Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-10-06T11:57:20Z No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:21:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:21:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T16:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) Previous issue date: 2016-04-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Endothelial dysfunction has been considered a marker for the presence of cardiovascular disease. It is characterized by decreased release of vasodilatory factors and increased of vasoconstrictors factors. Nitric oxide (NO) is the main endogenous vasodilator molecule that regulates the vascular tone and homeostasis. Decrease in the bioavailability of NO can be caused by a variaty of factors, including the increase in the production of superoxide radical O2 •-. The production of O2 •- can be stimulated by angiotensin II, by the enzyme complex of the NADPH oxidase activation. Thus, the objective of this work was to study the effects induced by ruthenium complex cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2 -)] (DCBPY) and sodium nitroprusside (SNP) in endothelial dysfunction model, as well as perform the pharmacological characterization of the dependent effects removal of O2 •- and release of nitric oxide (NO) induced by these drugs. Normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) wistar rats were used. Aortic rings with intact endothelium were placed in a myograph and incubated with DCBPY: 0.1; 1.0 ou 10 μM ou com SNP: 0.1; 1.0 ou 10 nM during 30 minutes. Curves concentration-effect of acetylcholine (ACh) were built where it was possible to analyze all concentrations DCBPY and NPS improved relaxation induced by ACh. NO was measured intracellular (for DAF-2DA probe) in HUVEC treated with 0.1 μM of DCBPY, 0.1 nM a SNP and 0.1 μM DETA-NO. It was not detected NO release of the compounds DCBPY [0.1 μM] and SNP [0.1 nM]. It also evaluated the release of NO compound DCBPY using an electrode selective for NO. The compound DCBPY spontaneously release NO in solution form concentrationdependent, starting from 10 μM concentration. DCBPY released more NO in the presence of cells. This could be due to the reduction of the compound by reducing cell. Intracellular detection of superoxide radical (O2 •-) was obtained by using the fluorescent probe (DHE). Our results show that treatment of cells with DCBPY [0.1 μM] and SNP [0.1 nM] decreased the fluorescence intensity cells stimulated with angiotensin II. Thus, it is suggested that DCBPY and SNP at a concentration which does not release NO, inside the cells, they are capable of attenuating endothelial dysfunction by inactivating superoxide. / A disfunção endotelial tem sido considerada um marcador para a presença de doenças cardiovasculares. É caracterizada pela diminuição da liberação de fatores vasodilatadores e/ou aumento da liberação de fatores vasoconstritores. O óxido nítrico (NO) é a principal molécula vasodilatadora endógena que regula o tônus e a homeostase vascular. A diminuição na biodisponibilidade do NO pode ser causada por diversos fatores, incluindo o aumento na produção do radical superóxido O2 •-. A produção do O2 •- pode ser estimulada pela angiotensina II, pela ativação do complexo enzimático NADPH oxidase. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos induzidos pelo complexo de rutênio cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2 -)] (DCBPY) e Nitroprussiato de Sódio (NPS) em modelo de disunção endotelial, bem como realizar a caracterização farmacológica dos efeitos dependentes da remoção do O2 •- e liberação do óxido nítrico (NO) induzidos por estas drogas. Foram utilizados ratos Wistar machos normotensos (2R) e hipertensos (2R-1C). Anéis de aortas com endotélio intacto foram colocados em um miógrafo e incubados com DCBPY: 0,1; 1,0 ou 10 μM ou com NPS: 0,1; 1,0 ou 10 nM durante 30 minutos. Curvas concentração-efeito à acetilcolina (ACh) foram construidas onde foi possível analisar que todas as concentrações de DCBPY e NPS melhoraram o relaxamento induzido pela ACh. NO intracelular foi medido (por sonda DAF-2DA) em HUVEC tratadas com 0,1 μM de DCBPY, 0,1 nM de NPS ou 0,1 μM de DETA / NO. Não foi detectada liberação de NO dos compostos DCBPY [0,1 μM] e NPS [0,1 nM]. Também foi avaliada a liberação de NO do composto DCBPY utilizando eletrodo seletivo para NO. O composto DCBPY libera NO espontaneamente em solução de forma concentração dependente a partir da concentração 10 μM. Na presença das células, houve um aumento na liberação de NO na concentração 10 μM do composto DCBPY de 1,69 vezes em comparação com a detecção sem a presença de células. Isto pode ter ocorrido devido à redução do composto por redutores celulares. A detecção intracelular do radical superóxido (O2 •-) foi obtida através da utilização da sonda fluorescente DHE. Os nossos resultados mostram que o tratamento de células com DCBPY [0,1 μM] e de NPS [0,1 nM] diminuiu a intensidade de fluorescência a DHE em células estimuladas com angiotensina II. Assim, sugere-se que DCBPY e NPS, em uma concentração que não libera NO no interior das células, são capazes de atenuar a disfunção endotelial por inativar o radical superóxido.

