A emergência rápida e uniforme de plântulas em campo constituem pré-­ requisitos essenciais para o sucesso da produção comercial de sementes de hortaliças. Um dos principais problemas enfrentados por produtores de pimentão refere-­se à germinação lenta e estabelecimento de estande desuniforme, o que ressalta a importância do desenvolvimento de técnicas que visem aprimorar o desempenho de lotes de sementes. Com o objetivo de verificar a eficiência do condicionamento fisiológico de sementes de pimentão associado a biorreguladores sobre o potencial fisiológico das sementes, foi desenvolvida esta pesquisa utilizando dois cultivares, AF-6 e AF-7, representados por três e quatro lotes de sementes, respectivamente. Foram investigados possíveis efeitos do condicionamento com 24- epibrassinolídeo, ácido giberélico ou o bioestimulante Stimulate®. As sementes foram avaliadas quanto à germinação e vigor, incluindo observações de atividade enzimática das sementes e análises de parâmetros de crescimento de plântulas utilizando o software SVIS®. Por fim, o tratamento considerado promissor, condicionamento com 24-epibrassinolídeo na concentração de 10-8 M, foi avaliado quanto ao crescimento radicular das plantas, eficiência pela utilização do condicionamento em sistema de tambor, e comportamento das sementes durante o armazenamento. Diversos benefícios foram verificados após o condicionamento utilizando 24-epibrassinolídeo a 10-8 M, sobretudo a velocidade de germinação das sementes, atividade de enzimas antioxidantes e hidrolíticas, crescimento e uniformidade de desenvolvimento das plântulas. O condicionamento com 24- epibrassinolídeo a 10-8 M também favoreceu o desempenho dos lotes de sementes durante o armazenamento. A inclusão desse biorregulador no condicionamento em sistema de tambor é eficiente para o tratamento comercial de sementes de pimentão. / Rapid and uniform seedling emergence in field are essential for successful commercial production of vegetables. One of the main problems faced by bell pepper growers is the slow germination and uneven stand establishment, which highlights the importance of developing techniques that improve the performance of seed lots. In order to evaluate the efficiency of seed priming with bioregulators on physiological potential of bell pepper seeds, this research was developed using two cultivars, AF-6 and AF-7, represented by three and four seed lots, respectively. Possible effects of seed priming using 24-epibrassinolide were compared to gibberellic acid, and Stimulate®. Germination and vigor evaluations were carried out, including analysis of seed enzymatic activity and parameters of seedlings growth using the SVIS® software. At the end, the most promising treatment, seed priming with 24- epibrassinolide of 10-8 M was evaluated regarding to plant root growth, drum priming and seed performance during storage. Several benefits were verified after seed priming with 24-epibrassinolide, especially on germination speed, antioxidant and hydrolytic enzymes as well as seedling growth and uniformity development. Primed seeds with 24-epibrassinolide also showed better performance during seed storage. This bioregulador can be used during drum priming for commercial bell pepper seed treatment.

O estresse oxidativo, causado por níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio (ROS), pode causar danos celulares. Várias enzimas, como as subunidades da alquil-hidroperóxido redutase (AhpC e AhpF) e as superóxido dismutases (SOD), são responsáveis por remover as ROS. Os mecanismos de regulação da expressão gênica de C. crescentus para os genes ahpC, sodA, sodB e sodC, foram analisados com fusões de transcrição ao gene repórter lacZ, permitindo a quantificação da expressão por ensaios da atividade de b-galactosidase, e RT-PCR quantitativo. As culturas foram cultivadas em meio PYE ou M2 e a expressão de cada gene foi avaliada na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (tBOOH), paraquat, menadiona, pirogalol, FeSO4 ou DDPi. Em C. crescentus ahpC é induzido por peróxidos e regulado por OxyR. As SODs são induzidas principalmente por superóxidos, sodB e sodC possuem indução de fase na fase estacionária e possivelmente estão sob o controle do sigma J, enquanto o gene sodA é regulado por sigma F e sigma J. / Oxidative stress, caused by increased levels of reactive oxygen species, can lead to damage in all cellular components. Several enzymes, as subunit of alkyl hydroperoxide reductase (AhpC and AhpF) and superoxide dismutases (SOD), are responsible for removing ROS. Mechanisms of gene expression of C. crescentus for genes ahpC, sodA, sodB and sodC, were evaluated with transcription fusions with the lacZ reporter gene were constructed, allowing the quantification of expression by b-galactosidase activity assays, furthermore we analyze of the gene expression by qRT-PCR assay. The cultures were grown in PYE and M2 media, and gene expression was evaluated in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (tBOOH), paraquat, menadione, pyrogallol, FeSO4 or DPPi. In C. crescentus ahpC is induced by peroxides and is under the control of OxyR. The SODs are mainly induced by superoxide, sodB and sodC are induction in stationary phase and are possibly under the control of sigma J, while the sodA gene is regulated by sigma F and sigma J.

