Orientador: Gláucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_DianeTeode_D.pdf: 21600008 bytes, checksum: 9d2d940e83841a4b2fb091014e2703ef (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O lipoheptapeptídeo cíclico surfactina é produzido por diferentes cepas de Bacillus subtilis. Em uma concentração de 20 mM, a surfactina é capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72 mN/m para 27 mN/m. Isto faz da surfactina o biossurfactante com maior potencial conhecido. O conjunto multienzimático, responsável pela síntese da surfactina, consiste de três grandes NRPSs: SrfA-A (402kDa), SrfA-B (401kDa) e SrfA-C (144 kDa), compreendendo um total de sete módulos. Os genes NRPSs correspondentes estão organizados no operon srfA. A produção de surfactina por B.subtilis é usualmente baixa e a produção em sistemas de expressão heterólogos como E.coli não é viável. Portanto, uma opção para aumentar a produção de surfactina seria o uso de sistemas de expressão utilizando o próprio Bacillus, colocando o operon srfA sob controle de um forte promotor que pode funcionar independentemente da regulação por feedback negativo endógeno. Para esta proposta, o promotor nativo do operon responsável pela síntese da surfactina em B.subtilis LB5a foi substituído pelo promotor Pgrac, o qual pode ser induzido por análogos de lactose. Este sistema de expressão é baseado em um forte promotor que não é inibido por fatores endógenos e, deve fornecer uma nova ferramenta para produzir altos níveis de surfactina em Bacillus subtilis. A eficácia do lipopeptídeo produzido pela cepa recombinante de B.subtilis pGrac-SrfA foi demonstrada usando testes de atividade hemolítica e avaliação da tensão superficial do meio. Os picos do lipopeptídeo obtido por HPLC para a cepa recombinante pGrac-SrfA apresentaram perfis semelhantes aos obtidos a partir da cepa selvagem. Análises de espectrometria de massas confirmaram a presença de uma série homóloga de lipopeptídeos com variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica caracterizando o composto como surfactina. Verificou-se a predominância do homólogo de massa molecular de 1000,18 u. A produção de surfactina pela cepa de B.subtilis recombinante foi cerca de 57% superior ao da cepa selvagem, quando induzida por isopropil b-D-1-tiogalactopiranosídeo / Abstract: The cyclic lipoheptapeptide surfactin is produced by different Bacillus subtilis strains. At a concentration of 20µM, this biosusrfactant is able to reduce the surface tension of water from 72 mN/m to 27 mN/m. This makes surfactin one the most powerful biosurfactants known so far. The surfactin synthetase is a large multienzyme complex consisting of three enzymatic subunits, SrfA (402 kDa), SrfB (401 kDa), and SrfC (144 kDa), comprising of a total of seven modules. The corresponding NRPS genes are organized in the srfA operon. Surfactin production from Bacillus strains is usually low and production of such large proteins in a heterologous system such as E. coli is not viable. One option to improve surfactin production would be to use Bacillus subtilis itself as an expression system and to place the srfA operon under the control of a strong promoter that can function independently of endogenous negative feedback regulation. For this purpose, the native promoter of the surfactin operon in B.subtilis LB5a was replaced by the promoter Pgrac, which can be induced by lactose analogs. This expression system is based on a strong promoter and is not expected to be inhibited by endogenous factors and, should provide a new tool for producing higher levels of surfactin in Bacillus subtilis.The efficacy of the lipopeptide produced for the recombinant B.subtilis pGrac-SrfA was demonstrated using tests of hemolytic activity and evaluation of the surface tension of the medium. HPLC peaks of surfactin gotten of the genetically modified strain showed patterns of lipopeptides similar to those of the wild-type strain, and mass spectrometry analysis confirmed the presence of a lipopeptide homologous serie with variations in the hydrocarbon chain length, known as surfactin. Was verified the predominance of a homologue with a molecular mass of 1000.18 u. The surfactin production of the recombinant bacterium was up to about 57% greater than that of wild-type strain when it was induced by isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T18:15:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amorim_EmanueleOliveiraCerqueira_M.pdf: 2851133 bytes, checksum: 521a3dc56b821671931089fc70f5b433 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O ozonio e considerado um sanitizante seguro para uso em produtos alimenticios pela sua propriedade de auto-decomposicao em oxigenio, nao deixando residuos nos alimentos. O amido, por sua vez, e um produto de ampla aplicacao na industria de alimentos, especialmente pela sua propriedade de retencao de agua e capacidade de formar geis. Neste estudo, avaliou-se a eficiencia do ozonio como um metodo de descontaminacao do amido de mandioca e a influencia da umidade do produto na eficacia do tratamento. Alem disso, verificou-se o efeito do tratamento nas caracteristicas fisico-quimicas, sensoriais e nas propriedades de pasta do amido e, posteriormente, estudou-se o comportamento do produto tratado com ozonio, durante dois meses de estocagem. Em amido de mandioca com 18% de umidade, foram empregadas concentracoes de ozonio no ar de 40 e 113 ppm para avaliar a inativacao de E. coli, e uma concentracao de 118 ppm, para avaliacao da inativacao de esporos de B. subtilis. Os