Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Μεγάλη ποικιλία αντιβιοτικών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων βακτηρίων, προσδενόμενα στα ριβοσώματά τους. Η τελιθρομυκίνη είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ερυθρομυκίνης, που ανήκει στην οικογένεια των κετολιδίων και επιδεικνύει αντιμικροβιακή δραστικότητα σε αρκετά βακτήρια που είναι ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη. Είναι ένας ισχυρός αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης, παρεμποδίζοντας τη διέλευση της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το κανάλι εξόδου. Για να αναλύσουμε την αλληλεπίδραση της τελιθρομυκίνης με το βακτηριακό ριβόσωμα, μελετήσαμε τη σύνδεση του αντιβιοτικού σε E.coli ριβοσώματα χρησιμοποιώντας κινητική συναγωνισμού πρόσδεσης. Συγκεκριμένα, η πρόσδεση της τελιθρομυκίνης μελετήθηκε σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E.coli, όπου το εν λόγω αντιβιοτικό συναγωνίζεται την τυλοσίνη για κοινές θέσεις δέσμευσης επί του τριμερούς συμπλόκου C (AcPhe-tRNA•poly(U)•ριβόσωμα), ενός λειτουργικού αναλόγου του εναρκτήριου συμπλόκου. Η τυλοσίνη, ένα 16-μελές μακρολίδιο, αναστέλλει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, ενώ η τελιθρομυκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Τα κινητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι η τελιθρομυκίνη και το ριβοσωματικό σύμπλοκο C αλληλεπιδρά σε μοριακή αναλογία 1:1 για να σχηματίσει ταχέως ένα CT σύμπλοκο, το οποίο στη συνέχεια ισομεριώνεται βραδέως σε ένα σταθερότερο σύμπλοκο C*T. C+ T CT C*T Το πρώτο στάδιο της διαδικασίας δέσμευσης περιλαμβάνει μία σχετικά χαμηλής συγγένειας θέση δέσμευσης, που τοποθετείται στην είσοδο του καναλιού εξόδου της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (KT =500 nM). Το δεύτερο στάδιο αναπαριστά μία διαμορφωτική αλλαγή με σταθερά ισομερισμού (Κισομ.) ίση με 58,9 , η οποία ωθεί το αντιβιοτικό βαθύτερα στο εσωτερικό του τούνελ σε μία θέση υψηλής συγγένειας (KT*=8,13 nM). Μεταλλαγή του νουκλεοζίτη U754 σε αδενοσίνη μειώνει στο ήμισυ την ικανότητα μετατόπισης της τελιθρομυκίνης στην τελική της θέση (Κισομ.=25,7), μέσω λεπτών αλλαγών στις σταθερές ταχύτητας σχηματισμού και διάστασης του συμπλόκου C*T. Αντίθετα, η μεταλλαγή U2609C μειώνει 5-φορές τη μετακίνηση του αντιβιοτικού προς τη θέση υψηλής συγγένειας και αποσταθεροποιεί το σύμπλοκο C*T, προσδίδοντας στην Κισομ. τιμή ίση με 2,6. Δεδομένου ότι οι δύο νουκλεοζίτες έχουν εντοπιστεί με κρυσταλλογραφία στην ίδια περιοχή του καναλιού εξόδου, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την άποψη ότι μερικά ριβοσωματικά κατάλοιπα, αν και εντοπισμένα σε γειτονικές θέσεις, μπορεί να έχουν εντελώς διαφορετική συνεισφορά στην εγκατάσταση ενός φαρμάκου επί του ριβοσώματος. Μεταλλάξεις στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες L22 και L4 προκαλούν διαφορετικές μεταβολές στην πρόσδεση της τελιθρομυκίνης στο ριβοσωματικό σύμπλοκο C. Συγκεκριμένα, η αφαίρεση των αμινοξέων 82-84 στον εκτεταμένο βρόγχο της L22 μειώνει δραστικά τη σταθερά ισομερισμού (Κισομ.= 1,53), ενώ η μετάλλαξη Lys63Glu στην πρωτεΐνη L4 ασκεί μέτρια επίδραση στην ολική συγγένεια της τελιθρομυκίνης για το ριβοσωματικό σύμπλοκο C (KT*=12 nM). Και οι δύο μεταλλάξεις προκαλούν ισχυρή ανθεκτικότητα έναντι της ερυθρομυκίνης. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν σημαντική προσφορά στη χαρτογράφηση της θέσης πρόσδεσης της τελιθρομυκίνης στο προκαρυωτικό ριβόσωμα και επιβεβαιώνουν την υπεροχή της αντιμικροβιακής δράσης της τελιθρομυκίνης έναντι της ερυθρομυκίνης. / Protein synthesis is an important target for antibiotics. A wide range of antibiotics inhibit the growth of pathogenic bacteria, by binding to the ribosome. Telithromycin is a semisynthetic derivative of erythromycin, which belongs to the family of ketolides and causes increased antimicrobial activity in several bacteria that are resistant to erythromycin. It is a potent inhibitor of protein synthesis by preventing the passage of nascent polypeptide chain through the exit tunnel. To analyze the interaction of telithromycin with the bacterial ribosome, we examined the binding of the drug to E.coli ribosomes, using competitive kinetics. Namely, the binding of telithromycin was studied in a free-cell system derived from E.coli, where it competes with the antibiotic tylosin for common binding sites on the ternary complex C (AcPhe-tRNA • poly (U) • ribosome), an active analogue of the initiator complex in protein synthesis. Tylosin, a 16-member macrolide, inhibits peptide bond formation, while telithromycin fails to affect the activity of peptidyltransferase. The kinetic data suggest that telithromycin and the ribosomal complex C interact at a molecular ratio of 1:1 to form quickly a CT complex, which then slowly isomerized to a tighter complex C*T. C+ T CT C*T The first step of the binding procedure includes a relative low-affinity binding site, situated at the entrance of the exit tunnel of the large ribosomal subunit (KT = 500 nM). The second step represents a slow conformational change with an isomerization constant (Kisom.) equal to 58.9, which pushes the drug deeper into the tunnel, in a high-affinity site (KT*=8.13 nM). Mutation of nucleoside U754 to adenosine reduces moderately the ability of telithromycin to translocate to its final position (Kisom.=25.7), through minor effects on the forward and reverse rate constants of the isomerization step. In contrast, mutation U2609C reduces 5-fold the shift of the drug to the high-affinity site and also destabilizes the final complex C*T, leading to a value for Kisom. equal to 2.6. Taking into account, that both ribosomal nucleosides have been crystallographycally localized at the same region of the exit tunnel, our results emphasize the notion that some ribosomal residues, although placed at neighboring positions, may have entirely different contribution on the accommodation of a drug into the ribosome. Mutations in ribosomal proteins L4 and L22 affect diversely the binding of telithromycin to ribosomal complex C. Especially, removal of amino acids 82-84 in the extended loop of L22 significantly reduces the isomerization constant (Kisom. = 1.53), while mutation Lys63Glu in protein L4 exhibits a moderate effect on the overall affinity of telithromycin for the ribosomal complex C (KT *= 12 nM). Both mutations render E.coli resistant against erythromycin. Our results contribute significantly to the mapping of telithromycin binding site in prokaryotic ribosome and confirm the superiority of telithromycin as an antimicrobial agent, when compared with erythromycin.