A grande demanda por proteína animal e a importância que a criação bovina exerce sobre a economia nacional, vêm exigindo eficientes sistemas de produção. A preservação e disseminação da genética do rebanho bovino dependem de biotecnologias como a criopreservação espermática, inseminação artificial e fertilização in vitro. No entanto, atualmente muito tem sido discutido sobre o uso da gema de ovo nos diluidores seminais. Pois apresentam variabilidade em sua composição e risco de contaminação microbiológica. Em contrapartida, apesar dos diluidores sintetizados com lecitina de soja não fornecerem esses riscos, seus resultados não são muito satisfatórios na criopreservação espermática bovina. Com base na hipótese de que a suplementação do diluidor seminal à base de lecitina de soja com antioxidantes, preserve as características das células espermáticas de maneira tão eficiente quanto à gema de ovo, o objetivo do presente experimento foi comparar o efeito do diluidor à base de gema de ovo com o diluidor à base de lecitina de soja (com e sem antioxidantes), sobre a manutenção da funcionalidade e fertilidade de amostras espermáticas bovinas criopreservadas. Para tal, foram utilizadas amostras seminais de 20 touros Brangus, cujas colheitas foram realizadas pelo método de eletroejaculação e as amostras foram diluídas em 4 grupos de diluidores: LElecitina de soja (sem a adição de antioxidantes); LAlecitina de soja suplementada com ácido ascórbico (AA, 4,5mM); LS lecitina de soja suplementada com superóxido dismutase (SOD, 60UI/mL) e GOgema de ovo (sem adição de antioxidantes). O sêmen foi então, criopreservado de maneira automatizada. As amostras foram descongeladas e analisadas quanto aos testes laboratoriais de motilidade computadorizada do espermatozóide (CASA); integridade de membrana plasmática (eosina/nigrosina); integridade de membrana acrossomal (fast Green/ rosa bengala); atividade citoquímica mitocondrial (DAB); susceptibilidade do DNA à desnaturação (SCSA); índice de estresse oxidativo induzido (TBARS). Além disso, foram realizados testes para verificar o potencial de fertilidade das amostras espermáticas criopreservadas. A fertilidade in vivo foi realizada pela técnica de inseminação artificial em tempo fixo (IATF), utilizando 450 fêmeas bovinas, seguido de exame ultrassonográfico para avaliação de prenhez. Teste de fertilidade in vitro, foi realizado pela técnica de produção in vitro de embriões (PIV) com o uso de ovários de frigoríficos, a classificação do desenvolvimento embrionário e a avaliação da motilidade espermática foram promovidas no decorrer do processo. Os resultados demonstraram que o diluidor LE apresentou efeito na proteção espermática de maneira semelhante ao diluidor GO. No entanto a suplementação desse primeiro com antioxidantes é uma alternativa para melhorar ainda mais esse processo, já que a taxa de prenhez obtida nos grupos LA e LS é satisfatória em um programa de IATF. Ainda o grupo LS foi o que apresentou melhores resultados no processo de PIV. Concluindo que o diluidor à base de lecitina de soja suplementado com o antioxidante superóxido dismutase seria uma opção para a substituição definitiva dos diluidores sintetizados com gema de ovo. / Due to the great demand for animal protein and the importance that bovine breeding exert on national economy, efficient production systems have been required. Cattle genetics preservation and dissemination depend on reproductive biotechnologies such as sperm cryopreservation, artificial insemination and in vitro fertilization. However, the use of egg yolk-based extender is under discussion nowadays, once there is great variability in its composition and risks of bacteriological contamination. On the other hand, despite soybean lecithin-based extenders do not present these risks, satisfactory results, after bovine sperm cryopreservation, have not been reached yet. Based on the hypothesis that soybean lecithinbased extender supplemented with antioxidants, preserve the sperm cell characteristics so efficient as egg yolk does, the aim of the present experiment was to compare the effects of egg yolk-based extender and soybean lecithin-based extender (with and without antioxidants), on functionality and fertility maintenance of bovine cryopreserved sperm samples. For this, seminal samples from 20 Brangus bulls were used, collects were realized by eletroejaculation method and samples were diluted in 4 extenders group: LE-soybean lecithin-based extender (without antioxidant supplementation); LA- soybean lecithin supplemented with ascorbic acid (AA, 4,5mM); LS- soybean lecithin supplemented with superoxide dismutase (SOD, 60UI/mL) and GO-egg yolk-based extender (without antioxidant supplementation). Then, semen was cryopreserved by automatic method. Samples were thawed and analyzed by laboratorial tests such as computer assisted semen analysis (CASA); plasma membrane integrity (eosin/nigrosin); acrosome membrane integrity (fast green/ rose bengal); mitochondrial cytochemical activity (DAB); susceptibility of chromatin denaturation (SCSA); induced oxidative stress index (TBARS). Furthermore, tests for fertility potential of cryopreserved semen samples were performed. In vivo fertility was accessed by timed artificial insemination (TAI), 450 bovine females were inseminated, and ultrasonographical exam was realized for pregnancy detection. In vitro fertility test was accessed by embryo in vitro production (IVP), ovaries from slaughterhouses were used, embryo development classification and sperm motility were promoted during the process. Results indicate that sperm protection is similar between LE and GO extenders. However the antioxidant supplementation of soybean lecithin-based extender is a great alternative to improve the process of sperm protection, since pregnancy rate of LA and LS groups was satisfactory for a TAI program. Besides, LS group presented the best results on IVP process. In conclusion, soybean lecithin-based extender supplemented with superoxide dismutase would be a better option for a definite replacement of egg yolk-based extender for sperm bovine cryopreservation.