tempos de exposicao ao ozonio empregados foram de 30, 60, 90 e 120 minutos. O tratamento durante 120 minutos, nas duas concentracoes estudadas, promoveu uma reducao de aproximadamente 2 ciclos logaritmicos na populacao de E. coli inoculada no amido. Para os esporos de B. subtilis, por sua vez, os tratamentos nao resultaram em inativacao significativa (< 1 ciclo log). Em amido com 30% de umidade, foram estudadas as concentracoes de 40 e 118 ppm de ozonio para avaliar a inativacao de E. coli e esporos de B. subtilis. Na menor concentracao e maior tempo de exposicao empregados (40 ppm/120 minutos), foi obtida uma reducao de 3,6 ciclos logaritmicos na populacao de esporos de B. subtilis. E na concentracao de 118 ppm, aos 90 e 120 minutos de tratamento, foram obtidas reducoes superiores a 5 ciclos logaritmicos. Para a populacao de E. coli, por sua vez, os tratamentos a 40 ppm durante 60 minutos e 118 ppm por 30 minutos foram responsaveis pela obtencao de reducoes superiores a 6 ciclos logaritmicos na concentracao do microrganismo inoculado. Para avaliacao do efeito do ozonio nas caracteristicas fisico-quimicas (pH, cor e oxidacao), sensoriais (cor e odor) e nas propriedades de pasta do amido de mandioca, o produto com 30% de umidade foi submetido aos tratamentos com ozonio gasoso nas concentracoes de 40 e 118 ppm por 30, 60, 90 e 120 minutos para a menor, e por 30 e 60 minutos para a maior concentracao. O pH das amostras ozonizadas foi significativamente inferior (p<0,05) ao pH da amostra nao tratada. No entanto, a cor e o conteudo de carboxila e carbonila do amido de mandioca nao foram significativamente alterados pelo ozonio. Por sua vez, as propriedades de pasta do amido ozonizado foram parcialmente alteradas, sendo que o efeito do ozonio foi mais evidente nos parametros de pico de viscosidade e breakdown, proporcionando a obtencao de pastas de amido com maior poder de intumescimento e com menor estabilidade de pasta durante o cozimento sob agitacao. Na avaliacao sensorial, o efeito do ozonio foi mais evidente no atributo de odor do que no atributo de cor, sendo que metade das amostras ozonizadas sofreu o efeito do ozonio nas suas caracteristicas sensoriais. Para avaliacao das caracteristicas fisico-quimicas, sensoriais, microbiologicas e das propriedades de pasta do amido de mandioca tratado com ozonio, durante dois meses de estocagem, o produto com 30% de umidade foi submetido a 118 ppm de ozonio durante 90 minutos. Com excecao do pH, as caracteristicas fisicoquimicas (umidade, cor e oxidacao) do amido de mandioca nao foram significativamente alteradas pelo ozonio. Nas propriedades de pasta, o efeito do ozonio foi mais evidente nos parametros de pico de viscosidade, breakdown e setback, proporcionando a obtencao de pastas de amido com maior poder de intumescimento, menor estabilidade de pasta durante o cozimento sob agitacao e menor tendencia a retrogradacao. O tratamento com ozonio provocou alteracoes significativas nas caracteristicas sensoriais de cor e odor do amido, sendo seu efeito mais notavel no segundo atributo. Os resultados obtidos no estudo das caracteristicas do amido, ao longo do periodo de estocagem, indicaram uma maior estabilidade do produto quando o tratamento de ozonizacao foi empregado, evidenciada principalmente pelas variaveis fisico-quimicas. Quanto as caracteristicas microbiologicas, as amostras estudadas estavam de acordo com a legislacao vigente e a ozonizacao proporcionou a reducao da concentracao de B. cereus do produto. Alem disso, a carga microbiana das amostras permaneceu inalterada ao longo do periodo de estocagem / Abstract: Ozone is considered a safe sanitizer to use in foods, due to its property of self-decomposition into oxygen, leaving no residue in food. Starch, on the other hand, is widely used in food industries due to its high water-holding capacity and ability to form gels. In this study, the effectiveness of ozone as a method of decontamination of cassava starch and the influence of the moisture content of the product on ozone efficiency were studied. Furthermore, the effect of the ozone on the physicochemical and sensory characteristics and pasting properties of cassava starch was determined. Also, the behavior of the starch treated with ozone was studied during two months of storage. In starch with a final moisture content of approximately 18%, ozone concentrations of 40 and 113 ppm were employed to evaluate the inactivation of E. coli and a concentration of 118 ppm, to evaluate the inactivation of B. subtilis spores. The exposure times used were 30, 60, 90 and 120 minutes. The treatments of 120 minutes, in the concentrations of 40 and 113 ppm, promoted a decrease of about 2 logarithmic cycles on the population of E. coli. For the spores of B. subtilis, the treatments with ozone did not result in a significant inactivation (<1 decimal reduction). In starch with a final moisture content of approximately 30%, ozone concentrations of 40 and 118 ppm were employed to evaluate the inactivation of E. coli and B. subtilis spores. In the lower concentration and a higher exposure time employed (40 ppm/120 minutes), a reduction of 3.6 logarithmic cycles was obtained in the population of B. subtilis spores. At 118 ppm of ozone, for 90 and 120 minutes of treatment, the concentration of those microorganisms suffered decreases of above 5 logarithmic cycles. For the population of E. coli, on the other hand, the treatments at 40 ppm/60 minutes and 118 ppm/30 minutes were necessary to obtain decreases of above 6 logarithmic cycles in the