Antibiotic resistance is an inescapable problem in the current world of pharmacology. All antibiotics have theoretically limited life spans, as bacteria can pass modes of resistance both vertically to their progeny and horizontally to their neighbors. Organic chemists dealing with the problem of antibiotic resistance are crafting new antibiotics both from existing antibiotic scaffolds and completely de novo. However, in recent years research in new antibiotics has declined rapidly, mainly due to financial considerations - pharmaceutical corporations no longer see the value in spending millions on antibiotic research that may amount to nothing, and that may not end up significantly improving the bottom line even if approved. Current efforts in antibiotic research are mainly focused on making changes to existing antibiotic scaffolds. The majority of approved and Phase III trial antibiotics from the last 10 years are semisynthetic versions of naturally derived antibiotics. This class of antibiotics seems to be the most effective at combating antibiotic resistance. Among this type of antibiotic are the macrolides and ketolides, identified by the presence of a large macrocyclic lactone ring (macrolide ring). All macrolide antibiotics target the 50S subunit of the bacterial ribosome by reversibly binding in the peptidyl transferase center, thus blocking protein synthesis. Telithromycin (TEL), used in clinic since 2004, and cethromycin (CET) are third generation semisynthetic drugs derived from flagship macrolide antibiotic erythromycin. All macrolide antibiotics hitherto have been semisynthetic modifications on the erythromycin scaffold and majority of them are ineffective against multi-drug resistant pathogens. Recently, utilizing structural ribosomal data of RNA mutations, 2009 Nobel laureate Steitz has argued that bacterial resistance to erythromycin and telithromycin may in some cases, be due to a steric clash at the C4-methyl of the antibiotic with a mutant subunit of rRNA. Based on this, Andrade and co-workers have hypothesized that replacing the said methyl with hydrogen would lessen the steric interference and defeat the antibiotic resistance. To this end, the Andrade Lab launched a structure-based drug design program that encompassed the preparation and biological evaluation of four desmethyl (i.e., CH3 -- H) analogues of TEL: 4,8,10-tridesmethyl TEL, 4,10-didesmethyl TEL, 4,8-didesmethyl TEL, 4-desmethyl TEL. As a part of my dissertation I accomplished the total syntheses and biological evaluation 4,8-didesmethyl TEL (36 steps) and 4,8,10-tridesmethyl CET (41 steps). The CET analog was an extension to the tridesmethyl scaffold, initiated based upon optimistic results with the corresponding TEL analog. Apart from these two molecules, I have also reported my contributions toward the total synthesis of 4,8,10-tridesmethyl and 4-desmethyl TEL. / Chemistry

Streptococcus pneumoniae is a leading cause of pneumonia, bacteremia, meningitis, otitis media and sinusitis, and is responsible for significant morbidity and mortality worldwide. The burden of pneumococcal disease has been greatly impacted by the high prevalence of HIV, especially in developing countries. Macrolides are commonly used for the treatment of pneumococcal infections with the resulting effect of increasing resistance. Pneumococci develop resistance to macrolides predominantly by two mechanisms; target modification and drug efflux. Target modification occurs through the acquisition of an erm(B) gene (MLSB phenotype) or through ribosomal mutation, and drug efflux occurs through the acquisition of a mef(A) gene (M phenotype). Alternative protein synthesis-inhibiting antibiotics such as linezolid and telithromycin have been developed in response to the increasing level of antibiotic resistance. In this study, novel mechanisms of resistance to protein synthesis-inhibiting antibiotics, and the current prevalence and epidemiology of macrolide resistance in South Africa were investigated. Two clinical isolates of S. pneumoniae resistant to macrolides, linezolid and chloramphenicol were identified in the PROTEKT surveillance study and the ABCs program of the CDC. The isolates were found to each contain a 6 bp deletion, resulting in the deletion of two amino acids from a highly conserved region of ribosomal protein L4 (64PWRQ67 to 64P_Q67 and 67QKGT70 to 67Q_T70). The genes encoding the mutant ribosomal proteins transformed susceptible strain R6 to macrolide, linezolid and chloramphenicol resistance, proving that the ii deletions conferred the resistance on the isolates, and indicating that these antibiotics share a common binding site. Growth studies of the R6 transformants showed increased mass doubling times, suggesting that the L4 mutations were associated with a fitness cost, but the original strains showed evidence of fitness compensation. The L4 mutations in these isolates represent a novel mechanism of cross-resistance to macrolides, linezolid and chloramphenicol. A macrolide-resistant clinical isolate of S. pneumoniae