Foi demonstrado o envolvimento das espécies reativas de oxigênio (ERO) na patogênese de algumas retroviroses, levando muitas vezes à progressão e/ou persistência das mesmas. No entanto, o papel das espécies reativas de oxigênio resultante da modulação do sistema antioxidante, e seu envolvimento na infecção de bovinos naturalmente infectados pelo VLEB, até o presente trabalho, não tinha sido ainda investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou-se avaliar o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo VLEB em bovinos naturalmente infectados, associado ou não ao estabelecimento da linfocitose persistente (LP). Assim, a avaliação do estresse oxidativo se deu pelo teor de malondialdeído, concentração de glutationa reduzida, atividade da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase, e pela atividade antioxidante total; e a resposta imune pela quantificação das subpopulações de linfócitos, função fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio de leuccitos polimorfonucleares, morte celular e proliferação linfocitária, além da avaliação hematológica e sorodiagnóstico da leucose enzoótica bovina (LEB). Os resultados do presente estudo apontaram para o envolvimento do estresse oxidativo na infecção pelo vírus da leucose enzoótica bovina, dado pela menor concentração de glutationa peroxidase e a tendência a menor atividade da superxido dismutase eritrocitárias nos animais infectados pelo VLEB, não podendo, contudo, ser associado à fase da infecção. Ademais, os marcadores de estresse oxidativo não apresentaram alterados nem sequer a atividade antioxidante total destes animais. Além disso, o presente trabalho apontou para menor proliferação de linfócitos e redução da apoptose de células CD5+ nos animais infectados pelo VLEB manifestando LP, corroborados pelo significante aumento da população de linfcitos B (CD21+), e dos principais co-marcadores das células infectadas, no caso células CD5+ e CD11b+, nestes animais. No entanto, não observou diferenças significativas na população de linfócitos T destes animais, nem sequer alteração da capacidade fagocítica e produção intracelular de peróxido de hidrogênio pela população de leucócitos polimorfonucleares nos animais infectados. / Abundant observations of multiple pathogenic interactions between reactive oxygen species (ROS) and the pathogenesis of some retroviruses have drawn attention to role of ROS on disease progression and/or persistence of infection. Therefore, the role of the oxidative stress resulted from the modulation of the antioxidant system in dairy cows naturally infected with BLV has not been studied yet. So, the present study tries to investigate the involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV associated or not with the persistent lymphocytosis (PL). Thus, the oxidative stress was evaluated by the malondialdehyde, reduced glutathione content, and by the activity of glutathione peroxidase and superoxide dismutase, and also total antioxidant activity. The immune response was also evaluated by the quantification of lymphocyte subsets, lymphocyte proliferation, polymorfonuclear leukocytes phagocytosis and intracellular hydrogen peroxide production, and cell death. The results of the present work point out to an involvement of oxidative stress in dairy cows naturally infected with BLV, given by a lower glutathione peroxidase activity and also a tendency towards lower superoxide dismutase activity, but it can be not associated with PL. Futhermore, the oxidative stress markers and also the total antioxidant status was not altered in infected animals. The present study also showed a lower lymphocyte proliferarion and apoptosis rates of CD5+ cells, strengthen by a higher B cells (CD21+) counts and also by a significant augment of CD5+ and CD11b+ positive cells that are often co-expressed by the infected cells. Although, no significant difference was observed in T cells counts. Moreover, the phagocytosis rates and the intracellular hydrogen peroxide production by the polymorphonuclear leukocytes are not altered in BLV infected dairy cows.

Embora a citricultura seja uma importante atividade econômica no Brasil, nos últimos anos houve uma redução significativa da produção nacional. A baixa rentabilidade que o setor citrícola vem enfrentando, devido ao alto custo de produção, é decorrente principalmente dos problemas fitossanitários, com destaque para as doenças, que afetam diretamente a produtividade dos pomares. Atualmente, o huanglongbing (HLB) é a doença mais grave que afeta a citricultura mundial, sendo que os danos são severos em todas as variedades de citros. Diante desse fato, a transformação genética de plantas é uma alternativa para a obtenção de plantas transgênicas, com genes que estimulem o sistema de defesa das plantas, tornando-as resistentes a doenças. Apesar da eficácia dos protocolos existentes para a transformação genética de citros, uma desvantagem característica de plantas perenes é o ciclo reprodutivo lento, tornando difícil e demorado a validação de novos genes de interesse. Por isso, uma importante estratégia é o uso de plantas modelos, como o tomateiro, que possui ciclo curto e boa eficiência de transformação genética. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' e Citrus sinensis, contendo a construção gênica com o gene Csd1 (superóxido dismutase do cobre e do zinco), isolado de Poncirus trifoliata. A proteína codificada pelo gene Csd1, também conhecido como Sod1 (superoxide dismutase 1), é o mais potente antioxidante na natureza e é um importante constituinte de defesa celular contra o estresse oxidativo causado pela infecção bacteriana. O tomateiro Micro-tom foi utilizado como modelo de patogenicidade para validação do gene. Porém, devido a sua baixa eficiência de transformação genética, os experimentos de inoculação com o patógeno não foram realizados. Posteriormente, a caracterização da função do gene Csd1 em relação ao HLB será realizada com as plantas transgênicas de citros. A identificação de plantas transgênicas, de tomate e de laranja doce, foi realizada por meio da análise de PCR, utilizando primers para a detecção do gene Csd1. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A eficiência de transformação genética do tomateiro \'Micro-Tom\' e das cultivares de laranja doce, \'Hamlin\' e \'Pineapple\', foram respectivamente: 0,34%, 4,74% e 3,65%. A caracterização molecular pelas análises de Southern blot e RT-qPCR foi realizada apenas em plantas de citros. Foi possível confirmar a integração do transgene em 32 eventos obtidos. O número de eventos de inserção variou de 1 - 5, sendo a presença do gene endógeno Csd1, localizada em 3 locais distintos no genoma das plantas. O nível de mRNA do transgene foi verificada em 21 plantas que tiveram apenas uma única inserção do transgene no genoma. Os resultados obtidos mostram que houve transcrição do gene Csd1 nas plantas transgênicas, assim como, na testemunha não transgênica. A relação do nível de transcrição do transgene com a resistência das plantas ao patógeno será definida após a inoculação com Candidadus Liberibacter. / Although the citrus industry is an important economic activity in Brazil, in recent years there has been a significant reduction in the national citrus production. The low profitability of the citrus sector has faced due to the high production cost is mainly attributed to phytosanitary problems, particularly diseases that directly affect productivity of orchards. Currently, huanglongbing (HLB) is the most serious disease that affects the global citrus industry and the damage is severe in all citrus varieties. Genetic transformation of plants is an alternative to obtain transgenic plants with genes that stimulate the plant defense system, making it resistant to diseases. Despite the effectiveness of protocols for genetic transformation of citrus, a characteristic disadvantage of perennial plants is the slow reproductive cycle, hindering validation of new genes of interest. Therefore, an important strategy is the use of model plants, such as the tomato, which has a short cycle and good genetic transformation efficiency. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \"Micro-Tom \'and Citrus sinensis, containing the gene construct with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata. The protein encoded by the gene Csd1, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), is the most powerful antioxidant in nature and is important constituent of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. \'Micro-tom\' tomato was used as a model for pathogenic gene validation. However, due to its low efficiency of genetic transformation, the inoculation experiments with the pathogen were not realized. Posteriorly, the characterization of gene function Csd1 in relation to the HLB disease will be realize with citrus transgenic plants. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' and of Citrus sinensis, containing the gene construction with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata, for validation and for future study of this gene for resistance to HLB. Proteins encoded by the Csd1 gene, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), are the most powerful antioxidants in nature and are important constituents of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. The identification of transgenic plants of tomato and sweet orange was performed by the PCR analysis using primers for the detection of Csd1 gene. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to a greenhouse. The genetic transformation efficiency of tomato \'Micro-Tom\' and sweet orange cultivars, \'Hamlin\' and \'Pineapple\', were 0.34%, 4.74% and 3.65%, respectively. The molecular characterization with the Southern blot and RT-qPCR analyses was performed only in citrus plants. The transgene integration was confirmed in 32 plants. The number of insertion events ranged from 1-5 and the presence of Csd1 endogenous gene is found in three distinct locations in the plants genome. The mRNA level of the transgene was verified in 21 plants that had only a single transgene insertion into the plant genome. The results show that there was transcription of Csd1 gene in transgenic plants as well as in non-transgenic plants. The relation between the transgene transcript level with the resistance of plants to pathogens is set after inoculation with Candidadus Liberibacter.