concentration of the inoculated microorganism. In order to evaluate the effect of ozone on the physicochemical and sensory characteristics and pasting properties of cassava starch, the product with 30% of moisture was exposed to gaseous ozone at approximate concentrations of 40 ppm for 30, 60, 90 and 120 minutes and 118 ppm for 30 and 60 minutes. The pH of the ozonized samples was significantly lower (p<0.05) than the pH of the standard sample. However, the color and the carboxyl and carbonyl contents of the cassava starch were not altered significantly by ozone. On the other hand, the pasting properties of ozonized starch were partially altered and the effect of ozone was more evident on the peak viscosity and breakdown. The ozonized samples presented higher peak viscosities and lower cooking stability under agitation than the untreated and control samples. In the sensory evaluation, the effect of ozone on the odor attribute was more pronounced than on the color, with half of the ozonized samples having suffered the effect of ozone on the their sensory characteristics. To evaluate, during two months of storage, the physicochemical, sensory, rheological and microbiological characteristics of the cassava starch treated with ozone, the product with 30% of moisture was exposed to gaseous ozone at a concentration of 118 ppm for 90 minutes. Except for the pH, the physicochemical characteristics (moisture, color and oxidation) of cassava starch were not altered significantly by ozone. On the pasting properties, the effect of ozone was more evident on the peak viscosity, breakdown and setback. The ozonized samples presented higher peak viscosities, lower cooking stability under agitation and lower retrogradation than the untreated sample. The sensory characteristics of cassava starch were significantly altered by ozone and the odor was the most affected attribute. The results obtained indicated that, during the storage period, the ozonized sample was more stable than the untreated sample, especially as regards to physicochemical characteristics. For the microbiological characteristics, the samples studied were in accordance with current legislation and the ozonation treatment reduced the population of B. cereus in cassava starch. Furthermore, during the storage period, the microbial load of the samples remained unchanged / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-05T16:48:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seixas_AnaClaudiaMendesde_D.pdf: 1212292 bytes, checksum: d02f2120ad8aef5082d96c1ed86dc0d6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Consideráveis pesquisas têm sido conduzidas nos últimos anos para descobrir novas enzimas que possam ser utilizadas no tratamento de resíduos. Devido ao aumento de poluentes no meio ambiente, tornando-se difícil a sua remoção por processos convencionais, o desenvolvimento de pesquisas com enzimas busca um processo alternativo de tratamento, de menor custo, mais rápido, mais simples e mais confiável. As proteases são a classe mais importante das enzimas industriais e compreendem cerca de 25% de todas as enzimas comerciais no mundo. A maior aplicação destas enzimas é nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e de detergentes. A finalidade do presente trabalho consistiu num estudo para determinar as melhores condições para produção de protease, bem como sua eficiência na hidrólise enzimática sobre a etapa biológica no tratamento de efluente líquido. Para a produção da protease foi testada uma cepa de Bacillus subtilis. O inóculo foi preparado em frascos Erlenmeyers (250 mL) contendo 50 mL de meio BHI , previamente esterilizado (121ºC, 15 min). Os frascos foram incubados a 30ºC durante 24 h com agitação de 200 rpm. Para a produção de protease foi utilizado um Planejamento Experimental Fatorial Fracionário 24-1, com triplicata no ponto central, tendose como variáveis independentes as concentrações de lactose, cloreto de sódio, caseína e pH. Como base foi utilizado o meio descrito por KEMBHAVI et al. (1993). Baseado nos resultados do planejamento experimental, foi realizado um ensaio cinético em fermentador do tipo tanque agitado contendo lactose (5,0 g.L-1) e caseína (5,0 g.L-1) a pH 6, 30OC e 300 rpm durante 30 h. O meio foi inoculado numa proporção de 10% (v/v) de inóculo. As amostras foram retiradas em intervalos de 1h, centrifugadas e o sobrenadante armazenado para análise. A atividade da protease foi medida pelo Método de KUNITZ (1947), utilizando caseína como substrato. A produção de 1124 U. mL-1 de atividade proteolítica foi obtida após 24 horas de fermentação. Com o objetivo de utilizar os próprios rejeitos industriais disponíveis em grande quantidade e sem custo como fonte de nitrogênio para o enriquecimento do meio de cultivo foi empregada água residuária do abatedouro de aves Pena Branca suplementada com caseína e MgSO4 na produção da enzima. O emprego do extrato enzimático, contendo protease, em uma das etapas do tratamento de efluente foi avaliado em um sistema de lodo ativado em reator tipo batelada, variando-se a água residuária e o lodo ativado. Nos primeiros ensaios foram colocados nos reatores o lodo proveniente de um reator do abatedouro de aves Pena Branca, o efluente bruto, a cultura de Bacillus subtilis ou o extrato enzimático. Em ensaios posteriores utilizou-se o lodo aclimatado, água residuária sintética, a cultura de Bacillus subtilis ou o extrato enzimático. Comparando os resultados dos tratamentos das águas residuárias do abatedouro de aves Pena Branca e sintética, as taxas