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Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer au pronostic sombre, car il est souvent diagnostiqué trop tardivement pour entreprendre un traitement curatif. Il se développe dans 80-90% des cas sur fond de cirrhose. On connait mal comment la fibrose, étape préliminaire à la cirrhose, et son principal constituant, le collagène de type 1 (COL1), peuvent jouer un rôle dans le processus du CHC. Nous avons tout d’abord étudié le développement de la fibrose dans un modèle utilisant la souris nue. Nous avons déterminé qu’après 16 semaines d’administration de thioacétamide dans l’eau de boisson, il est possible d’obtenir une fibrose suffisante pour induire une hépatoprotection en présence de différents hépatotoxiques (AST dans le sérum de souris fibrotiques vs non-fibrotiques : Anti-Fas JO2 (4665 ± 2596 vs. 13953 ± 2260 U/L; P<0.05), acétaminophène (292 ± 66 vs. 4087 ± 2205 U/L; P<0.01) et CCL4 (888 ± 268 vs. 15673 ± 2782 U/L; P<0.001)). Ces résultats confirment que la présence de COL1 et de fibrose favorise la survie des hépatocytes normaux tel qu’observé précédemment au laboratoire. Par la suite, nous avons sélectionné in vivo, par injection intrasplénique de la lignée de CHC Hepa1-6, une lignée à forte tumorigénicité nommée dt-Hepa1-6 (28±12 lésions vs. 0±0 lésions à 21 jours). Cette lignée était composée d’une sous-population cellulaire arborant la protéine de surface EpCAM (34.0±0.1%). Par tri cellulaire, nous avons démontré que ces cellules étaient partiellement responsables de la tumorigénicité accrue (EpCAM + (86.7±2.3%) :1093±74 lésions vs. EpCAM- (15.3±1.0%) :473±100 lésions; P<0.01). Nous avons alors démontré que la présence de fibrose favorise le développement de la lignée dt-Hepa1-6 in vivo (604±242 vs 22±9 lésions; P<0.05). De plus, la présence de fibrose réduit l’efficacité du traitement au cisplatin in vivo (44.5±4.9 vs. 78.7±6.9%; P<0.01) confirmant les résultats obtenus in vitro (Apoptose : COL1 13.75±0.44% vs. plastique 31.45±1.37%; P<0.001). En conclusion, la présence de fibrose et de son principal constituant, le COL1, favorise la survie et la progression du CHC. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a dreadful pathology, often diagnosed too late to be cured. In 80-90% of cases, it arises in the context of liver cirrhosis. Little is known on the implication of liver fibrosis, one of the key elements of cirrhosis, and its major constituent, type I collagen (COL1), on the development of HCC. We first studied the development of fibrosis in a nude mouse model. We determined that, after 16 weeks of thioacetamide administration in drinking water, we obtained a sufficient degree of fibrosis to reach a hepatoprotective state when animals were exposed to different hepatotoxic agents (Serum AST of fibrotic vs non-fibrotic mice : Anti-Fas JO2 (4665 ± 2596 vs. 13953 ± 2260 U/L; P<0.05), acetaminophen (292 ± 66 vs. 4087 ± 2205 U/L; P<0.01) et CCL4 (888 ± 268 vs. 15673 ± 2782 U/L; P<0.001)). This confirmed that COL1 and the presence of fibrosis protects normal hepatocytes as observed previously in our laboratory. Next, we selected in vivo, by intrasplenic injection of the murine HCC cell line Hepa1-6, a highly tumorigenic cell line that we named dt-Hepa1-6 (28±12 lesions vs. 0±0 lesions at 21 days). This cell line was constituted of cell subsets expressing EpCAM protein at their surface (34.0±0.1%). Through cell sorting, we demonstrated that these cells were partially responsible for the enhanced tumorigenicity observed (EpCAM + (86.7±2.3%) :1093±74 lesions vs. EpCAM- (15.3±1.0%) :473±100 lesions; P<0.01). We then showed that the presence of liver fibrosis increases the development of dt-Hepa1-6 cell line in vivo (604±242 vs 22±9 lesions; P<0.05). Moreover, fibrosis reduced the anti-neoplastic efficacy of cisplatinum in vivo (44.5±4.9 vs. 78.7±6.9%; P<0.01) confirming in vitro results (Apototic index : COL1 13.75±0.44% vs. plastic 31.45±1.37%; P<0.001). In conclusion, fibrosis and its major constituent, COL1, favor the survival and progression of HCC.