O consumo crônico de etanol acarreta alterações significativas das funções cardíaca e circulatória, figurando como um importante fator de risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como por exemplo a hipertensão arterial. O passo inicial para a disfunção cardiovascular associada ao etanol envolve a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), sendo esse processo mediado pela enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidase. Baseado nestas observações, a hipótese do estudo é a de que o consumo de etanol aumente a pressão arterial, a geração de ERO e induza a ativação de vias de sinalização redox sensíveis na vasculatura via NADPH oxidase. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a participação da NADPH no aumento da pressão arterial e estresse oxidativo vascular induzidos pelo consumo crônico de etanol através de sua inibição pela apocinina. O trabalho demonstrou pela primeira vez o envolvimento do estresse oxidativo via ERO geradas pela NADPH oxidase no aumento da pressão arterial induzida pelo consumo crônico de etanol. Houve aumento da contração induzida por fenilefrina em anéis de aorta com e sem endotélio de animais tratados com etanol e foi demonstrada a participação das ERO geradas pela NADPH oxidase nesta resposta, uma vez que o tratamento com apocinina promoveu diminuição da contração observada. O tratamento com etanol aumentou a geração de ERO em tecido aórtico via NADPH oxidase, reduziu a biodisponibilidade de NO plasmático e tecidual e promoveu peroxidação lipídica, visto pela elevação dos níveis de TBARS. Também foi demonstrado que a enzima NADPH oxidase está envolvida no aumento da expressão protéica da PKC ? e SAPK/JNK induzido pelo etanol, e que o tratamento com etanol é capaz de diminuir a atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) e aumentar a expressão protéica especificamente da SOD2, possível resposta adaptativa ao aumento de geração de O2- via NADPH oxidase pelo etanol. Houve aumento da expressão protéica da nNOS em aorta de animais tratados com etanol, sendo esta, uma possível resposta adaptativa intrínseca às alterações promovidas pelo aumento da pressão arterial nestes animais. O tratamento com etanol não alterou os níveis aórticos de peróxido de hidrogênio (H2O2), glutationa reduzida (GSH) e atividades enzimáticas da xantina oxidase (XO), superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Além disso, a partir da avaliação da translocação citosol/membrana das subunidades organizadoras p47phox e Nox organizer 1 (Noxo1) e expressão protéica das subunidades catalíticas da NADPH oxidase, Nox1, Nox2 e Nox4, foi possível concluir que o aumento da expressão da Nox1 possui importante papel na modulação da geração de ERO pelo etanol, podendo participar do aumento da pressão arterial e estresse oxidativo sistêmico e vascular gerados. Portanto, a partir dos resultados obtidos, o estudo demonstrou que o consumo crônico de etanol induz o aumento da produção de ERO, resposta implicada no aumento da pressão arterial observado nos animais tratados com etanol. Além disso, o trabalho evidencia a participação da enzima Nox1/NADPH oxidase neste processo, uma vez que houve aumento da expressão protéica dessa subunidade catalítica na aorta dos animais tratados com etanol / Chronic ethanol consumption results in significant alterations in cardiac and circulatory functions, appearing as an important risk factor responsible for cardiovascular diseases such as hypertension. The initial step for cardiovascular dysfunction associated with ethanol consumption involves the generation of reactive oxygen species (ROS) and reduced bioavailability of nitric oxide (NO), processes mediated by the enzyme nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase. Based on the mentioned observations we hypothesized that ethanol consumption increases blood pressure, ROS generation and induces activation of redox-sensitive signaling pathways in the vasculature through NADPH oxidase. Thus, here we investigated the contribution of NADPH oxidase in chronic ethanol consumption-induced hypertension and vascular oxidative stress through its inhibition by apocynin. This study demonstrated for the first time the involvement of oxidative stress via ROS derived from NADPH oxidase in increased blood pressure induced by chronic ethanol intake. The increased contractility of endothelium-intact and endothelium-denuded aortic rings from ethanol-treated rats to phenylephrine was prevented by apocynin. Ethanol consumption increased systemic and vascular oxidative stress and apocynin prevented these responses. The decrease on plasma and vascular nitrate/nitrite (NOx) levels induced by ethanol were not prevented by apocynin. Treatment with ethanol did not affect aortic levels of hydrogen peroxide (H2O2) and reduced glutathione (GSH) as well as the activity of xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). Ethanol-induced increased protein expression of Nox1, PKC?, nNOS, SAPK/JNK and SOD2 in the rat aorta was prevented by apocynin. No difference on the aortic expression of Nox2, Nox4, p47phox, Nox organizer 1 (Noxo1), eNOS and iNOS was detected after treatment with ethanol. Ethanol treatment did not alter the phosphorylation of SAPK/JNK, p38MAPK, ERK1/2, c-Src, Rac1 or PKC?. The major new finding of our study is that the increased vascular generation of reactive oxygen species (ROS) induced by ethanol is related to the increased vascular Nox1/NADPH oxidase expression. This mechanism is involved on the vascular dysfunction and hypertension induced by ethanol. Additionally, we conclude that ethanol consumption induces the expression of different proteins that regulate vascular contraction and growth and that NADPH oxidase-derived ROS play a role in such response

Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil) e outros nitróxidos cíclicos reduzem a injúria tecidual em modelos animais de inflamação por mecanismos que não são completamente entendidos. A mieloperoxidase (MPO) tem um papel fundamental na produção de oxidantes por neutrófilos e, portanto, é um importante alvo para anti-inflamatórios. Ao amplificar o potencial oxidativo do H2O2, a MPO produz HOCl e radicais livres através de seus intermediários oxidantes MPO-I [MPO-porfirina•+-Fe(IV)=O] e MPO-II [MPO-porfirina-Fe(IV)=O]. Esses fatos nos levaram a sintetizar e avaliar a capacidade inibitória sobre a atividade clorinante da MPO in vitro e in vivo do tempol e de três derivados hidrofóbicos substituídos na posição 4 do anel piperidina [(4-azido, 4-benzenosulfonil e 4-(4-fenil-1H-1,2,3-triazol-1-il)]. In vitro, todos os nitróxidos inibiram a clorinação da taurina mediada pela MPO a pH 7,4 com valores similares de IC50 (1,5-1,8 µM). As constantes cinéticas das reações do tempol com MPO-I (k = 3,5 x 105 M-1 s-1) e MPO-II, cuja cinética indicou um comportamento de saturação (K= 2,0 x 10-5 M; k = 3,6 x 10-2 s-1), foram determinadas. Modelagens cinéticas indicaram que, em presença de taurina, MPO não produz HOCl livre. Tomados conjuntamente, os resultados indicaram que o tempol age principalmente como um inibidor reversível da MPO por levar ao acúmulo de MPO-II e de complexo [MPO-II-tempol] que não participam do ciclo clorinante. Para examinar se nitróxidos inibem a atividade da MPO in vivo selecionamos como modelo a inflamação aguda induzida pela carragenina na pata de ratos. A atenuação da inflamação na pata mostrou correlação com a lipofilicidade do nitróxido em tempos iniciais, mas as diferenças nos efeitos foram pequenas (menor que 2 vezes) quando comparadas com as diferenças de lipofilicidade (maior que 200 vezes). Nenhuma inibição da atividade da MPO foi evidente in vivo porque os níveis de atividade nas patas dos ratos correlacionaram com os níveis de MPO. Do mesmo modo, em animais não-tratados ou tratados com nitróxidos, todos os parâmetros empregados para monitorar a inflamação (edema, níveis de proteínas oxidadas e nitradas e exsudação plasmática) correlacionaram com os níveis de MPO. Os efeitos dos nitróxidos in vivo foram também comparados com aqueles da hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (ABAH) e da colchicina. Tomados conjuntamente, os estudos in vivo indicaram que os nitróxidos atenuam a inflamação induzida pela carragenina principalmente por inibirem a migração celular. De acordo com essa conclusão, estudos in vivo, mostraram que tempol diminuiu a migração de neutrófilos humanos e de cultura (HL-60 diferenciadas em neutrófilos) ativados com PMA ou fMLP com IC50 25 µM. Nesse caso, a polimerização da actina é inibida apenas quando as células são pré-incubadas com tempol por 30 min. Nesse intervalo de tempo, o tratamento com tempol promove a formação de O2•- via flavoenzimas de maneira dependente da concentração. Subsequente ativação dos neutrófilos de cultura com PMA resulta também em produção intracelular de O2•- e H2O2 que é inibida pelo pré-tratamento com tempol (IC50 = 38 µM). Esses estudos preliminares sugerem que o tempol interfere na migração celular de neutrófilos por atenuar a formação intracelular de ROS. A importância da atividade peroxidásica da superóxido dismutase (hSOD1) in vivo é certamente muito mais restrita do que a da MPO em processos inflamatórios no geral. Todavia, essa atividade peroxidásica da hSOD1 pode ter um papel na na patogenia da esclerose lateral amiotrófica (ELA). Por essa razão, os efeitos do tempol sobre as consequências da atividade peroxidásica da hSOD1 (oxidação, dimerização, desenovelamento e agregação da enzima) também foram examinadas. Foi demonstrado que o tempol não interfere no ciclo catalítico da hSOD1, porém, inibe a dimerização da enzima, protegendo-a de desenovelamento e agregação. O nitróxido foi consumido no processo reagindo com o radical triptofanila no peptídeo 31VWGSIK36 como comprovado por MS. No conjunto, nossos estudos contribuem para esclarecer os múltiplos mecanismos pelos quais nitróxidos podem inibir processos oxidativos e inflamatórios. / Tempol (4-hydroxy-2 ,2,6,6-tetramethyl piperidine-1-oxyl) and other cyclic nitroxides reduce tissue injury in animal models of inflammation by mechanisms that are not fully understood. Myeloperoxidase (MPO) plays a key role in the production of oxidants by neutrophils and therefore is an important target for anti-inflammatory drugs. By amplifying the oxidative potential of H2O2, MPO produces HOCl and free radicals through its oxidizing intermediates MPO-I [MPO-porphyrin•+-Fe (IV)=O] and MPO-II [MPO-porphyrin-Fe (IV)=O]. In this context, we synthesized tempol and three more hydrophobic derivatives substituted in position 4 of the piperidine ring [(4-azido-4 benzenesulfonyl and 4-(4-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)] and evaluated their ability to inhibit the chlorinating activity of MPO in vitro and in vivo. In vitro, all the nitroxides inhibited the chlorination of taurine mediated by MPO at pH 7.4 with similar IC50 values (1.5 to 1.8 µM). The kinetic constants of the reactions of tempol with MPO-I (k = 3.5 x 105 M-1 s-1) and MPO-II, whose kinetic indicated a saturation behavior (K = 2.0 x 10-5 M; k = 3.6 x 10-2 s-1), were determined. Kinetic modeling indicated that in the presence of taurine, MPO does not produce free HOCl. Taken together, the results indicated that tempol acts primarily as a reversible inhibitor of MPO leading to accumulation of MPO-II and of the complex [MPO-II-tempol], which do not participate within chlorinating cycle. To examine whether nitroxides inhibit the activity of MPO in vivo, the acute inflammation induced by carrageenan in the rat paw was selected as model. The attenuation of inflammation in paws was correlated with the lipophilicity of the nitroxide in early times, but the differences in effects were small (less than 2-fold) when compared to the differences in lipophilicity (higher than 200 times). No inhibition of MPO activity was evident because the levels of activity in rat paws correlated with the levels of MPO. Similarly, in animals not treated or treated with nitroxides, all parameters used to monitor inflammation (swelling, levels of oxidized and nitrated proteins and plasma exudation) correlated with the levels of MPO. The effects of nitroxides in vitro were also compared with those of 4-aminobenzoic acid hydrazide (ABAH) and colchicine. Taken together, the in vivo studies indicated that nitroxides attenuate carrageenan-induced inflammation mainly by inhibiting cell migration. According to this conclusion, in vitro studies showed that tempol decreased migration of human and