de remoção de DQO da água residuária sintética foram em média 4 vezes maiores do que as taxas de remoção de DQO da água residuária do abatedouro de aves Pena Branca. A atividade do extrato enzimático B utilizado na água residuária sintética foi maior do que a do extrato enzimático produzido pela água residuária do abatedouro de aves Pena Branca, 1.124 U.mL-1 e 730 U.mL-1, respectivamente / Abstract: Considerable researches were carried out in the last years to discover new enzymes for treatment of residues. Due to the increase of pollutants in the environment, becoming difficult its removal for conventional processes, the development of these researches seek a alternative treatment process, lower cost, faster, simpler and more trustworthy. Proteases are the most important class of industrial enzymes and comprise about 25% of commercial enzymes on the world. The major applications of these enzymes are in the food, pharmaceutical and detergent industries. The purpose of this work consisted of a study to determine the best conditions for production of protease, as well as its efficiency in enzymatic hydrolysis on the biological stage in the liquid effluent treatment. Bacillus subtilis was tested for protease production. Inoculum was prepared in 250-mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL BHI strain, previously sterilized (121ºC, 15 minutes). The Erlenmeyer flasks were incubated at 30ºC for 24 h under agitation at 200 rpm. A Fractionary Factorial Experimental Planning was carried out in 24-1 with triplicate in the central point for protease production, independent variables were lactose, sodium chloride and casein concentration and pH. Strain described by KEMBHAVI et al (1993) was used as basis medium. Based in the results of the experimental planning a kinetic trial was carried out in fermentor type agitated tank containing lactose (5.0 g/L), casein (5.0 g/L), pH 6, 30ºC and 300 rpm for 30 h. The medium was inoculated in 10% (v/v) of inoculum proportion. The samples were removed in intervals of 1h, centrifuged and the supernatant stored for analysis. Protease activity was measured by the method of KUNITZ (1947) using casein as substrate. The production of 1,124 Um.L-1 proteolytic activity was obtained after 24 h of fermentation. With the objective to use the proper industrial wastes available in great amount and no cost as nitrogen source for the enrichment of the culture medium were carried out using wastewater from poultry slaughter Pena Branca supplemented with casein and MgSO4 for enzyme production. Using the enzymatic extract, contained protease, in one of the stages of the effluent treatment was evaluated in a batch reactor with activated sludge, varying the wastewater and the activated sludge. In the first assays were placed into the reactors the sludge (from poultry slaugther Pena Branca reactor), the crude effluent, Bacillus subtilis strain or enzymatic extract. Posterior assays were carried out with acclimatized sludge, synthetic wastewater, Bacillus subtilis strain or enzymatic extract. Comparing the results of the wastewater from poultry slaughter Pena Branca and synthetic wastewater treatments, the COD removal rates from synthetic wastewater were 4-fold higher than the wastewater from poultry slaughter Pena Branca. The enzymatic activity of B extract used in the synthetic wastewater was higher than the enzymatic extract produced by wastewater from poultry slaughter Pena Branca, 1,124 U.mL-1 and 730 U.mL-1, respectively / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T08:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perna_RafaelFirmani_M.pdf: 5058153 bytes, checksum: 4dda3e93c531c037f99cf72569d68ec3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo principal o estudo da separação e concentração do biossurfactante surfactina, sintetizado por fermentação através da bactéria Bacillus subtilis, utilizando-se o processo de fracionamento em coluna de bolhas e espuma, operada de modo semi-batelada, a fim de se otimizar o enriquecimento e a recuperação do bioproduto. O processo envolve a injeção de gás nitrogênio nas vazões de 20, 40 e 60 mL/min pela base da coluna de líquido que contém a solução de surfactina pH 7,0 nas concentrações iniciais de 240, 400 e 700 mg/L. O gás ascende na forma de bolhas e, durante o seu trajeto, moléculas de surfactina são adsorvidas na interface gás-líquido, devido às suas características anfifílicas. No topo da coluna de bolhas, forma-se uma coluna de espuma concentrada no biossurfactante adsorvido que, então, pode ser recuperado pela remoção e rompimento mecânico da espuma. Valores de enriquecimento e recuperação de surfactina foram determinados para diferentes condições experimentais. Os valores médios de enriquecimento ficaram entre 1,9 a 52,5 vezes, enquanto que a recuperação total de surfactina variou de 80,5 a 98,3 %. O maior valor de enriquecimento foi alcançado para soluções diluídas de surfactina operando a coluna a baixa vazão de gás e com temperatura relativamente elevada. Os resultados indicaram que o processo que utiliza coluna de bolhas e espuma se mostra promissor na etapa de concentração do biossurfactante. Foram obtidas as isotermas de Gibbs para a surfactina nas temperaturas de 15, 25 e 35 °C e ajustadas de acordo com o modelo de isoterma de adsorção de Langmuir. A aplicação da análise de variância mostrou que o modelo se ajustou satisfatoriamente aos resultados experimentais e a equação que o descreve apresentou significância estatística. Portanto, as moléculas do biossurfactante foram