Submitted by LUANA CHIQUETTO PARACATÚ null (luanachiquetto@hotmail.com) on 2016-07-14T18:15:23Z No. of bitstreams: 1 TESE - Luana Chiquetto.pdf: 2823701 bytes, checksum: 584996ba0cd6c6754d03400de9c6de73 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-18T20:01:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paracatu_lc_dr_arafcf.pdf: 2823701 bytes, checksum: 584996ba0cd6c6754d03400de9c6de73 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T20:01:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paracatu_lc_dr_arafcf.pdf: 2823701 bytes, checksum: 584996ba0cd6c6754d03400de9c6de73 (MD5) Previous issue date: 2016-06-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Inúmeras patologias têm a sua gênese e/ou progressão relacionadas à produção desregulada de intermediários oxidantes. O complexo multienzimático NADPH oxidase é um dos componentes de maior relevância neste contexto, pois é uma das principais fontes de ânion superóxido no organismo animal. Sendo expresso em inúmeros tecidos, incluindo leucócitos e células do tecido endotelial, o desenvolvimento de inibidores eficientes deste complexo enzimático poderá significar uma nova terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas. Com objetivo de explorar a relação entre a estrutura molecular, as propriedades químicas e atividades biológicas, utilizamos o éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE) como inibidor do complexo enzimático NADPH oxidase e comparamos sua eficácia com o seu precursor ácido cafeico e os derivados, éster fenetílico do ácido cinâmico e o ácido clorogênico, correlacionando-os a respeito a sua hidrofobicidade, propriedades redox e inibição do complexo NADPH oxidase em leucócitos ativados. A hipótese seria de que um aumento da hidrofobicidade provocado pela esterificação do ácido cafeico poderia facilitar o seu acesso à membrana celular e assim alterar seu efeito como possível inibidor de NADPH Oxidase. Os resultados, em ensaios in vitro, mostraram que as alterações na hidrofobicidade não provocaram alterações significativas no potencial de oxidação e potencial antioxidantes dos compostos testados. Quando testados em leucócitos ativados (modelos ex vivo), a esterificação provocou uma melhora significativa na capacidade de inibição do complexo NADPH oxidase. Este potente efeito se propagou às EROs decorrentes de ânion superóxido e produzidas por leucócitos, como peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso, entretanto, sem alterar a capacidade fagocítica dos leucócitos. Os resultados deste estudo mostram que nos ensaios celulares o CAPE foi o composto mais potente em relação ao seu precursor ácido e ácido clorogênico, sendo significativamente mais efetivo na inibição da produção das EROs. Da mesma forma, CAPE foi o inibidor mais eficaz da expressão de TNF-α e IL-10 por Staphylococcus aureus células estimuladas. Em conclusão, a presença do grupo catecol e a maior hidrofobicidade, do CAPE, foram essenciais para os efeitos biológicos, confirmando nossa hipótese. Considerando-se o envolvimento da NADPH-oxidases na génese e progressão de doenças inflamatórias, CAPE deve ser considerada como uma droga anti-inflamatória promissora. / Several diseases have their genesis and / or progression related to unregulated production of oxidants intermediates. The multienzymatic complex NADPH oxidase is one of the most important components in this context because it is a major source of superoxide anion in animal organisms. It is expressed in numerous tissues, including leukocytes and endothelial tissue cells. Developing effective inhibitors of this enzyme complex may indicate a new therapy for the treatment of chronic inflammatory diseases. Several studies have described numerous anti-inflammatory properties attributed to caffeic acid phenethyl ester (CAPE), an active component found in propolis. In order to explore the relationship between the molecular structure, chemical properties and biological activities, we used CAPE to inhibit the enzyme complex NADPH oxidase and compare its efficacy with the its precursor caffeic acid and derivatives, phenethyl ester of cinnamic acid and chlorogenic acid, correlating them with regard to