La détection de lymphocytes T (LT) CD8+ infiltrant les tumeurs (TIL), est généralement associée à un bon pronostic chez des patients atteints du cancer. A l’inverse, l'infiltration des tumeurs par des LT CD4+ régulateurs (Treg), est quant à elle, souvent corrélée à un mauvais pronostic. Plusieurs vaccins « thérapeutiques » capables d’induire des réponses T CD8+ spécifiques d’antigènes tumoraux ont été développés. Cependant, à ce jour, les résultats cliniques obtenus par ces vaccins restent décevants. Dans un premier travail, nous avons développé puis testé un vaccin thérapeutique composé de trois longs peptides synthétiques (LSP) dérivés de la protéine survivine (SVX). La survivine est une protéine surexprimée dans la majorité des cancers humains, mais absente dans les tissus adultes sains, ce qui fait d’elle une cible thérapeutique privilégiée pour les vaccins anti-tumoraux. Nous avons démontré l'efficacité thérapeutique élevée du vaccin SVX contre diverses tumeurs murines. Ceci a été associé à l'induction de réponses T spécifiques de la survivine, un prolongement de la survie et la génération de réponses mémoires antitumorales. De plus, SVX a induit à la fois des LT CD8+ cytotoxiques spécifiques et LT CD4+ auxiliaires de type 1 multifonctionnelles, dans la rate et au sein des tumeurs. Il a aussi induit une diminution des Treg, favorisant ainsi une réponse immunitaire très efficace. Enfin, une étude préliminaire menée chez des patients atteints de différents types de cancers, nous a révélé la présence de taux élevés de précurseurs spontanés de LT spécifiques du vaccin SVX. Ces résultats suggèrent que SVX pourrait potentiellement stimuler l'activation de ces précurseurs spécifiques. Ces résultats constituent une preuve de concept pour amener ce vaccin comme un produit de première génération en essai clinique chez l’homme. Dans le but d’étudier plus en détails la cinétique des réponses immunitaires T spécifiques, associées aux vaccins LSP, nous avons étudié dans un second travail, l’efficacité d’un vaccin LSP dérivé de la protéine Ovalbumine (OVA). Nous avons montré dans plusieurs modèles de tumeurs murines, que la combinaison du vaccin LSP-OVA à un adjuvant approprié, induisait une forte régression de la croissance tumorale, l’expansion des cellules spécifiques T CD4+ et T CD8+ dans les organes lymphoïdes, ainsi que leur migration vers les tumeurs. De plus, le vaccin a induit des cellules T spécifiques fonctionnelles, comme le témoignent les niveaux élevés de cytokines cytotoxiques mesurées. De manière intéressante, le vaccin n’a pas induit de Treg spécifiques d’OVA ou de Treg polyclonaux et ce, malgré la présence de la tumeur. Enfin, lorsque LSP-OVA ne parvenait pas à induire une régression complète de la tumeur, celle-ci était infiltrée par des TIL CD4+ conventionnels et CD8+ exprimant fortement les récepteurs inhibiteurs (PD-1, TIM-3 et TIGIT). Nos résultats suggèrent que pour optimiser ce vaccin LSP, une association à des anticorps bloquant un ou plusieurs de ces récepteurs inhibiteurs, devrait être envisagée. / The presence of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes (TIL) is generally associated with a good prognosis in cancer patients. Conversely, the infiltration of tumors by CD4+ regulators T cells (Treg), is often associated with poor prognosis. Several "therapeutic" vaccines able to induce tumor-specific CD8+ T cell responses have been developed. However, to date, the clinical results of these vaccines remain insufficient. In a first work, we developed and analyzed the immunogenicity and therapeutic efficacy of a new survivin vaccine (SVX) composed of three long synthetic peptides (LSP) containing several CD4 and CD8 T-cell epitopes. Survivin is over-expressed by most human cancers, but absent in healthy adult tissues, making it an interesting therapeutic target for cancer vaccines. We demonstrated the high therapeutic efficacy of SVX vaccine against various established murine tumor models, associated with its capacity to generate both specific cytotoxic CD8+ and multifunctional Th1 CD4+ T-cell responses but also effective memory T-cell responses for long-term protection against relapses. Treatment with SVX vaccine was also found to strongly increase the tumor infiltration of both CD4+ and CD8+ T cells over Treg cells therefore tipping the balance toward a highly efficient immune response. Finally, a preliminary study in patients with different types of cancer revealed the presence of high levels of SVX-specific spontaneous T-cell precursors. This suggests that SVX can potentially stimulate the activation of these specific precursors. Altogether, our results strongly suggest that SVX is a promising cancer vaccine and warrants its further clinical development. In order to study the kinetics of tumor-specific immune responses associated with LSP vaccines, we studied the efficacy of a LSP vaccine derived from the Ovalbumin (OVA) protein. We showed in two tumor models that the combination of LSP-OVA with a suitable adjuvant induced a strong tumor regression, an important expansion of both OVA-specific CD4+ and CD8+ T cells in the lymphoid organs, as well as their migration to the tumor. In addition, the vaccine induced functional specific T cells, as shown by the high levels of cytotoxic cytokines. Interestingly, the vaccine did not induce either OVA-specific or polyclonal Treg, despite the presence of the tumor. Finally, when LSP-OVA failed to induce a complete depletion of the tumor, we observed an important expression of inhibitory receptors (PD-1, TIM-3 and TIGIT) on conventional CD4+ and CD8+ TIL. Our results suggest that to optimize this LSP vaccine, a combination with one or more immune checkpoint blockade agents should be considered.

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Delivery of siRNAs for the treatment of tumors critically depends on the development of efficient nucleic acid carrier systems. The complexation of dendritic polymers (dendrimers) results in nanoparticles, called dendriplexes, that protect siRNA from degradation and mediate non-specific cellular uptake of siRNA. However, large siRNA doses are required for in vivo use due to accumulation of the nanoparticles in sinks such as the lung, liver, and spleen. This suggests the exploration of targeted nanoparticles for enhancing tumor cell specificity and achieving higher siRNA levels in tumors. In this work, we report on the targeted delivery of a therapeutic siRNA specific for BIRC5/Survivin in vitro and in vivo to tumor cells expressing the surface marker prostate stem cell antigen (PSCA). For this, polyplexes consisting of single-chain antibody fragments specific for PSCA conjugated to siRNA/maltose-modified poly(propylene imine) dendriplexes were used. These polyplexes were endocytosed by PSCA-positive 293TPSCA/ffLuc and PC3PSCA cells and caused knockdown of reporter gene firefly luciferase and Survivin expression, respectively. In a therapeutic study in PC3PSCA xenograft-bearing mice, significant anti-tumor effects were observed upon systemic administration of the targeted polyplexes. This indicates superior anti-tumor efficacy when employing targeted delivery of Survivin-specific siRNA, based on the additive effects of siRNA-mediated Survivin knockdown in combination with scFv-mediated PSCA inhibition. Among non-viral vectors, cationic polymers, such as poly(propylene imine) (PPI), play also a prominent role in plasmid DNA delivery. However, limitations of polycationic polymer-based DNA delivery systems are (i) insufficient target specificity, (ii) unsatisfactory transgene expression, and (iii) undesired transfer of therapeutic DNA into non-target cells. We developed single-chain antibody fragment (scFv)-directed hybrid polyplexes for targeted gene therapy of prostate stem cell antigen (PSCA)-positive tumors. Besides mono-biotinylated PSCA-specific single-chain antibodies (scFv(AM1-P-BAP)) conjugated to neutravidin, the hybrid polyplexes comprise β cyclodextrin-modified PPI as well as biotin/maltose-modified PPI as carriers for minicircle DNAs encoding for Sleeping Beauty transposase and a transposon encoding the gene of interest. The PSCA-specific hybrid polyplexes efficiently delivered a GFP gene in PSCA-positive tumor cells, whereas control hybrid polyplexes showed low gene transfer efficiency. In an experimental gene therapy approach, targeted transposition of a codon-optimized p53 into p53 deficient HCT116p53-/-/PSCA cells demonstrated decreased clonogenic survival when compared to mock controls. Noteworthily, p53 transposition in PTEN-deficient H4PSCA glioma cells caused nearly complete loss of clonogenic survival. These results demonstrate the feasibility of combining tumor-targeting hybrid polyplexes and Sleeping Beauty gene transposition, which, due to the modular design, can be extended to other target genes and tumor entities.

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Breast cancer is the second leading cause of death due to cancer in women. A number of effective therapeutic strategies have been implemented in clinics to cope with the disease yet recurrent disease and toxicity reduce their effectiveness. Hence, there is a need to identify and develop more effective therapies with reduced toxic side effects to improve overall survival rates. This dissertation investigates the mechanisms of action of two natural forms of vitamin E and a cholesterol lowering drug, simvastatin, as a therapeutic strategy in human breast cancer cells. Vitamin E in nature consists of eight distinct forms which are fat soluble small lipids. Until recently, vitamin E was known as a potent antioxidant but emerging work suggests they may be resourceful agents in managing a number of chronic diseases including cancer. Anticancer properties of vitamin E have been identified to be limited to the γ- and δ- forms of both tocopherols and tocotrienols. Gamma-tocopherol ([gamma]T) and gamma-tocotrienol ([gamma]T3) have both already been identified to induce death receptor 5 (DR5) mediated apoptosis in breast cancer cells. Studies here show that similar to [gamma]T3, [gamma]T induced DR5 activation is mediated by c-Jun N-terminal kinase/C/EBP homologous protein (JNK/CHOP) proapoptotic axis which in part contributed to [gamma]T mediated dowregulation of c-FLIP, Bcl-2 and Survivin. Also, both agents activate de novo ceramide synthesis pathway which induces JNK/CHOP/DR5 proapoptotic axis and downregulates antiapoptotic factors FLICE inhibitory protein (c-FLIP), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and Survivin leading to apoptosis. Simvastatin (SVA) has been identified to display pleiotropic effects including anticancer effects but mechanisms responsible for these actions have yet to be fully understood. In this dissertation, it was observed that simvastatin induced apoptosis in human breast cancer cells via activation of JNK/CHOP/DR5 proapoptotic axis and down regulation of antiapoptotic factors c-FLIP and Survivin which are in part dependent on JNK/CHOP/DR5 axis. The anticancer effects mediated by simvastatin can be reversed by exogenously added mevalonate and geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), implicating the blockage of mevalonate as a key event. Furthermore, work has been done to understand the factors responsible for drug resistance and identify therapeutic strategies to counteract the same. It was observed that development of drug resistance was associated with an increase in the percentage of tumor initiating cells (TICs) in both tamoxifen and Adriamycin resistant cells compared to their parental counterparts which was accompanied by an increase in phosphorylated form of Signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) proteins as well as its downstream mediators c-Myc, cyclin D1, Bcl-xL and Survivin. Inhibition of Stat3 demonstrated that Stat3 and its downstream mediators play an important role in regulation of TICs in drug resistant breast cancer. Moreover, SVA, [gamma]T3 and combination of SVA+[gamma]T3 has been observed to target TICs in drug resistant human breast cancer cells and downregulate Stat3 as well as its downstream mediators making it an attractive agent to overcome drug resistance. From the data presented here, the mechanisms responsible for the anticancer actions of [gamma]T, [gamma]T3 and SVA have been better understood, providing the necessary rationale to test these agents by themselves or in combination in pre-clinical models. / text

Les lipides « switch » - bascules - appartiennent à la famille des matériaux sensibles à un stimulus. Quand ces lipides bascules sont incorporés aux nanoparticules lipidiques (LNP), ils permettent la délivrance contrôlée grâce à un changement de conformation activé par une baisse de pH. Des expériences précédentes avaient démontré que les LNP bascules ont transfecté le petits ARN interférents (siRNA) in vitro et in vivo, silençant la protéine fluorescente verte (GFP) et la protéine hépatique Facteur VII, respectivement. La double administration de micro ARN (miRNA) et d'agent anticancéreux melphalan a également été réalisée par les LNP bascule sur un modèle de rétinoblastome murin. Ces résultats prometteurs nous ont encouragé à élargir les applications de LNP bascules en tant que vecteur de siRNA. De plus, le mécanisme par lequel les LNP bascules induisent la déstabilisation de la membrane et la libération de matériaux encapsulé au milleu acide reste obscur. La compréhension de ce mécanisme est cruciale pour cerner les avantages et les limites des LNP bascules, pour proposer des futures applications et pour prévenir leur toxicité. Dans ce mémoire, nous avons comme objectif d’évaluer le potentiel des LNP bascules pour le traitement du cancer. Nous avons évalué les LNP bascules comme vecteur de livraison du siRNA ciblant l'une des protéines cancéreuses les plus spécifiques découvertes à ce jour, la survivine. En parallèle, nous avons étudié le comportement biophysique des membranes contenant des lipides bascules dans des vésicules de taille micromètrique. Dans la première étude, nous avons démontré que les LNP bascules ont permis le silençage de la survivine dans une gamme de lignées cellulaires cancéreuses (poumon, cervical, ovaire, sein, côlon, rétinoblastome). Dans les cellules du rétinoblastome humain (Y79), nous avons examiné plusieurs agents cytotoxiques utilisés en clinique quant à leur synergie avec le silençage de la survivine: melphalan, topotécan, téniposide et carboplatine. Le prétraitement avec les LNP chargées de siRNA-survivine a amélioré de manière synergique la cytotoxicité du carboplatine et du melphalan mais dans une moindre mesure celle du topotécan et du téniposide. Cet effet était spécifique aux cellules cancéreuses car les cellules saines (ARPE.19) n'exprimaient pas de survivine. L'inhibition de la survivine par silençage de siRNA s'est révélée plus spécifique et moins dommageable pour les cellules saines (ARPE.19) que le YM155, un inhibiteur moléculaire de la survivine. Dans la deuxième étude, nous avons observé par microscopie confocale que les lipides bascules induisaient rapidement le stress, la fission et une courbure positive dans les membranes des vésicules unilamellaires géantes lorsqu'elles étaient exposées à des conditions acides. La dynamique de la membrane a été confirmée par des expériences de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de fuite de calcéine. Ces phénomènes ont également été observés lorsque des lipides bascules ont été incorporés dans une membrane hybride polymère/lipide, fournissant des propriétés sensibles au pH aux vésicules hybrides. À notre connaissance, c'est la première fois qu'une vésicule hybride sensible au pH est reportée. Nos résultats corroborent l'applicabilité des LNP bascules en tant qu'agents de vectorisation des siRNA pour le traitement du cancer grâce au silençage de la survivine, en particulier comme adjuvant à la chimiothérapie. L'investigation biophysique a révélé que les lipides bascules agissent sur la fluidité de la membrane, en particulier à pH acide. Cette sélectivité en pH garantit leur biocompatibilité à pH neutre ainsi que la libération efficace et rapide de leur cargo à pH acide. La compatibilité avec les vésicules hybrides polymère/lipide ouvre de nouvelles applications au niveau de vésicules biomimétiques et l'administration de médicaments. / Cationic switchable lipids belong to the class of stimuli-responsive materials. When incorporated in lipid nanoparticles (LNP), switchable LNP promote pH-triggered delivery of payload based on a molecular switch mechanism. Previous studies have demonstrated that switchable LNP successfully delivered small interferring RNA (siRNA) in vitro and in vivo, promoting the silencing of a reporter Green Fluorescencen Protein (GFP) protein and liver-produced factor VII, respectively. Dual delivery of micro RNA (miRNA) and anticancer agent melphalan was also achieved through switchable LNP in a retinoblastoma rat model. These promising results encouraged us to enlarge the applications of switchable LNP as siRNA carrier. Moreover, the mechanism whereby switchable LNP mediate acid-triggered membrane destabilization and, thus, payload release remains elusive. Understanding this mechanism is crucial to draw the advantages and limitations of switchable LNP, and to tailor their future applications and prevent their potential toxicity. In this dissertation, we aimed to further understand the potential of switchable LNP for cancer treatment. We assessed switchable LNP as a siRNA delivery carrier by targeting one of the most specific cancer protein discovered to date, survivin. Meanwhile, we investigated the biophysical behavior of switchable-lipid containing membranes in micron-sized vesicles. In the first study, we demonstrated that switchable LNP efficiently silenced survivin in a range of cancer cell line models (lung, cervical, ovary, breast, colon, retinoblastoma). In retinoblastoma (RB) cells (Y79), several clinically used cytotoxic agents were screened for their synergy with survivin silencing: melphalan, topotecan, Teniposide, and carboplatin. Pretreatment with LNP loaded with siRNA targeted against survivin synergistically enhanced the cytotoxicity of carboplatin and melphalan but in lesser extent topotecan and teniposide. This effect was specific to cancer cells since healthy cells (ARPE.19) did not express survivin. Survivin inhibition through siRNA silencing revealed more specific and less damageable for healthy cells (ARPE.19) than a molecular approach, such as YM155. In the second study, we observed by confocal microscopy that switchable lipids rapidly induced stress, fission, and positive curvature in giant unilamellar vesicles’ membranes when submitted to acidic conditions. The membrane dynamics was confirmed by dynamic light scattering and calcein leakage experiments. Remarkably, these phenomena were also observed when switchable lipids were embedded into a hybrid polymer/lipid membrane, providing pH-sensitive properties to hybrid vesicles. To the best of our knowledge, this is the first time a pH-sensitive hybrid vesicle is reported. Our findings corroborate with the applicability of switchable LNP as siRNA delivery agents for cancer treatment through survivin silencing, especially as an adjuvant to chemotherapy. The biophysical investigation revealed that the switchable lipids act on the membrane fluidity, specifically at acidic pH. This pH selectivity guarantees their biocompatibility at neutral pH as well as its efficient and quick release of their cargo at acidic pH. Their compatibility with hybrid polymer/lipid vesicles opens new applications in biomimetic vesicles and drug delivery.