adsorvidas em monocamadas na interface gás-líquido. Desenvolveu-se, também, um modelo matemático para os fenômenos de convecção, difusão e equilíbrio, que foi aplicado para simular as curvas de depleção para a surfactina. O modelo representou satisfatoriamente os resultados experimentais quando comparados aos resultados simulados / Abstract: Foam fractionation of biosurfactant surfactin solutions obtained from fermentation with Bacillus subtilis bacteria was experimentally studied. A bubble and foam column system was mounted and operated in a semi-batch mode aiming at to optimize the concentration enrichment and the recovery of the bioproduct. The process involves the injection of gaseous nitrogen through a sparger in the basis of the column containing the surfactin liquid solutions. Gas flow rates of 20, 40 and 60 mL/min and initial concentrations of 240, 400 and 700 mg/L were used in the experimental runs. Temperatures of 15, 25 and 35 °C were used in the experiments. With the bubbles ascending in the column, a convection phenomena is produced from the liquid to the gas and due the amphiphilic property of the surfactant, solute molecules are adsorbed at the gas-liquid interface of the bubbles. A foam column on the top of the liquid column is also formed and after drainage phenomena and a break procedure of the foam, a surfactant concentrated solution is obtained. Surfactin enrichment and recovery from the initial solution were determined for several experimental conditions. Average values for the enrichment are in the range of 1,9 to 52,5 times and recovery are in the range from 80,5 to 98,3 %. The higher values of enrichment are got with diluted solutions runs operated at low gas flow rates and higher temperatures. The results indicates this process as very promising in the concentration of surfactin solutions. Using Gibbs adsorption theory for the gas-liquid interface, gas-liquid isotherms were obtained in the temperatures of 15, 25 and 35 °C and adjusted by the Langmuir model. A variance analysis from experimental planning was performed and showed a good agreement with experimental results. A mathematical modeling for the convection, adsorption and equilibrium represented satisfactorily the depletion curves in the bubble column / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

As doenÃas sÃo consideradas como o principal fator biolÃgico capaz de limitar e desestimular a carcinicultura no mundo. As viroses sÃo, invariavelmente, as que causam maior impacto e, por conseguinte, maiores prejuÃzos econÃmicos registrados no setor. O vÃrus da InfecÃÃo Hipodermal e Necrose HematopoiÃtica â IHHNV acomete os camarÃes silvestres e cultivados nas fases jovens e sub-adulta, mas nÃo causa danos à saÃde humana. Para a espÃcie Litopenaeus vannamei à considerado de baixo impacto, levando a uma enfermidade crÃnica denominada âsÃndrome da deformidade e do nanismoâ (RDS), que compromete a qualidade do produto com implicaÃÃes econÃmicas para a indÃstria camaroneira. O presente estudo teve por objetivo realizar testes de desafio com a espÃcie nativa do camarÃo Farfantepenaeus subtilis para verificar o comportamento da mesma frente ao vÃrus da IHHN. Foram utilizados 200 camarÃes jovens saudÃveis com peso corporal de 2,56  0,44g (mÃdia  desvio padrÃo; n = 200) mantidos em tanques individuais de 5,5L, em condiÃÃes monitoradas que reproduziram os parÃmetros ambientais de cultivo. Os animais foram desafiados de duas maneiras: um grupo por ingestÃo de tecido contaminado per os e outro por injeÃÃo intramuscular do extrato contendo o vÃrus, cada qual com seu grupo controle. Os grupos controles tiveram tratamentos semelhantes, porÃm um grupo ingeriu mÃsculo de camarÃo IHHNV negativo e outro recebeu extrato de mÃsculo de camarÃo livre de IHHNV. ApÃs trÃs dias de exposiÃÃo ao IHHNV, os animais foram alimentados com raÃÃo comercial duas vezes ao dia e observados quanto ao comportamento, mortalidade, muda e sintomas jà conhecidos em espÃcies susceptÃveis à doenÃa. O experimento teve duraÃÃo de 30 dias, quando foram colhidas aleatoriamente amostras de material biolÃgico para contagem total de hemÃcitos, anÃlise histolÃgica e molecular. O estudo demonstrou que a espÃcie nativa Farfantepenaeus subtilis capturada no EstuÃrio do Rio Pacoti no municÃpio de EusÃbio, Estado do Cearà à susceptÃvel à infecÃÃo pelo vÃrus da IHHN. / Diseases are the main biological factor that can limit and discourage the shrimp culture worldwide. Virus infection is the main cause of impact and economic losses registered in this sector. The Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) occurs in both wild and cultured shrimp, mainly in the juvenile and sub-adult phases, although it does not cause harm to human health. This pathogen is considered a low impact virus to Litopenaeus vannamei, causing a chronic disease called "Runt Deformity Syndrome" (RDS), which compromises the product quality and can have economic implications to shrimp industry. This study aimed at verifying response of the native species Farfantepenaeus subtilis in presence of the IHHN virus. The experiment utilized 200 healthy young shrimp weighing 2.56  0.44g (mean  standard deviation), kept in single 5.5L tanks, under monitored conditions similar to those found in shrimp culture farms. The animals have been challenged in two ways: âper osâ and by intramuscular injection, each one with its control group. After three days of exposition to the virus, the animals were fed with a commercial food two times a day, when were observed behavior, mortality, moulting