hydrophobicity, redox properties and inhibition of NADPH oxidase complex on activated leukocytes. The hypothesis was that an increase of hydrophobicity caused by the esterification of caffeic acid could facilitate access to cell membranes and thereby alter its effect as a possible inhibitor of NADPH oxidase. The results (in vitro), showed that the changes in hydrophobicity did not provoke significant changes in the oxidation potential and antiradical potency of the tested compounds. But when tested in activated leukocytes (ex vivo), the esterification caused a significant improvement in the ability to inhibit the NADPH oxidase complex. This potent inhibition effect resulted also in the blockage of production of hypochlorous acid, however, without altering the phagocytic ability of leukocytes. The results of this study show that in cellular assays, CAPE was the most potent compound in comparison to caffeic acid and chlorogenic acid, significantly more effective in inhibiting the production of ROS. Likewise, CAPE was the most effective inhibitor of expression of TNF-α and IL-10 in Staphylococcus aureus stimulated cells. In conclusion, the presence of the catechol moiety and the higher hydrophobicity of CAPE were essential for the biological effects. Considering the involvement of NADPH oxidases in the genesis and progression of inflammatory diseases, CAPE should be considered as a promising anti-inflammatory drug.

Submitted by NARA ALINE COSTA null (nac_nutri@hotmail.com) on 2017-01-15T14:33:48Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado 27 out 2016 - Nara Aline Costa.pdf: 2072860 bytes, checksum: 1f905d806257fb7526fecc075951e519 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-01-19T17:35:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_na_dr_bot.pdf: 2072860 bytes, checksum: 1f905d806257fb7526fecc075951e519 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-19T17:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_na_dr_bot.pdf: 2072860 bytes, checksum: 1f905d806257fb7526fecc075951e519 (MD5) Previous issue date: 2016-12-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estresse oxidativo é reconhecido como característica fundamental da sepse e pode ser uma via comum para o desenvolvimento da lesão renal aguda (LRA). Alguns biomarcadores para a detecção precoce da LRA tem sido estudados, no entanto, apesar da importância no combate ao estresse oxidativo, a atividade da superóxido dismutase 1 (SOD1) ainda não foi avaliada na LRA em pacientes críticos. Nosso objetivo foi avaliar a atividade eritrocitária da SOD1 como preditora de LRA em pacientes com choque séptico. Este é um estudo prospectivo observacional que avaliou 175 pacientes consecutivos, maiores de 18 anos e com choque séptico na admissão na Unidade de Terapia Intensiva (UTI). Foram excluídos 43 pacientes. Assim, 132 pacientes foram incluídos no estudo. Nas primeiras 24 horas da admissão dos pacientes, foram coletados os dados demográficos e amostras de sangue para determinação da atividade eritrocitária da SOD1 e da concentração do malondialdeído (MDA). Todos os pacientes foram acompanhados durante a internação na UTI e o desenvolvimento da LRA foi avaliado. Além disso, também foram avaliados 17 indivíduos controle. A média de idade dos pacientes com choque séptico foi 63,2 ± 15,7 anos, 53% eram homens e a mediana do tempo de internação na UTI foi de 8 (4- 16) dias. Aproximadamente 51% dos pacientes desenvolveram LRA durante a internação na UTI. A mediana da atividade eritrocitária da SOD1 foi 2,92 (2,19- 3,92) U/mgHb. Quando comparado com os indivíduos controle, os pacientes com choque séptico tiveram uma maior concentração sérica de MDA [grupo choque: 1,4 (0,8-2,2) µmol/L vs grupo controle: 0,8 (0,5-1,1) µmol/L; p: 0,003] e menor atividade eritrocitária da SOD1 [grupo choque: 2,9 (2,2-3,9) U/mgHb vs grupo controle: 4,4 (3,3-4,7) U/mgHb; p: 0,001]. Na análise univariada, a atividade eritrocitária da SOD1 foi menor nos pacientes que desenvolveram LRA. A análise da curva ROC revelou que a menor atividade eritrocitária da SOD1 foi associada com o desenvolvimento LRA no ponto de corte < 3,32 U/mg Hb. No modelo de regressão logística, atividade da SOD1 maior que 3,32 