culture neutrophils (HL-60 differentiation to neutrophils) activated with PMA or fMLP with IC50 = 25 µM. In this case, actin polymerization is inhibited only when cells are preincubated with tempol for 30 min. During this time interval, treatment with tempol promotes the formation of O2•- via flavoenzymes in a concentration-dependent manner. Subsequent activation of culture neutrophils with PMA also results in intracellular production of O2•- and H2O2, which is inhibited by pretreatment with tempol (IC50 = 38 µM). These preliminary studies suggest that tempol interfere in neutrophil chemotaxis by attenuating the formation of intracellular ROS. The relevance of the peroxidase activity of superoxide dismutase (hSOD1) in vitro is certainly much narrower than that of MPO. Nevertheless, this peroxidase activity may have a role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, the effects of tempol on the consequences of the hSOD1 peroxidase activity (oxidation, dimerization, unfolding and aggregation of the enzyme) were also examined. Tempol inhibited the dimerization of hSOD1, protecting it from unfolding and aggregation, but not interfered in its catalytic cycle. The nitroxide was consumed in the process by reacting with the tryptophanyl radical of the segment 31VWGSIK36 as evidenced by MS. Overall, our studies contribute to clarify the multiple mechanisms by which nitroxides can inhibit oxidative and inflammatory processes.

Aldeídos de colesterol (Secosterol A e Secosterol B) têm sido detectados em amostras de cérebro humano e investigados em modelos de doenças neurodegenerativas como possíveis marcadores e intermediários do processo patológico. Estes oxisteróis constituem uma classe de eletrófilos derivados de lipídeos que podem modificar e induzir agregação de proteínas. A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é um distúrbio neurodegenerativo associado ao acúmulo de agregados imunorreativos de superóxido dismutase (Cu, Zn-SOD, SOD1). O objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de aldeídos de colesterol em ratos modelo ELA e sua capacidade de induzir a formação de agregados de SOD1 in vitro. Aldeídos de colesterol foram analisados no plasma, medula espinhal e córtex motor de ratos ELA. Uma quantidade elevada de Secosterol B foi detectada no córtex motor desses ratos em comparação com animais controle. Adicionalmente, os experimentos in vitro mostraram que Secosterol B e Secosterol A induziram a agregação da SOD1 em uma forma amiloidogênica que se liga à tioflavina T. Esta agregação não foi observada com o colesterol e os seus hidroperóxidos. Usando aldeídos de colesterol marcados com grupo alquinil e um ensaio de click chemistry, foi observado que os agregados de SOD1 estão ligados covalentemente aos aldeídos. A modificação covalente da proteína foi confirmada por análise de MALDI-TOF, que mostrou a adição de até cinco moléculas de aldeídos de colesterol à proteína por base de Schiff. Curiosamente, a análise comparativa com outros eletrófilos derivados de lipídeos (e.g. HHE e HNE) demonstrou que a agregação de SOD1 aumentou proporcionalmente à hidrofobicidade dos aldeídos, observando-se a maioragregação com aldeídos de colesterol. Os sítios de modificação da SOD1 foram caracterizados por nanoLC-MS/MS após digestão da proteína com tripsina, onde foram identificadas lisinas como o principal aminoácido modificado. Em geral, nossos dados mostram que a oxidação do colesterol que leva à produção de aldeídos de colesterol é aumentada no cérebro de ratos ELA e que os aldeídos altamente hidrofóbicos derivados de colesterol podem promover eficientemente modificação e agregação de SOD1. / Secosterol aldehydes (Secosterol B and Secosterol A) have been detected in human brain samples and investigated in models of neurodegenerative diseases as possible markers and intermediates of the pathological process. These oxysterols constitute a class of lipid-derived electrophiles that can modify and induce aggregation of proteins. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder associated with the accumulation of immunoreactive aggregates of superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD, SOD1). The objective of this work is to evaluate the presence of secosterol aldehydes in ALS rats and their ability to induce formation of SOD1 aggregates in vitro. Secosterol aldehydes were analyzed in plasma, spinal cord and motor cortex of ALS rats. A higher amount of Secosterol B was detected in the motor cortex of these rats compared to control animals. In addition, in vitro experiments have shown that Secosterol B and Secosterol A induce aggregation of SOD1 into an amyloidogenic form that binds to thioflavin T. This aggregation was not apparent in incubations with cholesterol and its hydroperoxides. Using alkynyl-labeled secosterol aldehydes and a click chemistry assay, it was found that the SOD1 aggregates are covalently linked to the aldehydes. Covalent modification of the protein was confirmed by MALDI-TOF analysis, which showed the addition of up to five molecules of secosterol aldehydes to the protein by Schiff base formation. Interestingly, the comparative analysis with other lipid-derived electrophiles (e.g. HHE and HNE) demonstrated that the aggregation of SOD1 increased according to the hydrophobicity of the aldehydes. Compared to the other electrophiles, a higher SOD1 aggregation was observed with secosterol aldehydes. SOD1 modification sites were characterized by nanoLC-MS/MS afterprotein digestion with trypsin, revealing lysine as the major amino acid modified in these experiments. Collectively, our data show that cholesterol oxidation leads to the production of secosterol aldehydes, which are increased in the brain of ALS rats, and that these highly hydrophobic aldehydes can efficiently promote the modification and aggregation of SOD1.