and the signs for the characteristic symptoms in species susceptible to this disease. The experiment was conducted during 30 days. The shrimp were sample randomly for total hemocytes counting, histological and molecular analyses. This study showed that the native species F. subtilis caught in Pacoti River Estuary (EusÃbio - Cearà - Brazil) is susceptible to IHHNV infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial do microrganismo Bacillus subtilis LAMI005 em produzir biossufactantes utilizando suco de caju clarificado como fonte de carbono. A capacidade de produÃÃo do microrganismo foi avaliada com um ensaio preliminar utilizando meio mineral como meio e cultivo, tendo glicose e frutose padrÃo analÃtico como fonte de carbono. Posteriormente avaliou-se a influÃncia da variaÃÃo nas concentraÃÃes da fonte de carbono, utilizando suco de caju clarificado como substrato, mantendo a concentraÃÃo da suplementaÃÃo da fonte de nitrogÃnio constante com 1,0 g.L-1 de (NH4)2SO4. Realizou-se estudo cinÃtico para avaliaÃÃo da viabilidade de bioconversÃo do substrato utilizado em um produto de valor agregado, a surfactina bem como o tipo de metabÃlito formado. O ensaio com meio mineral, com concentraÃÃes iniciais de ART de 40,87 g.L-1 a maior concentraÃÃo de biomassa e surfactina obtidas foram de 2,5 g.L-1 137 mg.L-1 respectivamente,com 72 horas de ensaio. A menor reduÃÃo da tensÃo superficial do meio rico em surfactina foi em torno de 27,0 dina.cm-1, representando 55% de reduÃÃo. O pH permaneceu numa faixa de 6,0 - 7,0. Variando a fonte de carbono tendo concentraÃÃes iniciais de ART de 12,71 g.L-1, 22,92 g.L-1, 48,96 g.L-1, 65,04 g.L-1, 96,10 g.L-1 e 40,65 g.L-1 + 0,1% de soluÃÃo de micronutrientes, a maior produÃÃo de surfatina obtida foi no ensaio com concentraÃÃo de ART de 22,92 g.L-1 atingindo o valor de 372,56 g.L1 em 48 horas. A maior concentraÃÃo de biomassa alcanÃada para os ensaios com variaÃÃo nas concentraÃÃes iniciais de ART foram de 2,05 g.L-1, 5,3 g.L-1, 7,49 g.L-1, 8,6 g.L-1, 8,4 g.L-1 e 7,14 g.L-1 respectivamente, para as concentraÃÃes de ART supracitadas. Todos os ensaios apresentaram carbono residual ao final do processo, pH chegando a valores muito Ãcidos de atà 4,0, mostrando-se estÃvel na faixa entre 6,0 e 7,0 apenas no ensaio com concentraÃÃo de ART 96,10 g.L-1. O surfactante produzido apresentou boa capacidade emulsificante, em torno de 50%, em hidrocarbonetos como querosene e Ãleo de soja e formaram emulsÃes estÃveis, atingindo valores em torno de 2,0 U. Os ensaios fermentativos variando a concentraÃÃo da fonte carbono apresentaram velocidade especÃfica mÃxima de crescimento (&#956;xmÃx) semelhantes. As velocidades especÃficas de crescimento (&#956;x), de consumo de substrato (&#956;s) e de produÃÃo de biossurfactante (&#956;p) correlacionaram-se muito bem, podendo entÃo afirmar que a formaÃÃo do produto à um metabÃlito primÃrio e està associada ao crescimento. O modelo matemÃtico aplicado aos ensaios fermentativos ajustou-se bem aos dados experimentais, comprovando a viabilidade da bioconversÃo do substrato em um produto de valor agregado, a surfactina. / The purpose of this study was evaluate the biosurfactants potential production of the microorganism Bacillus subtilis LAMI005 using clarified cashew apple juice as carbon source. The microorganism production capacity was evaluated with preliminary test using mineral medium as inoculum and cultivation, and glucose and fructose standard analytical as carbon source. Subsequently, the influence of carbon source variation was evaluated keeping the supplementation of nitrogen source constant at 1.0 g.L-1 (NH4)2SO4. Kinetic study was conducted to assess the feasibility of substrate bioconversion used in a value-added product, surfactin, and the type of formed metabolite. The test with mineral medium with initial concentrations of 40.87 g.L-1 TRS were obtained the higher biomass concentration and surfactin of 2.5 g.L-1 and 137 mg.L-1 respectively in 72 hours of testing. The lower surface tension reduction of the medium rich in surfactin was around 27.0 dyne.cm-1, representing 55% reduction. The pH remained in a range from 6.0 to 7.0. By varying the carbon source and initial concentrations of TRS 12.71 g.L-1, 22.92 g.L-1, 48.96 g.L-1, 65.04 g.L-1, 96.10 g.L-1 and 40.65 g.L-1 + 0.1% solution of micronutrients, the highest yield was obtained in surfatin test concentration of TRS of 22.92 g.L-1 reaching a value of 372.56 g.L-1 in 48 hours. The highest concentration of biomass obtained for assays with variation in initial concentrations of TRS were 2.05 g.L-1, 5.3 g.L-1, 7.49 g.L-1, 8.6 g.L-1, 8.4 g.L-1 and 7.14 g.L-1 respectively, for concentrations above TRS. All tests showed residual carbon at the end of the process, reaching pH values much acid to 4.0, being stable in the range between 6.0 and 7.0 only at test concentrations of 96.10 g.L-1 TRS. Surfactant produced showed good emulsifying capacity, around 50% in hydrocarbons such as kerosene and soybean oil and formed stable emulsions, reaching values around 2.0 U. Fermentations varying the concentration of carbon source showed maximum specific growth (&#956;xmÃx) similar. The specific growth rates (&#956;x), substrate consumption (&#956;s) and biosurfactant production (&#956;p) fitted quite well, we conclude that the product formation is a primary metabolite and is associated with growth. The mathematical model used for testing fermentative fitted well to the experimental data, proving the feasibility of bioconversion of the substrate in surfactin.