U/mg Hb foi associada com proteção do desenvolvimento de LRA quando ajustado pela hemoglobina, fósforo e escore APACHE II (OR: 0,309; IC 95%: 0,137-0,695; p: 0,005) e quando ajustado pela idade, gênero, doença renal crônica, categoria da admissão (clínica ou cirurgica) e escore APACHE II (OR: 0,129; IC 95%: 0,033-0,508; p: 0,003). Em conclusão, a atividade eritrocitária da SOD1 é um biomarcador precoce de LRA em pacientes com choque séptico. / Oxidative stress is recognized as a fundamental characteristic of sepsis and may be a common pathway for the development of acute kidney injury (AKI). Some biomarkers for early detection of AKI have been studied, however, despite the importance in combating oxidative stress, the activity of superoxide dismutase 1 (SOD1) has not been evaluated in AKI in critically ill patients. Our objective was to evaluate erythrocyte SOD1 activity as predictor of AKI in patients with septic shock. This is a prospective observational study that evaluated 175 consecutive patients over the age of 18 years with septic shock upon Intensive Care Unit (ICU) admission. Forty-three patients were excluded. Thus, 132 patients were enrolled in the study. In the first 24 hours of the patients’ enrollment, demographic information was recorded and blood samples were taken to determine the erythrocyte SOD1 activity and the concentration of malondialdehyde (MDA). All patients were followed throughout the ICU stay, and the development of AKI was evaluated. In addition, we also evaluated 17 control subjects. The mean age of patients with septic shock was 63.2 ± 15.7 years; 53% were male, and the median ICU stay was 8 (4-16) days. Approximately 51% of patients developed AKI during the ICU stay. The median erythrocyte SOD1 activity was 2.92 (2.19-3.92) U/mg Hb. When compared to control subjects, septic shock patients had a higher serum MDA concentration [shock group: 1.4 (0.8-2.2) µmol/L vs control group: 0.8 (0.5-1.1) µmol/L; p: 0.003] and lower erythrocyte SOD1 activity [shock group: 2.9 (2.2-3.9) U/mgHb vs control group: 4.4 (3.3-4.7) U/mgHb; p: 0.001]. In univariate analysis, erythrocyte SOD1 activity was lower in patients who developed AKI. The ROC curve analysis revealed that lower erythrocyte SOD1 activity was associated with AKI development at the cutoff of < 3.32 U/mg Hb. In the logistic regression models, SOD1 activity higher than 3.32 U/mg Hb was associated with protection of AKI development when adjusted by hemoglobin, phosphorus and APACHE II score (OR: 0.309; CI95%:0.137-0.695; p=0.005) and when adjusted by age, gender, disease chronic renal, admission category (medical or surgery) and APACHE II score (OR: 0.129; CI95%:0.033-0.508; p= 0.003). In conclusion, erythrocyte SOD1 activity is an early predictor of AKI in patients with septic shock. / FAPESP: 2014/17262-0

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Luis Octávio Regasini / Banca: Claudia Solano Rocha / Resumo: A tripanossomíase Americana, mais conhecida por doença de Chagas, é transmitida por triatomíneos infectados pelo agente etiológico Trypanosoma cruzi. Desde que foi descrita pela primeira vez em 1909, a doença tem se expandido pelo mundo infectando milhões de pessoas, principalmente na America Latina, onde ela é endêmica. Atualmente, apenas dois fármacos estão disponiveis para o tratamento, o nifurtimox, que não é usado no Brasil, e o benzonidazol, que teve sua produção industrial bastante reduzida. No entanto, ambos os fármacos tem ações limitadas. Assim, a busca de novas substâncias e a compreensão do mecanismo de resistência aos fármacos tripanossomicidas disponíveis e aos que ainda estão em fase de pesquisa, tem sido motivo de vários estudos. Alguns estudos relatam um aumento na produção de enzimas que atuam na defesa celular, as quais, provavelmente, poderiam ser responsáveis pela resistência do parasito. Algumas enzimas têm funções importantes na sobrevivência e crescimento dos parasitos: superóxido dismutase (SOD), metaloenzima que elimina radicais superóxido ao convertê-los em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular; old yellow enzyme (OYE), uma NADPH flavina oxidoredutase que pode estar envolvida na redução de substâncias