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Gravina.pdf: 2149838 bytes, checksum: e6a1a4c198175fce83c0ce2c98c81a23 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Microorganisms are essential components in the maintenance of biogeochemical cycles and ecosystems. In agricultural environments, continuous use of herbicides to minimize the loss in productivity could damage growth inibition of micro-organisms. One cause of this inhibition is increased production of ROS (reactive oxygen species), such as superoxide radicals (O2 -) and hydroxyl (OH-) and hydrogen peroxide (H2O2), causing oxidative stress. The magnitude of this stress can be conditioned by the chemical group and mode of action of the herbicide. The cell responses against ROS involve an increase in the expression of enzymes such as superoxide dismutase and catalase, responsible for the dismutation of O2- and H2O2, respectively. The objective of this study was to evaluate the relationship between the effect of herbicides with different modes of action and answers of superoxide dismutase (SOD) isoenzymes in the bacterium Escherichia coli K-12 bacteria. For this, 2,4-D, paraquat and atrazine herbicides were used, and knockout strains of E. coli K-12 strains carrying mutations in the gene encoding Mn-SOD (sodA) and Fe-SOD (sodB). Herbicides were shown to be capable of promoting the imbalance of redox potential, increasing the production of H2O2 and malondialdehyde (MDA) above the rates observed in controls and differently between strains. Exposed to paraquat, which indices in vivo redox cycling, strains of E. coli wt and ΔsodB showed increased production of H2O2, and increase in the Mn-SOD activity, probably as a result from activation of the SoxR, which promotes the transcription of the gene sodA. In ΔsodA, the toxicity rates with paraquat were not higher than the control, indicating a possible regulation of the Fe-SOD expression by OxyR transcriptional factor. Our results indicated that deletion of genes encoding SOD enzymes originated patterns of antioxidative responses, according to the tested periods of time, regardless the herbicides. To ΔsodB, the damage was minor in time 9pm; but in ΔsodA, the damage was minor in time 5pm, demonstrating the important role of these genes in the defense against oxidative stress in different stages of growth. Cellular responses demonstrated despite the observed toxicity indices, the strains were able to grow at rates close to those verified in control, including an increase in the fitness value in ΔsodA, which indicates a wide plasticity of responses, and a potential for a quick fitting of E. coli K-12. Extending this hypothesis, considering an environment containing a toxic molecule, such as an herbicide, and a bacterium having a polymorphic system for SOD, if a mutation appears in a gene coding for isoforms, it may show an increase in cell viability and still maintain a functional antioxidative enzyme. We suggest that E. coli K-12, a strain created in a laboratory, and with probably low survivability in a natural environment, developed mechanisms of in vitro herbicide tolerance, even without previous selection. This phenotypic plasticity model might be found in other bacteria of agricultural land, with high turnover of cultures and intense use of herbicides, which could cause a considerable impact on the diversity and functionality of soil microbiota. / Microrganismos representam componentes essenciais na manutenção dos ciclos biogeoquímicos e de ecossistemas. Em ambientes agrícolas, o uso contínuo de herbicidas para minimizar a perda na produtividade pode acarretar danos inibindo o crescimento em microrganismos. Uma das causas desta inibição é o aumento da produção de ERO (espécies reativas de oxigênio), como os radicais superóxido (O2-) e hidroxila (OH-), e o peróxido de hidrogênio (H2O2), causando estresse oxidativo. A magnitude deste estresse pode ser condicionada pelo grupo químico e pelo modo de ação do herbicida. As respostas celulares contra ERO envolvem o aumento na expressão de enzimas como superóxido dismutase e catalase, responsáveis pela dismutação de O2- e H2O2, respectivamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre o efeito de herbicidas com diferentes modos de ação e as respostas das isoenzimas de superóxido dismutase (SOD) na bactéria Escherichia coli K-12. Assim, foram utilizados os herbicidas 2,4-D, atrazina e paraquat, e linhagens mutantes de E. coli K-12 nocauteadas para os genes codificantes das enzimas Mn-SOD (sodA) e Fe-SOD (sodB). Os herbicidas mostraram-se capazes de promover o desequilíbrio do potencial redox, aumentando a produção de H2O2 e malondialdeido (MDA), acima das taxas observadas nos controles e de forma distinta entre as linhagens. Expostas ao paraquat, o qual origina ciclismo redox in vivo, as linhagens de E. coli wt e ΔsodB apresentaram aumento na produção de H2O2, além de aumento na atividade de Mn-SOD, provavelmente como consequência da ativação do SoxR, o qual promove a transcrição do gene sodA. Em ΔsodA, os índices de toxicidade com o paraquat não foram maiores que o controle, indicando uma possível regulação da expressão da enzima Fe-SOD pelo fator transcricional OxyR. Nossos resultados indicaram que a deleção dos genes codificantes para SOD provocaram padrões nas respostas antioxidativas, de acordo com os tempos testados, independentemente dos herbicidas. Para ΔsodB, os danos foram menores no tempo de 9h; já em ΔsodA, os danos foram menores no tempo de 5h, demonstrando a importância do papel destes genes na defesa contra o estresse oxidativo em diferentes fases de crescimento. As respostas celulares demonstraram que, apesar dos índices de toxicidade observados, as linhagens foram capazes de crescer em taxas próximas às verificadas no controle, incluindo ainda um aumento do valor adaptativo em ΔsodA, o que indica uma plasticidade ampla de respostas e um potencial de adaptação rápida. Ampliando esta hipótese, considerando um ambiente contendo uma molécula tóxica, e uma bactéria que possua um sistema polimórfico para SOD, caso ocorra uma mutação no gene para uma de suas isoformas, ela poderá aumentar a viabilidade celular e ainda manter uma enzima antioxidativa funcional. Sugere-se que E. coli K-12, uma linhagem desenvolvida em laboratório e provavelmente com baixa capacidade de sobrevivência em ambiente natural, apresenta mecanismos de tolerância in vitro a herbicidas, mesmo sem seleção prévia. Tal modelo de plasticidade fenotípica poderia ser encontrado em outras bactérias de solo agrícola com alta rotatividade de culturas e intenso uso de herbicidas, podendo causar um impacto considerável na diversidade e funcionalidade desta microbiota.

Este trabalho consistiu de estudos da viabilidade da geração e identificação de radicais livres envolvidos em processos oxidativos avançados por via eletroquímica. Para a geração e identificação de radicais livres em eletrodos modificados com organotióis via eletroquímica, escolheu-se uma técnica pouco aplicada para este fim; a espectroscopia de impedância eletroquímica, e o ajuste dos dados experimentais pela proposta de modelos de circuitos equivalentes. O eletrodo de trabalho utilizado (Au) foi caracterizado em meio ácido e básico e diversas monocamadas auto-organizadas conhecidas foram adsorvidas sobre o mesmo e também caracterizadas por esta técnica. Parâmetros importantes como constante dielétrica, capacitância de uma monocamada livre de defeitos e grau de recobrimento foram determinados com êxito. Também foram empregadas moléculas menos utilizadas como modificadoras de eletrodos (fenotiazinas e derivados). As mesmas foram caracterizadas no sistema Au/adsorvente/NaOH, pois, o pH alto garante a formação do radical superóxido e do ânion hidroperóxido. Os mesmos modelos de circuitos equivalentes puderam ser empregados na obtenção dos parâmetros físicos relativos a essas moléculas no sistema eletroquímico utilizado. Em uma etapa subsequente obteve-se a valiosa informação, se as moléculas adsorvidas sobre Au poderiam ser usadas para a geração de superóxido e outros radicais. As monocamadas de tióis, quando utilizadas para gerar radicais livres, se mostraram aptas a gerar superóxido em meio alcalino saturado com oxigênio molecular. Como se demonstrou na etapa de caracterização, as SAM-3 e SAM-6 não formaram um empacotamento totalmente hidrofóbico. Por este motivo, mesmo que superóxido tenha sido gerado, não pôde ser detectado. Já para a fenotiazina e seu metil-derivado, a cinética de adsorção e a utilização de soluções aquosas impediram a formação de um filme completo e homogêneo, imprescindível para a constituição de uma interface hidrofóbica e isolante. Além disso, possíveis reações de complexação entre as moléculas e superóxido, reações entre a fenotiazina cátion-radical e superóxido fazem necessários mais estudos acerca da natureza eletroquímica do sistema, que já é bastante conhecido fotoquimicamente. Posterior a modificação, todos os eletrodos se mostraram ser bastante sensíveis ao pH e aos eletrólitos utlizados, alterando-se a estrutura interna muito facilmente, o qual implica uma limitação no tempo de uso e reprodutibilidade quando da geração de um radical tão reativo quanto superóxido. / This work consisted in testing the viability of investigations into the electrochemical generation and identification of free radicals involved in advanced oxidative processes. In these studies, a technique which is rarely used for the electrochemical generation and identification of free radicals at organothiole-modified electrodes, electrochemical impedancy spectroscopy, was chosen and the experimental data obtained were fitted by equivalent circuit models. A working electrode (Au) was characterized in both acidic and basic media and several known self-assembled monolayers were adsorbed over this electrode and also characterized using this technique. Important parameters such as dielectric constants, capacitance of the monolayers free of defects and coverage were determined with success. Other lesser-known molecules such as phenothiazines and their derivatives were also used .The modified electrodes were characterized in NaOH solution, since the high pH assures the production of superoxide radicals and hydroperoxylate anions. The equivalent circuit model was employed to obtain physical parameters for these molecules in the electrochemical systems studied. In a subsequent step, a valuable piece of information was obtained; it was noted that the molecules adsorbed over Au could be used in order to generate superoxide and other radicals. The ability of thiol monolayers used in the generation of free radicals, to produce superoxides in alkaline media saturated with molecular oxygen was demonstrated. However, characterization of the self-assembled monolayers, SAM-3 and SAM-6, revealed that these were not able to pack in a completely hydrophobic manner. This may account for the fact that the superoxide could not be detected even when it was believed to have formed. For the phenothiazine-modified electrodes, the adsorption kinetics and the utilization of aqueous solutions prevented the formation of an intact and homogeneous film, which is essential in establishing a hydrophobic and isolating interface. Furthermore, possible complexation reactions between the molecules and the superoxide and reactions between the phenothiazine cation-radical and superoxide, point to the need for further studies regarding the electrochemical nature of this system, whose photochemical properties are very well known. Following modification, all the electrodes were shown to be too sensitive to pH and to the electrolytes used, since the inner structure was easily modified, which implies that they would have a limited time of use and in addition that the reproducibility of the rate of generation of reactive radical species such as superoxides could be compromised.