Os surfatantes são substâncias químicas que têm uma ampla aplicação industrial principalmente como matéria-prima na fabricação de detergentes. No entanto, estas substâncias de origem sintética podem ser substituídas por biossurfatantes (BS), já que estes são biodegradáveis, menos tóxicos para o meio ambiente e além de estáveis em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. O alto custo de produção dos BS inviabiliza até o presente momento a substituição dos surfatantes químicos (mais tóxicos). Pesquisadores acreditam que a produção de BS tenha que atingir custos abaixo de 5 dolares/lb para serem economicamente viáveis. Uma das estratégias usadas para diminuir o custo da produção de BS, é usar diferentes subprodutos agrícolas e industriais. Os resíduos de natureza celulósica vêm ganhando espaço nos últimos anos como fontes de carbono alternativas para produtos de base biotecnológica, devido principalmente a sua abundância na natureza e ao apelo das tecnologias sustentáveis. O sisal é uma fonte lignocelulósica de rápido ciclo de crescimento que contém alto teor de celulose vegetal, e que é encontrado em grandes quantidades no Brasil. Este projeto teve como objetivo a produção de biossurfatante por Bacillus subtilis ATCC 21332, utilizando como fonte de carbono o hidrolisado lignocelulósico ácido e enzimático obtido da polpa de sisal. A produção do BS no substrato alternativo proposto foi comparada com a produção em meio de cultivo convencional (glicose). Os BS sintetizados foram avaliados quanto às propriedades físico-químicas: concentração micelar crítica (CMC), tensão superficial (TS) e tensão interfacial (TI). O BS obtido a partir da fermentação do hidrolisado enzimático apresentou TS = 28,71 mN.m-1; TI = 3,81 mN.m-1; e CMC = 64,0 mg.L-1; e aquele produzido a partir da fermentação do hidrolisado ácido apresentou TS = 29,79 mN.m-1; TI = 5,70 mN.m-1; e CMC = 1394,0 mg.L-1. Os valores de tensão superficial inferiores a 30 mN.m-1 indicaram que o hidrolisado ácido e enzimático da polpa de sisal oferecem boas condições como substratos alternativos para a produção de surfactina. As soluções dos BS obtidos em hidrolisado ácido e enzimático removeram 79,96% e 70,35% do óleo diesel de areia contaminada respectivamente, evidenciando-se o potencial para biorremediação. / The surfactants are chemical products that have huge industrial applications, mainly as raw materials in detergent industry. However, these synthetic substances can be replaced by biosurfactants (BS), since they are biodegradable, less toxic and stable at a wide range of pH, temperature and salt concentrations. In spite of these favorable characteristics, the high production costs of BS difficult their use as substitutes to synthetic surfactants (more toxic). If the production costs were less than 5 dollar/lb, their commercialization of BS would be possible. One strategy that permits reducing costs is the use of alternatives substrates from different industries such as byproducts or wastes from agricultural processing units. The lignocellulosic residues are one the most abundant sources of renewable organic carbon, for this reason in the last years, they began to be used as an unconventional carbon source for the synthesis of biotechnology products. Sisal is a lignocellulosic source that growths rapidly and is found in high quantity in Brazil. The objective of this study was the production of biosurfactant by Bacillus subtilis ATCC 21332, using as carbon source enzymatic and acid hydrolysates obtained from sisal pulp. The production using the alternative substrates was evaluated and compared with the production in conventional medium. The critical micelle concentration (CMC), surface tension (TS) and interfacial tension (IT) of the BS were evaluated, the following values were obtained for surfactin synthesized through the fermentation with enzymatic hydrolysate: TS = 28.71 mN.m-1, TI = 3.81 mN.m-1 and CMC = 64.0 mg.L-1. When the acid hydrolysate was used as carbon source the physical-chemical properties were TS = 29.78 mN.m-1, TI = 5.70 mN.m-1 and CMC = 1394.0 mg.L-1. Surface tension values lower than 30.0 mN.m-1 demonstrated that enzymatic and acid hydrolysate offer good conditions as alternative substrates for biosurfactant production. The surfactin synthesized exhibited potential for bioremediation; washing soil with BS obtained in acid and enzymatic hydrolysate removed 80% and 70% of diesel from contaminated sand, respectively.

A Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU) é a principal doença associada à infecção com linhagens de Escherichia coli produtoras de toxina de Shiga (Stx), doença para qual não há uma vacina ou tratamento específico. A toxina Stx é formada por uma subunidade A enzimaticamente ativa e uma B pentamérica responsável pela ligação da toxina na célula hospedeira. Neste trabalho propomos o uso de Bacillus subtilis, uma bactéria não patogênica e formadora de esporos, como veículo vacinal para a expressão de formas atóxicas da Stx2, sob o controle de um promotor induzível por estresse (PgsiB). Camundongos BALB/c imunizados com células vegetativas ou esporos das linhagens vacinais de B. subtilis, por diferentes vias, induziram baixos níveis de anticorpos anti-Stx em soro (IgG) e fezes (IgA). Avaliamos também o potencial imunogênico da Stx gerada em linhagens recombinates de E. coli, mas os anticorpos gerados não foram capazes de neutralizar a toxina nativa. Os resultados indicam que formas alternativas de expressão e/ou o uso de adjuvantes são necessárias para gerar formulações vacinais eficazes contra a SHU. / The Hemolytic Uremic Syndrome (HUS) is the main disease associated with infections with Shiga toxin (Stx) - producing Escherichia coli strain and no effective vaccine or treatment exist. The Stx toxin consist of an enzymatically active A subunit and a pentameric B subunit responsible toxin binding to host cells. In this work we propose the use of Bacillus subtilis, a harmless spore form bacteria as a vaccine vehicle for the expression atoxic forms of Stx2, under the control of stress inducible (PgsiB) promoter. BALB/c mice immunized with vegetative cells and spores of the B. subtilis vaccine strain using different immunization routes elicited low specific antibody levels at serum (IgG) or fecal extracts (IgA). We also investigated the immunogenic potencial of StxB purified from recombinant E. coli strain, but the induced anti-StxB antibodies did not neutralize the native toxin. The results indicate that alternative expression system or the incorporation of the adjuvants are required for the generation of vaccine formulation active against HUS.

