un estudi realitzat amb pacients amb endometriosi hem observat com la presencia de AEA està relacionada amb el grau de desenvolupament de la malaltia; de un 7,4% de pacients amb un grau 1 d'endometriosi eren sèrums AEA pòsitius i aquest percentatge augmenta fins el 45.5% de sèrums AEA positius en pacients amb grau 3 d'endometriosi. Aquests anticossos podrien explicar la mala implantació embrionaria que es descriu en aquest tipus de pacients remeses a fecundació in vitro. El fet que pacients AEA negatives també tinguin aquests problemes implantacionals obre les portes a futurs estudis per avaluar l'efecte de l'estrés oxidatiu en l'aparició d'esterilitat. / The objectives of this Doctoral Thesis are focused on new aspects of Reproductive Immunology. First, we studied the mammalian sperm function, in some physiological processes such as capacitation and acrosome reaction by using sperm specific monoclonal antibodies raised against some sperm proteins. Secondly, we demonstrated the anti-endometrial antibodies in serum from sterile patients, particularly in women with endometriosis.In the first part of the work, we describe monoclonal antibodies (mAbs) that we have produced and recognize several seminal plasma proteins. These proteins bind to plasma membrane during ejaculation and are dissociated along capacitation. We have studied dissociation of SEM12 antigen, that is recognized by SEM12 mAb on human spermatozoa and its their relocalization along capacitation. The relevant result was that SEM12 mAb inhibited the acrosome reaction. This fact show how important sperm coating proteins are, and how their dissociation is basic for sperm function. With monoclonal antibodies against AWN-1 porcine spermadhesin, we established that seminal plasma proteins dissociation occurs also in vivo in porcine. We also have performed some experiments on cholesterol efflux from sperm plasma membrane, and its effect on acrosome reaction, using b-ciclodextrin as a cholesterol acceptor. A 50% of cholesterol efflux is produced in a short time (10-30'), and after 2 hours of incubation sperm acrosome reaction is promoted. Both processess, dissociation of seminal plasma proteins from sperm plasma membrane and cholesterol efflux are directly related along sperm capacitation.In the second part of this work, we described an ELISA technique for anti-endometrial antibodies (AEA) determination in serum from sterile patients. This immunoenzymatic technique is validated using, as a antigenic source, endometrial cells from human endometrial biopsies and using two established endometrial cell lines. We used sera from fertile women as a control, in order to establish positivity threshold. We have observed that some women with gynecological pathologies related to inflammatory response have AEA. For exemple, in patients with a tubal obstruction, we found a 60% of positive sera. AEA seems to be consequence of the pathology development but not the cause. In another study, we analyzed sera from patients with endometriosis and we determined that the presence of AEA is related to the degree of endometriosis. A 7.14% of patients with an stage 1 have AEA as compared with stage 3 of endometriosis where we found a 45.5% of positive sera. The presence of AEA antibodies could explain low implantation rates described in these sterile patients. The fact that AEA negative patients also have low embryo implantation rates, open new perspectives for the possible role of oxidative stress in sterility.

En aquest treball de tesi hem estudiat per primera vegada l’expressió funcional dels canals de calci dependents de voltatge (CCDV) en melanòcits humans i un ampli rang de línies cel.lulars i biòpsies de melanoma humà, mitjançant tècniques de biologia molecular i d’imatge. Els nostres resultats demostren que els melanòcits control i les cèl.lules de melanoma expréssen isoformes de les famílies de gens Cav1 i Cav2. De forma destacable, l’expressió d’isoformes de la família Cav3 (canals de tipus T) es troba restringida a les cèl.lules de melanoma, en les que promouen la progressió del cicle cel.lular. Aquests resultats motiven l’anàlisi dels CCDV-T com a dianes terapèutiques contra la tumorigènesi i/o progressió tumoral del melanoma. En aquesta línea, hem trobat que mibefradil i pimozida, dos bloquejants de CCDV-T d’us clínic, inhibeixen el creixement de les cèl.lules de melanoma in vitro, i que aquest efecte és degut tant a una reducció de la proliferació cel.lular, com a una inducció de la mort dependent de caspases. Hem explorat les vies moleculars implicades en el procés apoptòtic i hem trobat que ambdues drogues indueixen estrés de reticle endoplasmàtic (RE) i la inhibició subsequent de l’autofàgia basal constitutiva present a les cèl.lules de melanoma. Finalment, hem demostrat, a través del seu silenciament gènic, que la isoforma Cav3.2 és la diana molecular dels bloquejants de CCDV-T, en el que respecta als seus efectes sobre l’estrés de RE i l’autofàgia. Conjuntament, els resultats obtinguts en el decurs d’aquesta tesi apunten als canals de tipus T como a possibles marcadors de pronòstic i/o dianes terapèutiques contra la metastasi del melanoma. / Hemos estudiado por primera vez la expresión funcional de los canales de calcio voltaje-dependientes (CCDV) en melanocitos humanos y un amplio rango de líneas celulares y biopsias de melanoma humano, mediante técnicas de biología molecular y de imagen. Nuestros resultados demuestran que los melanocitos control y las células de melanoma expresan isoformas pertenecientes a las famílias de genes Cav1 y Cav2. De forma destacable, la expresión de isoformas de la família Cav3 (canales de tipo T) se encuentra restringida a las células de melanoma, en las que promueven la progresión del ciclo celular. Estos resultados motivan el análisis de los CCDV-T como dianas terapéuticas contra la tumorigénesis y/o progresión tumoral del melanoma. En esta línea, hemos encontrado que mibefradil y pimozida, dos bloqueantes de CCDV-T de uso clínico, inhiben el crecimiento de las células de melanoma in vitro, y que este efecto es debido tanto a una reducción de la proliferación celular como a una inducción de la muerte dependiente de caspasas. Hemos explorado las vías moleculares implicadas en el proceso apoptótico y hemos hallado que ambas drogas inducen estrés de retículo endoplasmático (RE) y la inhibición subsiguiente de la autofagia basal constitutiva presente en las células de melanoma. Finalmente, hemos demostrado, a través de su silenciamiento génico, que la isoforma Cav3.2 es la diana molecular de los bloqueantes de CCDV-T en lo concerniente a sus efectos sobre el estrés de retículo endoplasmático y la autofagia. Conjuntamente, los resultados obtenidos en el curso de esta tesis apuntan a los canales de tipo T como posibles marcadores de pronóstico y/o dianas terapéuticas contra la metástasis del melanoma. / We have addressed for the first time the functional expression of voltage-gated calcium channels (VGCCs) in human melanocytes and a range of melanoma cell lines and biopsies, by molecular biology and imaging techniques. Our results show that control melanocytes and melanoma cells express channel isoforms belonging to the Cav1 and Cav2 gene families. Importantly, the expression of isoforms of Cav3 (T-type) channels is restricted to melanoma cells, in which they promote cell cycle progression. These results encourage the analysis of T-type VGCCs as targets for therapeutic intervention in melanoma tumorigenesis and ⁄or tumour progression. In this regard, we have found that mibefradil and pimozide, two clinically-used T-type Ca2+ channel blockers, inhibit the in vitro growth of melanoma cells, and that this effect is due to both a reduction in the cell proliferation rate and an induction of caspase-dependent cell death. We have further explored the molecular pathways leading to T-type channels blockers-mediated apoptosis, and found that both drugs induce endoplasmic reticulum (ER) stress and a subsequent inhibition of the basal autophagy present in melanoma cells. Finally, we have demonstrated by a gene silencing approach that the Cav3.2 isoform is the molecular target of T-type channel blocker mediated effects on ER-stress and autophagy. Altogether, the results attained in this thesis point to T-type Ca2+ channels as putative prognosis markers and/or therapeutic targets to tackle melanoma metastasis.

Malgrat que el càncer de pròstata és un dels tumors més freqüents en els païssos desenvolupats, no s’han identificat encara quins gens clau podrien estar alterats. L’objectiu de la tesi ha estat estudiar quins mecanismes moleculars estan implicats en la inciació i progressió del càncer de pròstata. En el primer treball es va analitzar la freqüència de mutació de dos gens reguladors del cicle cel·lular (KLF6 i TP53) en tumors de pròstata sobre els quals hi havia publicada bibliografia discordant. Així, per exemple, en el cas de KLF6 el primer i el segon articles publicats en càncer de pròstata van descriure una freqüència de mutació del 55% i del 15% respectivament. Els dos estudis subseqüents la van descriure del 0 i de l’1%. El nostre estudi recolza la idea de què les mutacions de KLF6 i TP53 són fenòmens infreqüents en el càncer de pròstata i reforça la idea de què l’única manera de confirmar que els possibles canvis que es detecten són realment mutacions i no artefactes introduïts per la Taq-polimerasa és realitzar dos PCRs de manera independent. En el segon treball es va analitzar, per primer cop en càncer de pròstata, diferents gens de la via de PI3K-AKT i RAS-MAPK (PIK3CA, AKT, KRAS i BRAF) conjutament en un mateix grup tumors. En primer lloc, es van analitzar les mutacions en els hots spots coneguts d’aquests gens i en segon lloc es va estudiar mitjançant FISH i qRT-PCR la quantitat de còpies i els nivells d’expressió de PIK3CA respectivament. Per últim, es va estudiar els nivells proteics de pAKT. Els nostres resultat indiquen que les mutacions de PIK3CA, BRAF, KRAS i AKT1 són fenòmens infreqüents en els tumors de pròstata i la sobrexpressió d’ARNm de PIK3CA està associada amb els tumors de pròstata de Gleasons alts (≥7).A més a més, les amplificacions de PIK3CA i/o la sobrexpressió d’ARNm estan associades amb els nivells alts de pAKT. Finalment, en el tercer treball s’ha analitzat l’expressió genètica dels tumors de pròstata en funció del seu grau de Gleason. Els resultats d’aquest tercer treball són molt prometedors ja que han permès identificar un perfil de 12 gens que podrien tenir interès pel seu ús com a possibles marcadors de diagnòstic i pronòstic en el càncer de pròstata. A més a més, dos d’aquests gens (SEC14L1 i TCEB1) ja s’han pogut validar per immunohistoquímica i s’ha demostrat que la sobreregulació d’aquests gens està correlacionada amb el grau de Gleason, estadiatge tumoral i progressió bioquímica. Aquest estudi obre nous camins per seguir estudiant nous gens possiblement implicats en el carcinogènesi prostàtica.

En esta tesis se ha conseguido la caracterización bioquímica, biofísica y estructural del factor de transcripción mitocondrial A humano, TFAM. TFAM presenta múltiples funciones en la biogénesis de la mitocondria y está implicada en transcripción, replicación, empaquetamiento del ADN mitocondrial, reparación del ADN mitocondrial.... Para tratar de hallar los mecanismos moleculares se procedió a la resolución de la estructura cristalográfica de TFAM en complejo con su secuencia diana de unión en el promotor LSP (Light Strand Promotor). La estructura de TFAM en complejo con una secuencia de 22 pb de LSP (Rubio‐Cosials, Sidow et al.) mostraba cómo TFAM impone una torsión global del ADN de 180°, con ambos dominios HMGbox introduciendo un punto de curvatura mediante la unión al surco menor del ADN. Estudios en solución mediante SAXS (Small Angle Xray Scattering) de TFAM en forma no unida permitieron asignar un alto grado de flexibilidad para la región connectora entre los dominios HMGbox y la cola C‐terminal, ambas regiones cargadas positivamente. Esta flexibilidad de la zona connectora permite un gran número de conformaciones diferentes para TFAM en su forma libre, donde los dos dominios HMGbox se encuentran con posiciones relativas diferentes. Posteriormente mediante estudios de spFRET (singleparticle FRET), se confirmó el sistema de curvatura del ADN definido por la estructura cristalográfica con la introducción de una torsión en éste en forma de U. Los estudios de SAXS y spFRET indicaban que esta unión presentaba un comportamiento ligeramente dinámico, posiblemente debido a la flexibilidad intrínseca que muestra la región connectora entre los dos dominios HMGbox en solución. Los resultados obtenidos permiten entender la multitud de funciones asignadas a TFAM y en concreto, su papel en la activación de la transcripción a partir de LSP. / Transcription of human mitochondrial DNA requires transcription factor A (TFAM), also essential for DNA packaging and maintenance. Crystallographic analysis of TFAM in complex with an oligonucleotide encoding the light‐strand promoter (LSP) revealed for the first time a protein structure comprising two high‐mobility group (HMG) domains, which intercalate residues at two inverted DNA motifs and induce an overall DNA bend of ~180º stabilized by the inter‐domain linker. The U‐turn allows the TFAM C‐terminal tail, which recruits the transcription machinery, to approach the initiation site despite contacting a distant DNA sequence. We also show that structured protein regions contacting DNA in the crystal show high flexibility in solution, whereas both HMG domains have different DNA recognition capability. Our data suggest that TFAM bends LSP stepwise to create an optimal DNA conformation for transcriptional initiation, whilst facilitating DNA compaction elsewhere in the genome.

The adult central nervous system (CNS) has a very little capability to regrow its connections after lesion. The lack of axonal regeneration is a multifactorial problem, which is mainly due to the presence of inhibitory molecules in the CNS. Two main families of inhibitors exist, that of the so-called myelin-associated inhibitors, and that of the chondoritin-sulfate proteoglycans (CSPG). The question this thesis aims to address is the role of myelin-associated inhibitors in the regeneration of cortical connections. To do so, the model we have used is the entorhino-hippocampal connection and the main questions addressed were i) characterization of the temporal expression of MAG, Nogo-A and NgR, ii) analysis of their regulation after lesion, and iii) study of the effect of their blockade on axonal regeneration.Our results demonstrate that developmental expression of the myelin-associated inhibitors MAG and Nogo-A temporally coincides with the loss of regeneration capability of the entorhino-hippocampal connection also known as perforant pathway (PP). Moreover, expression of NgR (the common receptor for MAG and Nogo-A) also matches regeneration loss. After lesioning of the PP, MAG is overexpressed by mature oligodendrocytes which experiment a process of glial reactivity. Similarly, Nogo-A is re-expressed by reactive astrocytes in the deafferented hippocampus. The regulation of both inhibitors following injury supports a direct implication in the preventing axonal regeneration. To confirm this implication, we performed the blockade of MAG and the inhibitory domains of Nogo-A in an in vitro model (entorhino-hippocampal organotypic cultures). Both the blockade of MAG with Neuraminidase and the blockade of Nogo-A with NEP1-40 induced regeneration of the PP. Moreover, Blockade of CSPG with ChABC proved to be efficient in the same model. However, combination of NEP1-40 and ChABC, in order to block simultaneously Nogo-A-induced and CSPG-induced inhibition, did not display additive effects, suggesting a convergence in the inhibition mechanisms employed by both inhibitors. Last, we addressed the possibility of delaying treatment delivery as a therapeutic approach. While we confirmed that PP keeps its capability to regenerate during at least five days after lesion, we also determined that ChABC-based treatments are greatly compromised and lose efficiency when treatment is delayed.In conclusion, we have characterized the developmental expression pattern of the inhibitors MAG and Nogo-A and their common receptor NgR. The expression of the three proteins is strongly regulated following lesion and the blockade of MAG and Nogo-A is proved to be successful to promote axonal regeneration. We also determined the convenience of combined treatments and the most successful delivery schedule. Our data provide an insight for the development of new strategies addressed to induce axonal regeneration of injured cortical connections.

El complejo de Golgi (Golgi) es un orgánulo dinámico que modifica proteínas y lípidos sintetizados en el retículo endoplasmático (RE) y los clasifica para enviarlos a su destino final. Está formado por un conjunto de cisternas aplanadas y apiladas (stack), con una región central plana y otra lateral dilatada. Cada stack está polarizado, con una cara cis, que es donde se recibe la carga sintetizada, y una cara trans, que es donde se le da salida. Adyacente a esta zona hay la red trans-Golgi o TGN, que es donde se producen las últimas modificaciones y se distribuye la carga para su transporte. El Golgi interacciona con el citoesqueleto de actina y sus proteínas asociadas, ya que éstas se localizan en las membranas del Golgi tanto in vivo como in vitro. El ciotesqueleto de actina interviene en los procesos de fisión de membranas y en el mantenimiento de la estructura plana y contínua de las cisternas del Golgi. También está relacionado con el citoesqueleto de espectrina, una red submembranosa formada por la propia espectrina, la actina, la proteína 4.1, el intercambiador aniónico AE1 y la anquirina. Es responsable de la morfología de los eritrocitos, facilitando así su paso por los capilares. Se ha descrito un citoesqueleto de espectrina asociado al Golgi formado por varias isoformas como la βIII espectrina, la anquirina G119, el intercambiador aniónico AE2 y la proteína 4.1. No se sabe qué función realizan en el Golgi, pero se ha descrito que la espectrina está implicada en el transporte de la ATPasa Na+/K+ y del transportador de glutamato EAAT4. Con estos antecedentes nos planteamos la siguiente hipótesis: la βIII espectrina y la anquirina G119 son necesarias para el mantenimiento de la organización estructural del Golgi y para el transporte secretor asociado. Para demostrarla nos planteamos determinar su localización en el Golgi y su participación en el mantenimiento de la estructura del orgánulo, examinar su papel en el transporte secretor y estudiar el elemento responsable de su localización en el Golgi. Desarrollamos nuevos anticuerpos específicos contra la βIII espectrina y la anquirina G119 humanas pero sólo los de la βIII espectrina mostraban un marcaje en el Golgi. Por ello decidimos centrar todo el estudio en la βIII espectrina. Mediante estudios de colocalización con marcadores de las distintas regiones del Golgi determinamos que la βIII espectrina se encuentra enriquecida en los compartimentos distales (trans-Golgi y TGN). Mediante un ensayo enzimático que disminuía los niveles del fosfatidilinositol 4-fosfato [PI(4)P] del Golgi observamos que la localización de la βIII espectrina era dependiente de los niveles de este fosfoinosítido. Gracias a los ensayos de desplazamiento competitivo de la βIII espectrina determinamos que esta asociación era a través del dominio PH. También estudiamos la contribución de la dinámica de actina en la localización de la βIII espectrina mediante el uso de drogas anti-actina. La disrupción de la dinámica de actina no afecta a la localización de la βIII espectrina. Para estudiar el papel de la βIII espectrina en la estructura del Golgi y el transporte secretor, silenciamos la βIII espectrina mediante ARNs de interferencia o la microinyección de anticuerpos anti-βIII espectrina. En ambos casos observamos una fragmentación del Golgi. Usando varios ensayos de transporte, observamos que el transporte en la zona RE/Golgi y en el post-Golgi (transporte anterógrado) de proteínas solubles y transmembrana está alterado en ausencia de βIII espectrina. Sin embargo, el transporte retrógrado de la subunidad B de la toxina de Shigella no está alterado. Así pues, esta tesis expone que la βIII espectrina es el mayor componente esquelético de los compartimentos distales del Golgi, donde es necesaria para mantener la integridad estructural y la actividad secretora del Golgi, y que el PI(4)P es el determinante de membrana más relevante para la localización de la βIII espectrina. / A spectrin-based cytoskeleton is associated with endomembranes including the Golgi complex and cytoplasmic vesicles but its role remains poorly understood. Using new generated antibodies to specific peptide sequences of the human βIII spectrin, we here show its distribution in the Golgi complex, where it is enriched in the trans-Golgi and trans-Golgi network (TGN). The use of a drug-inducible enzymatic assay that deplete the Golgi-associated pool of PI4P as well as the expression of PH domains of Golgi proteins that specifically recognize this phosphoinositide both displaced βIII spectrin from the Golgi. However, the interference with actin dynamics using actin toxins did not affect the localization of βIII spectrin to Golgi membranes. Depletion of βIII spectrin using siRNA technology and the microinjection of anti-βIII spectrin antibodies into the cytoplasm lead to the fragmentation of the Golgi. At ultrastructural level, Golgi fragments showed swollen distal Golgi cisternae and vesicular structures. Using a variety of protein transport assays, we show that the ER-to-Golgi and post-Golgi protein transports were impaired in βIII spectrin-depleted cells. However, the internalization of the Shiga toxin subunit B to the ER was unaffected. We state that βIII spectrin constitutes a major skeletal component of distal Golgi compartments, where it is necessary to maintain its structural integrity and secretory activity, and unlike actin, PIP4 appears to be highly relevant for the association of βIII spectrin the Golgi complex.

This research work proposes a novel automated and integrated system for the production and in vitro culture of scaffolds, called BioCell Printing. The main goal of the present research work, besides the development of the device, was indeed the validation of the system. To assess the system, 3D PCL scaffolds with different pore sizes and geometries were produced and analyzed. The results revealed that process parameters do not induce significant chemical and physical changes on the polymeric material. On the other hand, the variation of scaffold’s internal topology has a strong impact in terms of the mechanical and biological behavior of produced constructs. Based on these results, bioactive composite scaffolds were prepared using PCL in combination with Hydroxiapatite for bone regeneration. The obtained results highlight the effect of particle size both on the mechanical properties of the scaffolds as well on the adhesion, proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells / En esta investigación se propone el desarrollo de un nuevo sistema automatizado e integrado de producción y cultivo celular in vitro de andamios, denominado Biocell Printing. Además del diseño de este sistema, constituye un objetivo central de este trabajo validar el sistema de fabricación. Así, fueron producidos andamios 3D en PCL con diferentes dimensiones y geometrías de poros. El análisis realizado a las estructuras nos permitió comprobar que, aunque los parámetros de procesamiento utilizados no induzcan cambios significativos en las propiedades químicas y físicas del polímero, lo cierto es que la variación de la topología interna de los andamios tiene una influencia decisiva en el comportamiento biomecánico de las estructuras producidas. Con base en estos resultados, fueron producidos andamios bioactivos de PCL y HA para la regeneración ósea. Los resultados nos han permitido observar el efecto de la granulometría en el comportamiento mecánico del andamio, así como en el proceso de adhesión, proliferación y diferenciación de las células hMSC