with mutations in 23S rRNA showed a heterogeneous phenotype and genotype. A mutant gene encoding 23S rRNA from this isolate transformed susceptible strain R6 to resistance. Transformants displayed similar heterogeneity to the isolate. Culture of resistant strain R6 in the presence of antibiotic maintained resistance, however culture of the strain in the absence of antibiotic pressure resulted in a reversion to susceptibility. By DNA sequencing, gene conversion was shown to occur between the wild-type and mutant 23S rRNA alleles. Growth studies indicated that the resistant phenotype was associated with a fitness cost. Therefore, under antibiotic selective pressure alleles converted to the mutant form, and in the absence of selective pressure alleles reverted to wild-type, in order to regain fitness. Through gene conversion the pneumococcus has the ability to rapidly adapt to the environment, with implications for susceptibility testing and patient treatment. A rare clinical isolate of S. pneumoniae, highly resistant to telithromycin, was received from the Canadian Bacterial Surveillance Network and was investigated for the mechanism of resistance. The isolate was found to contain an erm(B) gene iii with a truncated control peptide, as well as a mutant ribosomal protein L4, containing a number of mutations. Transformation of susceptible strain PC13, containing a wild-type erm(B) gene, with the mutant erm(B) gene decreased the susceptibility of PC13 to telithromycin, but did not confer high-level resistance. Transformation of PC13 with the mutant L4 gene or a fragment of the L4 gene containing only the 69GTG71 to TPS mutation, conferred high-level resistance on PC13. In contrast, transformation of R6, which did not contain an erm(B) gene, with the L4 gene or L4 fragment only conferred reduced telithromycin susceptibility. High-level telithromycin resistance was therefore conferred by a combination of an erm(B) gene with a 69GTG71 to TPS mutation in a highly conserved region of ribosomal protein L4. The combination of mechanisms inhibited the binding of telithromycin to the ribosome, whereas neither mechanism individually was sufficient. A telithromycin-resistant clinical isolate of S. pneumoniae was received from the PROTEKT surveillance study and was investigated for the resistance mechanism. The isolate was found to contain a 136 bp deletion in the regulatory region of erm(B). This mutant gene was shown, by transformation studies, to confer resistance on susceptible strain PC13. Expression of erm(B) on the transcriptional level was quantified by real-time reverse transcription PCR. In the presence of erythromycin and telithromycin, erm(B) expression was significantly higher in the mutant PC13 strain than the wild-type strain. Growth studies showed that the mutant PC13 strain had a shorter lag phase than the wild-type strain in the presence of erythromycin. Telithromycin resistance was conferred by the mutant iv erm(B) gene that was expressed at a higher level than the wild-type gene, most likely resulting in higher ribosomal methylation levels sufficient to hinder telithromycin binding. Macrolide resistance in invasive pneumococcal disease in South Africa for the period 2000 to 2005 was investigated through a national laboratory-based surveillance system. Viable isolates (n=15982) collected during the six-year period were phenotypically characterised, by determination of MICs and serotyping. Two hundred and sixty random isolates from 2005 were genotypically screened for the presence of erm(B) and mef(A). Macrolide resistance increased significantly from 9% in 2000 to 14% in 2005. Resistant isolates were received from all provinces of South Africa, with Gauteng and the Western Cape having the highest incidence. Serotype 14 was the most common macrolide-resistant serotype and 96% of macrolide-resistant isolates in 2005 were serotypes included in the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and serotype 6A. Macrolide resistance was significantly higher in children <5 than in individuals 5 years and older. The majority of strains (75%) over the six-year period displayed the MLSB phenotype. Of the 260 strains genotypically screened, 57% were positive for erm(B), 27% were positive for mef(A), 15% contained both erm(B) and mef(A), and 1% were negative for both genes and were found to contain ribosomal mutations. Eighty percent of isolates containing both erm(B) and mef(A) were serotype 19F and were found to be clonal by PFGE and MLST. These multidrug-resistant isolates were related to the Taiwan19F-14 global clone. v Many protein synthesis-inhibiting antibiotics share overlapping binding sites on the large ribosomal subunit. Alterations in 23S rRNA and ribosomal proteins L4 and L22, within the binding pocket, confer resistance and often cross-resistance to many of these antibiotics. The ability of the pneumococcus to develop resistance and the global spread of resistant strains highlights the importance of monitoring resistance levels and understanding resistance mechanisms.

Τα ριβοσώματα, οι μακρομοριακές μεταφραστικές μηχανές που είναι υπεύθυνες για την πρωτεϊνική σύνθεση, αποτελούν έναν από τους κυριότερους κυτταρικούς στόχους των αντιβιοτικών, που χορηγούνται για αντιμικροβιακή θεραπεία. Μελέτες για περισσότερο από 40 χρόνια δείχνουν ότι το κατάλληλο ιοντικό περιβάλλον (μονοσθενή, δισθενή κατιόντα και πολυαμίνες) είναι απαραίτητο για τη σωστή ριβοσωματική λειτουργία, ενώ παράλληλα επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις του με διάφορους προσδέτες. Παρόλα αυτά η μοριακή βάση της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στο μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών δεν έχει ενδελεχώς μελετηθεί. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση σε συνθήκες που προσομοιάζουν με τις φυσιολογικές του κυττάρου και η μελέτη της επίδρασης του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση αυτών. Τα αντιβιοτικά που μελετήθηκαν ήταν: α) η βλαστισιδίνη, ως κλασικός αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (ΡΤάσης), β) το μακρολίδιο τυλοσίνη που αναστέλλει την ΡΤάση, αλλά παράλληλα προσδένεται στην αρχή του τούνελ εξόδου και παρεμποδίζει την πολυπεπτιδική αλυσίδα να εξέλθει από το ριβόσωμα, και γ) τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη (πρώτης γενεάς), αζιθρομυκίνη (δεύτερης γενεάς) και τελιθρομυκίνη (μακρολίδιο τρίτης γενεάς ή κετολίδιο), η δράση των οποίων έγκειται στην παρεμπόδιση του τούνελ εξόδου. Εξίσου σημαντική φαίνεται να είναι η επίδραση των μακρολιδίων στη συγκρότηση της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας. Ο μηχανισμός δράσης των αντιβιοτικών και η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση τους έγινε αρχικά με κινητικές μελέτες. Το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε ήταν η αντίδραση πουρομυκίνης, η οποία μας έδωσε τη δυνατότητα τιτλοδότησης των ενεργών ριβοσωμάτων. Βάσει αυτού μελετήθηκαν τα αντιβιοτικά βλαστισιδίνη και τυλοσίνη που αναστέλλουν άμεσα την ΡΤάση, ενώ για τη μελέτη των υπολοίπων μακρολιδίων διεξήχθησαν πειράματα συναγωνιστικής αναστολής. Ως γνωστό, τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη μοιράζονται κοινές θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα με την τυλοσίνη. Έτσι, για την εύρεση των σταθερών πρόσδεσης αυτών στο ριβόσωμα έγινε συναγωνισμός με τυλοσίνη. Τα πειράματα συναγωνισμού πραγματοποιήθηκαν, επωάζοντας το ριβόσωμα με μείγμα μακρολιδίου και τυλοσίνης, και τιτλοδοτώντας την απομένουσα δραστικότητα του ριβοσώματος με την αντίδραση πουρομυκίνης απομακρύνοντας την περίσσεια αντιβιοτικών. Σε παράλληλα πειράματα, το ριβόσωμα προεπωάστηκε αρχικά με το μακρολίδιο και στη συνέχεια προστέθηκε τυλοσίνη, η οποία ανιχνεύει το εναπομείναν ριβοσωματικό σύμπλοκο. Επειδή η σταθερά συγγένειας στη δεύτερη περίπτωση βρέθηκε μικρότερη (ισχυρότερη πρόσδεση αντιβιοτικού) συμπεράναμε, ότι ο μηχανισμός πρόσδεσης του αντιβιοτικού είναι βραδύς και ακολουθεί δυο στάδια. Βασιζόμενοι στις τιμές των σταθερών συγγένειας σε πειράματα αναγέννησης του ριβοσωματικού συμπλόκου από την απενεργοποιημένη μορφή του, προσδιορίστηκαν ξεχωριστά όλες οι κινητικές παράμετροι που χαρακτηρίζουν την πρόσδεση του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα. Συγκρίναμε τις παραμέτρους αυτές και γενικότερα την ισχύ πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα σε πέντε ιοντικές συνθήκες: (α) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, (β) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 100 μΜ σπερμίνη, (γ) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 50 μΜ σπερμίνη και 2 mM σπερμιδίνη, (δ) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+ ριβοσωματικό σύμπλοκο φωτοσημασμένο με 100 μΜ ΑΒΑ-σπερμίνη, και (ε) 10 mM Mg2+, 100 mM NH4+. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πολυαμίνες βελτιώνουν την πρόσδεση της βλαστισιδίνης, αλλά μειώνουν την πρόσδεση των μακρολιδίων. Η επίδραση των ιόντων Mg2+ προσομοιάζει εκείνης των πολυαμινών, αλλά είναι λιγότερο αποτελεσματική, αφού 100 μΜ σπερμίνης επιφέρουν μεγαλύτερη αναστολή πρόσδεσης, από ότι 10 mM Mg2+. Για να ερμηνευτεί σε μοριακό επίπεδο η επίδραση της σπερμίνης στη συγγένεια των αντιβιοτικών έναντι του ριβοσώματος, οι θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο ριβόσωμα προσδιορίστηκαν με φωτοσήμανση συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως μοριακό ανιχνευτή ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την ΑΒΑ-σπερμίνη. Οι θέσεις αυτές αποκάλυψαν ότι οι πολυαμίνες προσδένονται σε γειτονικές θέσεις προς τα αντιβιοτικά, επηρεάζοντας την τοπική διαμόρφωση και το φορτίο. Επιβεβαίωση του μηχανισμού δράσης και της επίδρασης των πολυαμινών έγινε με ανάλυση αποτυπώματος. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, τα μακρολίδια προσδενόμενα στο ριβόσωμα προστατεύουν ορισμένα νουκλεοτίδια από την επίδραση χημικών τροποποιητών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα αντιβιοτικά διέρχονται μια ενδιάμεση κατάσταση πρόσδεσης στο ριβόσωμα δεσμευόμενα αρχικά στην είσοδο του τούνελ εξόδου και στη συνέχεια εισχωρώντας βαθύτερα σε αυτό. Η φύση της ενδιάμεσης κατάστασης εξαρτάται από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε μακρολιδίου. Η επίδραση των πολυαμινών στο μηχανισμό πρόσδεσης ελέγχθηκε επαναλαμβάνοντας τα πειράματα χημικής προστασίας παρουσία αυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μείωση της πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα επιτελείται κυρίως μέσω της επίδρασης των πολυαμινών στη δέσμευση του υδρόφοβου λακτονικού δακτυλίου. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του κάθε αντιβιοτικού επηρεάζουν ποικιλοτρόπως το μέγεθος της επίδρασης αυτής. Στο τελευταίο κομμάτι της διατριβής μελετήθηκε η ισχύς των μακρολιδίων, υπολογίζοντας την αναστολή που προκαλούν στο συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης του γονιδίου της GFP πρωτεΐνης, και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα κινητικά δεδομένα πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα-στόχο. Σε υψηλή συγκέντρωση ιόντων Mg2+ η τυλοσίνη έχει μεγαλύτερη ισχύ, ενώ σε χαμηλή συγκέντρωση ιόντων απουσία ή παρουσία πολυαμινών η αζιθρομυκίνη. Η τελιθρομυκίνη παρουσίασε τη χαμηλότερη ισχύ πρόσδεσης στο ριβόσωμα και αναστολής της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπρόσθετα, ελέγχθηκε πιθανή επίδραση των μακρολιδίων στην πρόσδεση των υποστρωμάτων (tRNAs) στην Α-, Ρ- και Ε- θέση του ριβοσώματος, στη μετατόπιση αυτών από την Α- στην Ρ- θέση και στη μεταφραστική πιστότητα του ριβοσώματος. Βρήκαμε ότι τα μακρολίδια δεν μπορούν να επηρεάσουν αυτά τα στάδια της ριβοσωματικής λειτουργίας. / Ribosomes, the macromolecular translating machines responsible for protein biosynthesis, are the most common targets for many antibacterial agents. Experiments for more than 40 years have demonstrated that a distinct ionic environment (monovalent, divalent cations and polyamines) is essential for ribosomal functions and their interactions with the ligands. Nevertheless, the molecular basis of the ionic environment’s influence on antibiotic mechanism of action has never been precisely elucidated. The aim of this thesis was first to investigate the mechanism of action of several antibiotics –inhibitors of protein synthesis, under ionic conditions close to the cell environment and second, to clarify the role of the ionic environment on their mechanism of action. The antibiotics studied were: a) blasticidin-S, a classic inhibitor of peptidyl tranferase (PTase) activity, b) tylosin which inhibits PTase, but in parallel binds at the entrance of exit tunnel and blocks the passage of the nascent polypeptide chain, and c) erythromycin (a first generation macrolide), azithromycin (a second generation macrolide), and telithromycin (a third generation macrolide, ketolide), that blocks the exit tunnel. The mechanism of action of antibiotics and the influence of ionic environment on antibiotic potency was studied primarily with kinetic methods. The experimental procedure was based on the puromycin reaction, performed under conditions allowing the estimation of the catalytic rate constant. Using this experimental approach we studied the mechanism of action of blasticidin and tylosin which directly inhibit PTase. For studying the other macrolides, experiments employing competitive kinetics were performed. Erythromycin, azithromycin and telithromycin share common binding sites on ribosomes with tylosin. Thus, to estimate the kinetic constants of their interactions with ribosomes, competitive kinetic experiments were carried out in the presence of tylosin. Namely, a posttranslocation ribosomal complex formed from Escherichia coli 70S ribosomes bearing tRNAPhe at the E-site and AcPhe-tRNA at the P-site (complex-C) was incubated with a mixture of each macrolide and tylosin for the desired time intervals. The rest of ribosomal activity was titrated by the puromycin reaction. In parallel experiments, complex-C was pre-incubated with each one of the macrolides and then reacted with tylosin. The rest of complex-C activity was again titrated with the puromycin reaction. Since the affinity constant obtained by the second series of experiments was less than that obtained by the first series of experiments, we concluded that the mechanism of action of antibiotics follows a slow onset inhibition process, which includes two steps. Based on secondary plots and on kinetic plots derived from regeneration of complex-C, we measured the kinetic parameters participating in the kinetic model. Thus, the potency of each antibiotic was determined under five different ionic conditions: (a) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, (b) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 100 μΜ spermine, (c) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, 50 μΜ spermine and 2 mM spermidine, (d) 4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+, and ribosomal complex photolabelled with 100μΜ ΑΒΑ-spermine, and (e) 10 mM Mg2+, 100 mM NH4+. Processing of the data led us to the conclusion that polyamines and Mg2+ ions increase the potency of blasticidin, but decrease the potency of macrolides. To explain the diverse action of polyamines and of the ionic environment in general on antibiotic potency, the binding sites of spermine in ribosomes were localized by photoaffinity labeling, using a photoactive analogue of spermine, ABA-spermine. These experiments revealed that polyamines bind at the vicinity of antibiotics, influencing the ionic charge and the local conformation of rRNA. Confirmation of the macrolide mechanism of action and verification of the influence of polyamines on their potency was achieved by footprinting analysis. According to this technique, macrolides bind to ribosomes and protect specific nucleotides from modification by chemical reagents like DMS, CMCT and kethoxal. The results demonstrated that the antibiotics (I) form an encounter complex with complex-C (CI), in which the antibiotics occupy the entrance of the exit tunnel. This intermediate complex is then isomerized slowly to a tighter complex (C*I) with which antibiotics move deeply in the exit tunnel. The exact interactions stabilizing the intermediate complex depend on the characteristic groups of each macrolide. The influence of polyamines was checked by repeating the experiment in the presence of polyamines. The results showed that polyamines reduce the macrolide binding to ribosomes, by affecting mainly the interactions of the hydrophobic lactone ring with the ribosome. The special characteristic groups of each macrolide affect the polyamine action. The potency of macrolides action was also estimated using a coupled transcription-translation system for GFP expression. The results obtained were consistent with those produced by kinetic analysis. In addition, we check for possible macrolide effects on tRNA binding at the A-, P- and E- sites of the ribosome, on translocation, and on translational fidelity. No strong effects were identified excluding the macrolide from these ribosomal functions.