tripanossomicidas, e peroxiredoxina (Prx), que catalisa a redução de peróxidos. Por meio de Western blotting analisou-se as modificações em nível de expressão das enzimas SOD, OYE e Prx em cepas de T. cruzi tratadas ou não com um composto derivado benzofuroxânico, LAPDESF-BZFS (6-((metil)benzo[c](2-carbamoilidrazona)-1-Nóxido-1,2,5-oxadiazol). O IC50 (índice de citotoxicidade) desse composto foi de 6,88 µg/mL, e promoveu alterações na expressão das enzimas Prx e OYE, provavelmente promovendo o estresse oxidativo em formas epimastigotas. / Abstract: The American trypanosomiasis, also known for Chagas disease, and transmitted for infected triatomine by etiological agent Trypanosoma cruzi. Since it was first described in 1909, this disease has expanded the world infecting millions of people, mostly in Latin America, where it is endemic. Currently only two drugs are available for Chagas disease treatment, nifurtimox, which is not used in Brazil, and benznidazole, which had its much reduced industrial production. However, both drugs have limited actions. Thus, the search for new compounds and to understand the mechanism of resistance to trypanocidal drugs available and that are still in the research phase, have been the subject of several studies. Some studies report an increase in the production of enzymes that action in cellular defense, which probably could be responsible for parasite resistance. Some enzymes have important functions in the survival and growth of parasites: superoxide dismutase (SOD), metalloenzyme that eliminates superoxide radicals to convert them hydrogen peroxide and molecular oxygen; old yellow enzyme (OYE) a NADPH- flavin oxidoreductase that may be involved in the reduction of trypanocidal substances and peroxiredoxin (Prx), which catalyzes the reduction of peroxides. By means of Western blotting analyzed for changes in expression level of SOD, Prx and OYE in strains of T. cruzi treated or not with a compound derived benzofuroxânico, LAPDESFBZFS ( 6 - (( methyl) benzo [c ] (2- carbamoilidrazona ) -1 -N-oxide -1,2,5- oxadiazol ). The CI50 (cytotoxicity index) of this compound was 6.88 µg/mL, and promoted changes in the expression of PRX and OYE enzymes, probably by promoting oxidative stress in epimastigotes . / Mestre

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.

OBJETIVOS: determinar a relação entre parâmetros de estresse oxidativo, gravidade de sepse e resposta ao tratamento com antioxidantes. MATERIAL E MÉTODOS: foram incluídos pacientes consecutivos admitidos na UTI de um hospital terciário com o diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico. Os pacientes foram avaliados diariamente e foi coletado sangue imediatamente após a inclusão no estudo (máximo de 12h após diagnóstico de sepse). Avaliou-se os níveis séricos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), carbonilação de proteínas, atividade de superóxido dismutase (SOD) e catalase. Estas variáveis foram correlacionadas com desfecho e variáveis clínicas. Para determinar a relação dos parâmetros oxidativos na resposta ao tratamento, utilizamos o modelo de ligação cecal e perfuração (CLP) empregando ou não tratamento antioxidante (N-acetilcisteína mais deferoxamina). Coletou-se sangue da veia caudal 3h após a indução de sepse e correlacionou-se os parâmetros com resposta ao tratamento antibiótico e antioxidante. Para determinar se o tratamento antioxidante poderia ser retardado por 12h, em uma segunda amostra de animais coletou-se sangue da veia caudal e administrou-se ou não tratamento após 12h da indução de sepse. RESULTADOS: níveis elevados de proteínas carboniladas e de SOD no diagnóstico de sepse são relacionados com óbito por sepse nesta amostra. Estes parâmetros são correlacionados com a gravidade da doença avaliada pelos escores APACHE II e MODS. Níveis de atividade da SOD podem prever resposta ao tratamento com antioxidantes no modelo CLP, tanto 3 como 12h após a indução de sepse. CONCLUSÃO: Parâmetros oxidativos são associados com gravidade e desfecho de sepse em UTI geral, e podem prever resposta ao tratamento antioxidante em animas. / OBJECTIVE: determine the relationship between oxidative stress parameters, sepsis severity and treatment response to antioxidants. MATERIALS AND METHODS: were included consecutive patients admited on ICU at a tertiary care Hospital with sepsis, severe sepsis or septic shock. The patients were evaluated, blood samples were colected immediately after study inclusion (12h maximum after sepsis diagnosis). We determined plasma levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyls, superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and correlate it to clinical parameters. To determine the relation between oxidative parameters and response to antioxidant treatment we used the cecal ligation and perforation (CLP) model of sepsis, using or not antioxidants (n-acetyilcysteine plus deferoxamine) 3 or 12 hours after CLP. RESULTS: non-survivor septic patients presented higher protein carbonyls and SOD activity when compared to survivor patients. These parameters were correlated to APACHE II and MODS in our sample. In addition, plasma SOD levels predicted response to antioxidant treatment in the CLP model, both 3 and 12 houras after sepsis induction. CONCLUSION: Oxidative parameters are correlated to severity and outcome in septic patients and could predict response to antioxidant treatment in the CLP model.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; and 1.6 &Aring; resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; e 1.6 &Aring; respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

A doença do sono é causada pelo parasita Tripanosoma brucei. Considerada uma doença negligenciada, mata milhares de pessoas todos os anos na África subsaariana. O T.brucei não apresenta resposta imune pronunciada, o que dificulta o desenvolvimento de vacinas, e os medicamentos disponíveis são escassos. Os tripanossomatídeos são comprovadamente sensíveis ao stress oxidativo causado pelo radical superóxido. Assim, as enzimas superóxido dismutases (SODs) são a primeira linha de defesa contra esse radical. As SODs são metalo enzimas (EC 1.5.1.1) capazes de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. São classificadas de acordo com o metal incorporado na estrutura: cobre e zinco (CuZnSOD), ferro ou manganês (Fe/MnSOD) e níquel (NiSODs). Neste trabalho de mestrado, a enzima TbFeSODB2 de T.brucei foi, expressa, purificada, cristalizada e teve sua estrutura resolvida. A estrutura cristalográfica da enzima do parasita foi comparada com a enzima humana análoga contendo manganês (HuMnSOD), onde foram evidenciadas as principais diferenças entre as duas estruturas que podem ser exploradas para o desenho do novos inibidores seletivos. Foi realizada uma análise de acoplamento estatístico, onde com base em um alinhamento múltiplo dessas enzimas determinou-se resíduos que são capazes de interferir na seletividade do metal incorporado e estado oligomérico das SODs. / Sleeping sickness, caused by the parasite Tripanosoma brucei, is considered a neglected disease, killing thousands of people every year in subsaharian Africa. T. brucei does not generate a pronounced immune response, difficulting the development of vaccines. Furthermore, available medicines are scarce. Tripanosomatides are known to be sensitive to oxidative stress caused by the superoxide radical. Therefore, the superoxide dismutase enzymes (SODs) are a primary line of defence for the parasites against this radical. SODs are metalloenzymes (EC 1.5.1.1) capable of catalyzing superoxide dismutation into molecular oxygen and hydrogen peroxide. SODs are classified according to the incorporated metal: copper/zinc (CuZnSOD), iron/manganese (Fe or MnSOD) and nickel (NiSODs). In the work presented here, TbFeSODB2 from T. brucei was expressed, purified, crystallized and its 3D structure solved. The crystal structure of the parasite enzyme was compared to the homologous human enzyme containing manganese (HuMnSOD), revealing evidence for differences between both structures which could be exploited in the design of new selective inhibitors. In addition, a statistical coupling analysis was performed on the entire Fe/MnSOD superfamily, based on a multiple sequence alignment. It was shown that this technique was able to identify novel residue determinants of metal selectivity and oligomeric state.

OBJETIVOS: determinar a relação entre parâmetros de estresse oxidativo, gravidade de sepse e resposta ao tratamento com antioxidantes. MATERIAL E MÉTODOS: foram incluídos pacientes consecutivos admitidos na UTI de um hospital terciário com o diagnóstico de sepse, sepse grave ou choque séptico. Os pacientes foram avaliados diariamente e foi coletado sangue imediatamente após a inclusão no estudo (máximo de 12h após diagnóstico de sepse). Avaliou-se os níveis séricos de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), carbonilação de proteínas, atividade de superóxido dismutase (SOD) e catalase. Estas variáveis foram correlacionadas com desfecho e variáveis clínicas. Para determinar a relação dos parâmetros oxidativos na resposta ao tratamento, utilizamos o modelo de ligação cecal e perfuração (CLP) empregando ou não tratamento antioxidante (N-acetilcisteína mais deferoxamina). Coletou-se sangue da veia caudal 3h após a indução de sepse e correlacionou-se os parâmetros com resposta ao tratamento antibiótico e antioxidante. Para determinar se o tratamento antioxidante poderia ser retardado por 12h, em uma segunda amostra de animais coletou-se sangue da veia caudal e administrou-se ou não tratamento após 12h da indução de sepse. RESULTADOS: níveis elevados de proteínas carboniladas e de SOD no diagnóstico de sepse são relacionados com óbito por sepse nesta amostra. Estes parâmetros são correlacionados com a gravidade da doença avaliada pelos escores APACHE II e MODS. Níveis de atividade da SOD podem prever resposta ao tratamento com antioxidantes no modelo CLP, tanto 3 como 12h após a indução de sepse. CONCLUSÃO: Parâmetros oxidativos são associados com gravidade e desfecho de sepse em UTI geral, e podem prever resposta ao tratamento antioxidante em animas. / OBJECTIVE: determine the relationship between oxidative stress parameters, sepsis severity and treatment response to antioxidants. MATERIALS AND METHODS: were included consecutive patients admited on ICU at a tertiary care Hospital with sepsis, severe sepsis or septic shock. The patients were evaluated, blood samples were colected immediately after study inclusion (12h maximum after sepsis diagnosis). We determined plasma levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), protein carbonyls, superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and correlate it to clinical parameters. To determine the relation between oxidative parameters and response to antioxidant treatment we used the cecal ligation and perforation (CLP) model of sepsis, using or not antioxidants (n-acetyilcysteine plus deferoxamine) 3 or 12 hours after CLP. RESULTS: non-survivor septic patients presented higher protein carbonyls and SOD activity when compared to survivor patients. These parameters were correlated to APACHE II and MODS in our sample. In addition, plasma SOD levels predicted response to antioxidant treatment in the CLP model, both 3 and 12 houras after sepsis induction. CONCLUSION: Oxidative parameters are correlated to severity and outcome in septic patients and could predict response to antioxidant treatment in the CLP model.

A compreensão da fisiologia e dos mecanismos moleculares da sepse tem sido foco de muitos estudos. As infecções severas, como a sepse, são responsáveis por 10% do total de mortes registradas em Unidades de Tratamento Intensivo em todo o mundo. O desfecho da sepse ocorre devido a influência de fatores ambientais e genéticos, cuja expressão de variantes genéticas suportam ou não este desfecho. Muitos mecanismos estão envolvidos na sepse, incluindo a liberação de citocinas e a ativação de neutrófilos, de monócitos e de células endoteliais. Há associação entre superprodução de óxido nítrico, produção excessiva de radicais livres, depleção de antioxidantes, e déficit energético celular. Enzimas antioxidantes endógenas como a Superóxido Dismutase, a Glutationa Peroxidase e a Catalase protegem a célula do dano oxidativo. A enzima superóxido dismutase dependente de manganês é um potente antioxidante intracelular codificada por um gene (SOD2; 6q25-2) que tem sua expressão induzida por mediadores inflamatórios tais como interleucina 1, interleucina 4, interleucina 6, Fator de Necrose Tumoral – α, lipopolisacarídeos. O gene SOD2 apresenta um polimorfismo de mutação de base C47T no exon 2, o qual resulta na substituição do resíduo 16 (Ala16Val) pertencente ao peptídeo sinal da proteína. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito diferencial das variantes - 9Ala e -9Val da superóxido dismutase dependente de manganês sobre as células mononucleares de sangue periférico humano (in vitro) durante um processo infeccioso (induzido por lipopolisacarídeos), investigando sua implicação: (I) na produção de Espécies Reativas; (II) na atividade e imuno-conteúdo da Superóxido Dismutase dependente de Manganês; (III) na atividade e imuno- conteúdo da Catalase; (IV) na atividade e imunoconteúdo da Glutationa Peroxidase; (V) na produção de nitrotirosina; (VI) na produção de nitrito/nitrato; (VII) na liberação de Fator de Necrose Tumoral - α; (VIII) na produção de Carboximetil-lisina; (IX) dienos conjugados; (X) no imuno-conteúdo da Poli (ADP ribose) Polimerase; (XI) no imuno-conteúdo do Receptor de Produtos Avançados de Glicação; (XII) no imuno-conteúdo da Proteína de Choque Térmico; (XIII) no imuno-conteúdo do Fator Nuclear κB; (XIV) no dano ao DNA celular; (XV) na determinação das defesas antioxidantes totais não enzimáticas. Os resultados demonstraram que o polimorfismo Ala-9Val participa na regulação do ambiente redox celular, e que o alelo 47C permite que as células no estado basal (sem lipopolisacarídeos) respondam com mais eficiência ao estresse oxidativo celular. Este alelo apesar de produzir mais espécies reativas também aumenta o mecanismo de defesa antioxidante. Porém, quando em uma doença que produza estresse oxidativo, no caso a sepse, o alelo 47C torna o ambiente intracelular pró-oxidativo podendo agravar a condição celular. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo Ala-9Val é um alvo promissor para novos estudos com o objetivo de usar marcadores genéticos para direcionar a terapia necessária para cada paciente. / The understanding of the physiology and of molecular mechanisms of sepsis has been focus of many studies. The severe infections, as the sepsis, are responsible for 10% of total of deaths registered in Intensive Care Units all over the world. The outcome of sepsis happens due to influence of environmental and genetic factors, whose the expression of genetic variants supports or not this outcome. Many mechanisms are involved in sepsis, including the cytokines liberation and the neutrophils activation, of monocytes and of endothelial cells. There is association among overproduction of nitric oxide, excessive production of free radicals, depletion of antioxidants, and cellular energy deficit. Endogenous antioxidant enzymes as Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase and Catalase protect the cell of oxidative damage. The manganese superoxide dismutase enzyme it is a potent antioxidant intracellular codified by a gene (SOD2; 6q25-2) that has her expression induced by the inflammatory mediators such as interleukin 1, interleukin 4, interleukin 6, tumor necrosis factor – α, lipopolysaccharide. The SOD2 gene presents a single-nucleotide polymorphism C47T in the exon 2, which results in the substitution of the residue 16 (Ala16 Val) belonging to the signal peptide of the protein. The aim of this work was to study the differential effect of the variants -9Ala and -9Val of manganese superoxide dismutase on the Peripheral Blood Mononuclears Cells human (in vitro) during an infectious process (induced by lipopolysaccharide), investigating her implication: (I) in the production of Reactive Species; (II) in the activity and immunocontent of Manganese Superoxide Dismutase; (III) in the activity and immunocontent of Catalase; (IV) in the activity and immunocontent of Glutathione Peroxidase; (V) in the nitrotyrosine production; (VI) in the nitrite/nitrate production; (VII) in the production of tumor necrosis factor - α; (VIII) in the production of carboxymethyl lysine; (IX) conjugated dienos; (X) in the immunocontent of the Poly (ADP-ribose) Polymerase; (XI) in the immunocontent of the Receptor for Advanced Glycation Endproducts; (XII) in the immunocontent of Heat Shock Protein; (XIII) in the immunocontent of the Nuclear Factor kappa B; (XIV) in the damage to cellular DNA; (XV) in the determination of the non-enzymatic antioxidant cellular defenses. The results demonstrated that the polymorphism Ala-9Val it participates in the regulation of the cellular redox environment, and that the 47C allele allows that the cells in the basal state (without lipopolysaccharide) they answer with more efficiency to the stress oxidative cellular. This allele in spite of producing more RS also increases the mechanism of antioxidant defense. However when in a disease that produces oxidative stress, in the case the sepsis, the 47C allele turns intracellular environmental pro-oxidative could worsen the cellular condition. In summary, the data presented here suggest that the polymorphism Ala- 9Val is a promising target for new studies with the goal of using genetic markers to guide therapy required for each patient.