O DNA de plasmídeos naturais de uma cepa de B. stearothermophilus foi clivado com a enzima de restrição Hind III e os fragmentos resultantes foram ligados com T 4 DNA ligase ao vetor pBR 322 (Bolívar et. al., 1977) que já havia sido previamente tratado com Hind III e fosfatase alcalina. A terça parte desta mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli HB 101. Foram obtidos cerca de 3.500 transformantes, dos quais 46% eram recombinantes. Duas cepas que mostraram caracter amilolítico consideravelmente maior que a doadora do gene continham o plasmídeo pBR 322 com uma inserção de 5.4 Kb. O mapa de restrição, tratamento com a enzima BAL 31 e, sucessivas subclonagens (Silva, E.F. et. al.,1986)mostraram que o gene que codifica e expressa a enzima amilolítica está contido em um fragmento de 2 Kb. A enzima produzida pelas células transformadas tem peso molecular de 60.000, é estabilizada por Ca+2, tem um ótimo de temperatura de 72ºC e retém 90% da atividade original após aquecimento a 85°C por 1 hora. Estes resultados, em conjunto com a análise dos produtos de hidrólise desta enzima em cromatografia de papel, sugerem que foi clonada a alfa - amilase de B. stearothermophilus em células de E. coli. Células de duas cêpas de B. subtilis, IA 289 e BD 241 foram transformadas respectivamente com os plasmídeos p USP 33.2 (Silva, E.F. et al., 1986;1987) e p BU 217 ami 2 (Silva, E.F. & Pueyo, M.T.,1988) para produzir em ambos os casos colônias fortemente amiloliticas. Os mecanismos pelos quais as 2 cêpas passaram a apresentar o fenótipo AMY + , são provavelmente diferentes. / The DNA of natural plasmids. from a B. stearothermophilus strain was cut with Hind III endonuclease and the resulting fragments were joined with T4 DNA ligase to the vector pBR 322 (Bolivar et al. , 1977), which had previously been treated with Hind III and alkaline phosphatase. One-third of the ligation mixture was used to transform E. coli HB 101 cells. It was obtained about 3.500 transformants, which included 46% recombinans. Two strains displayng amylolytic act ivity remarkably higher than the donor gene strain, harbored the plasmid pBR 322 with an insertion of 5.4 kb. The restriction map, Bal 31 treatment and successive subcloning (Silva, E.F, et al.,1986) showed that the entire gene which codifies and allows the expression of the amylolytic enzyme is contained in a 2 Kb fragment. The enzyme has a molecular weight of 60.000, is stabilized by Cata, has a temperature optimum at 72°C and retains 90% of the original activity after heating for 1h at 85°C. These features, together with the analysis of hydrolysis produts carried on paper chromatography , suggests that we succeded in cloning the amylase from B. stearothermophilus in E. coli cells. Cells from two B. subtilis strains, IQ 289 and BD 241 were transformed with the plasmid sp USP 33.2 (Silva E. F. et al., 1986 1987) and pBU 271 ami 2 (Silva, E. F. & Pueyo, M.T., 1988) , and produce in both strains, amyiolytic colonies. The methods in which the two strains have got the AMY + fenotype, may be very different.

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:50:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_FranciscoFabioCavalcante_D.pdf: 2000120 bytes, checksum: f060d84f3896d913e5e93d9a39dd6b0f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Um notável desenvolvimento dos bioprocessos tem sido alcançado nas últimas décadas. Entre os principais objetivos da aplicação desses processos está a obtenção de compostos de elevado valor agregado. Somado a isso há, atualmente, uma crescente demanda por materiais e energia, fato que resulta em desequilíbrios ambientais, especialmente quando esses bens são produzidos a partir de fontes não renováveis como o petróleo, por exemplo. Entre as diferentes estratégias para o desenvolvimento desses bioprocessos estão a coprodução, onde a partir de um mesmo processo são obtidos mais de um produto simultaneamente, e o uso resíduo e subprodutos agroindustriais como meios de cultura ou substrato de reações bioquímicas. Neste trabalho, foi realizado o estudo do processo fermentativo realizado pela bactéria Bacillus subtilis usando como meio de cultura a manipueira, um resíduo da industrialização de mandioca. Esse processo resultou na produção simultânea de biomoléculas de interesse industrial, no caso: lipopeptídios biossurfactantes, os compostos voláteis acetoína e diacetil e as enzimas do grupo das amilases e proteases. Adicionalmente, foi usado o método previamente descrito na literatura de recuperação primária de biossurfactantes baseado nos princípios da coluna de espuma. Esse procedimento possibilitou o arraste dos bioprodutos sem que fosse necessário o uso de compostos sintéticos, como solventes, ou a modificação dos parâmetros de fermentação / Abstract: A notable bioprocesses development was achieved in recent decades. Among the objectives of these processes is the production of high added value compounds. Moreover, there is a growing demand for materials and energy, which results in negative environmental issues, especially when those supplies are produced from non-renewable sources such as petroleum. Some of these different strategies for the bioprocesses development are co-production and the use of agro-industrial waste and by-products. The aim of this work was to study the fermentation process carried out by the bacterium Bacillus subtilis developed in manipueira that is a residue of the cassava industrialization. This process resulted in the simultaneous production of industrial interest biomolecules: lipopeptide biosurfactants, volatile compounds (acetoin and diacetil), and enzymes (amylases and proteases). It was used the primary recovery method of biosurfactants based on the principles of the column of foam. This procedure enabled the drag of bioproducts without the use of synthetic chemicals such as solvents, or modification of the fermentation parameters / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos