A fim de garantir a viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração é necessário o desenvolvimento de tecnologias eficientes para a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos. Além disso, o elevado consumo de água pelas biorrefinarias tem despertado grande atenção para a utilização de recursos hídricos não-potáveis, como a água do mar. Assim, atualmente busca-se por enzimas tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos gerados e/ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a purificação e caracterização cinética e bioquímica de uma ß-xilosidase produzida por uma linhagem do fungo mesófilo Colletotrichum graminicola. A enzima purificada (Bxcg) apresentou conteúdo de carboidratos totais de 54% (m/m), ponto isoelétrico de 4,2 e uma massa molecular aparente de cerca de 130 kDa, que foi reduzida para cerca de 92 kDa após deglicosilação. A enzima mostrou boa tolerância a elevadas concentrações de sal e manteve cerca de 90% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol L-1 (concentração média de NaCl na água do mar). A temperatura e pH ótimos de reação foram 65 ºC e 4,5, respectivamente, tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 mol L-1. Já na presença de NaCl 2,5 mol L-1 o pH ótimo de atividade foi alterado para 5,0. Bxcg permaneceu estável numa ampla faixa pH (4,0 - 7,5) tanto na ausência quanto na presença de sal. A enzima mostrou ótima estabilidade térmica e manteve completamente estável à 50 ºC após 24 horas de incubação. A presença de elevada concentração de NaCl (2,5 mol L-1) resultou num aumento na termoestabilidade da enzima. A atividade enzimática foi tolerante aos íons Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn 2+, Mg2+, K+ e Na+. Na ausência de sal, Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-D-xilopiranosídeo (pNP-XIL) com Vmáx de 348,8 ± 11,5 U mg-1, KM de 0,52 ± 0,02 mmol L-1 e alta eficiência catalítica (kcat/KM = 1432,7 ± 47,3 L mmol-1 s-1). Em presença de sal, a afinidade aparente de Bxcg pelo substrato foi levemente menor e a hidrólise ocorreu com Vmáx menor, resultando em eficiência catalítica cerca de 1,5 de vezes menor, se comparadas as condição de ausência de sal. A enzima apresentou atividade bifuncional de ?-xilosidase/?-L-arabinofuranosidase. Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-L-arabinopiranosídeo com afinidade aparente cerca de 18 vezes menor (KM = 9,6 ± 0,5 mmol L-1) que a estimada para pNP-XIL e a hidrólise do substrato ocorreu com Vmáx de 148,4 ± 4,4 U mg-1 e eficiência catalítica de 33,1 ± 1,6 L mmol-1 s-1. A enzima foi fortemente inibida por xilose com KI de 3,3 mmol L-1. Bxcg foi capaz de hidrolisar xilooligossacarídeos até xilohexaose, inclusive aqueles com ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. Bxcg e uma endo-xilanase purificada do mesmo microrganismo apresentaram um forte efeito sinérgico (3,1 vezes) para hidrólise de xilana beechwood. A enzima mostrou-se tolerante aos solventes butanol, glicerol, tolueno e acetona, bem como aos surfactantes Triton X-100, Tween 80 e Tween 20, enquanto que o líquido iônico acetato de 1-etil-3-metilimidazólio inibiu fortemente a atividade enzimática. De uma maneira geral, Bxcg apresenta propriedades atraentes para a aplicação em processos de sacarificação da biomassa lignocelulósica, incluindo aqueles conduzidos em elevada salinidade e/ou em presença de compostos residuais gerados ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa / In order to ensure the economic viability of the production of second-generation ethanol, it is necessary the development of efficient technologies for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials. In addition, the large consumption of water by biorefineries has attracted great attention for the use of non-potable water resources, such as seawater. Therefore, enzymes tolerant to high salt concentrations and the by-products generated and/or accumulated in the biomass pretreatment steps are widely studied. In this context, the objective of this study was the purification and kinetic and biochemical characterization of a ?-xylosidase produced by a strain of the mesophilic fungus Colletotrichum graminicola. The pure enzyme (Bxcg) showed a total carbohydrate content of 54% (w/w), isoelectric point of 4.2 and an apparent molecular weight of 130 kDa, which was reduced to 92 kDa after deglucosylation. The enzyme showed good tolerance to high salt concentrations and retained aproximately 90% of the control activity in the presence of 0.5 mol L-1 NaCl (NaCl concentration in seawater). The optimum reaction temperature and pH were 65 °C and 4.5, respectively, both in the absence and presence of 0.5 mol L-1 NaCl. In the presence of 2.5 mol L-1 NaCl, the optimum pH was altered to 5.0. Bxcg retained stable over a wide pH range (4.0 - 7.5) both in the absence and presence of salt. The enzyme showed excellent thermal stability and retained completely stable at 50 °C after 24 hours of incubation. The presence of high NaCl concentration (2.5 mol L-1) resulted in an increase in the thermostability of the enzyme. The enzymatic activity was tolerant to Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn2+, Mg2+, K+ and Na+. In the absence of salt, Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-D-xylopyranoside (pNP-XIL) with Vmax of 348.8 ± 11.5 U mg-1, KM of 0.52 ± 0.02 mmol L-1 and high catalytic efficiency (kcat/KM = 1432.7 ± 47.3 L mmol-1 s-1). In the presence of salt, the apparent affinity for the substrate was slightly lower and the hydrolysis occurred with smaller Vmax, resulting in catalytic efficiency 1.5 fold lower, when compared to the salt. The enzyme showed bifunctional ?-xylosidase/?-L-arabinofuranosidase activity. Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-L-arabinopyranoside with apparent affinity 18-fold lower (KM = 9.6 ± 0.5 mmol L-1) than that estimated for pNP-XIL and substrate hydrolysis occurred with Vmax of 148.4 ± 4.4 U mg-1 and catalytic efficiency of 33.1 ± 1.6 L mmol-1 s-1. The enzyme was strongly inhibited by xylose with KI of 3.3 mmol L-1. Bxcg was able to hydrolyze xylooligosaccharides from xylohexaose, including those with 4-O-methyl-glucuronic acid branch. Bxcg and a pure endo-xylanase from the same microorganism had a strong synergistic effect (3.1 fold) for hydrolysis of xylan beechwood. The enzyme was tolerant to the butanol, glycerol, toluene and acetone solvents, as well as the Triton X-100, Tween 80 and Tween 20 surfactants, whereas the 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ionic liquid strongly inhibited the enzymatic activity. In summary, Bxcg has attractive properties for application in saccharification processes of the lignocellulosic biomass, particularly under high salinity and/or in the presence of residues of biomass pretreatment steps

OLIVEIRA, Aurelice Barbosa de. Caracterização físico-química, química e bioquímica do suco tropical de manga (Mangifera indica L.) não adoçado obtido pelo processo hot fill. 2006. 110 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-Ce, 2006 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-01T12:11:36Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_aboliveira.pdf: 464268 bytes, checksum: dfae11a628100cfbc737e4e4df8790a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-01T12:13:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_aboliveira.pdf: 464268 bytes, checksum: dfae11a628100cfbc737e4e4df8790a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T12:13:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_aboliveira.pdf: 464268 bytes, checksum: dfae11a628100cfbc737e4e4df8790a0 (MD5) Previous issue date: 2006 / The present work aimed to evaluate the physicochemical and chemical parameters and polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) activity on the processing stages and shelf life of the tropical non sweetened mango juice preserved by hot fill method. The samples were removed afterwards the pulp discharged, homogenation, pasteurization and the product in the end of the processing and after 55, 110 and 165 days of storage (28ºC ± 2ºC). Total titratable acidity, pH, total soluble solids (ºBrix), reducing and total sugar, ascorbic acid, carotenoids, anthocyanins and colour (L*, a* e b*) were analysed. The results showed that pH, total titratable acidity, total sugar content and carotenoids not have a statistical significance at a level of 5% along the storage time. It was observed a higher PPO activity during the studied processing stages and in the shelf life of the product, keeping oscillating in a general manner. The POD showed an increasing activity during the processing stages and keeping stable along the storage. In conclusion the physicochemical and chemical parameters for this product were within the limits established by the Brazilian legislation and the thermal treatment was not efficient to inactivate these enzymes probably due to the possible presence of isoforms with different thermo stability grades and/or isotypes renaturation. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar os parâmetros físico-químicos e químicos e a atividade da polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) nas etapas de processamento e durante a vida de prateleira do suco tropical de manga não adoçado envasado pelo processo hot fill. Foram retiradas amostras após as etapas de despolpa, homogeneização e pasteurização e do produto logo após o processamento e aos 55, 110 e 165 dias de armazenamento (28ºC ± 2ºC). A acidez total titulável, pH, sólidos solúveis totais (ºBrix), açúcares redutores e totais, ácido ascórbico, carotenóides, antocianinas e cor (L*, a* e b*) foram analisados. Os resultados apresentaram que o pH, a acidez total titulável, o conteúdo de açúcar total e carotenóides não apresentaram significância estatística ao nível de 5% durante o período de armazenagem. Foi observada uma maior atividade da PPO durante as etapas de processamento estudadas bem como na vida de prateleira do produto, de um modo geral mantendo-se oscilante. A POD apresentou atividade crescente nas etapas de processamento e em seguida mantendo-se constante durante o armazenamento. Conclui-se que os parâmetros físico-químicos e químicos para esse produto encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela Legislação Brasileira e o tratamento térmico não se apresentou eficiente para a inativação dessas enzimas, devido possivelmente a presença de isoformas com diferentes graus de termoestabilidade e/ou renaturação de isotipos.

Submitted by Vinicius de Godoi Contessoto null (vinicius@sjrp.unesp.br) on 2016-09-09T18:11:23Z No. of bitstreams: 1 Tese-Vinícius_Contessoto-Final.pdf: 17297320 bytes, checksum: f601c338b5bf6436dc595bad581418f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-13T13:26:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 contessoto_vg_dr_sjrp.pdf: 17297320 bytes, checksum: f601c338b5bf6436dc595bad581418f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T13:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 contessoto_vg_dr_sjrp.pdf: 17297320 bytes, checksum: f601c338b5bf6436dc595bad581418f5 (MD5) Previous issue date: 2016-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Entender a contribuição das interações eletrostáticas no processo de enovelamento e na estabilidade do estado nativo de proteínas é de grande relevância em biofísica molecular. Este trabalho possui duas frentes de estudos. Na primeira etapa é apresentado o estudo das interações eletrostáticas no processo de enovelamento utilizando modelos baseados em estruturas com cargas em dinâmica molecular com pH constante. O estudo foi realizado na parte N-terminal da proteína ribossomal L9 (NTL9), uma proteína com o mecanismo de enovelamento de 2 estados, reversível e realizado desde pH 1.0 até 12.0. Foi possível comparar os resultados das simulações com os resultados experimentais presentes na literatura e os dados obtidos indicam que o modelo proposto é capaz de capturar informações fundamentais sobre o processo de enovelamento referentes à estabilidade e dependência com pH. Na segunda etapa é apresentado o estudo sobre as interações eletrostáticas na estabilidade de enzimas com interesse na produção de bioetanol de segunda geração. O objetivo final deste trabalho é adequar as enzimas às condições do reator para a produção de bioetanol. Neste trabalho foi utilizada uma metodologia capaz de indicar possíveis mutações, pela otimização da interação carga–carga na superfície da proteína, que levam ao aumento de termostabilidade. Este trabalho conta com a colaboração do grupo experimental do Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) que realizam os testes experimentais e as validações das mutações propostas. / The understanding of electrostatic interactions in protein folding process and in native state stability is important to molecular biophysics area. This work has two areas of interest. At first step it is presented the study about electrostatic interactions in the protein folding process using structure-based models in a constant pH molecular dynamics. It was used the N-terminal domain of ribosomal protein L9 (NTL9), which folding mechanism is a two-state pathway, fully reversible and foldable in a pH range from 1.0 to 12.0. The simulation results were compared with experimental results from literature and the obtained data indicates that the proposed model is capable of capturing essential features of folding mechanism about stability and pH dependence. At second step, it is presented the study about electrostatic interactions in stability of enzymes related with second generation bioethanol production. The final goal of this work is to adjust the enzymes to reactor conditions of bioethanol production. It was employed a method that can suggest rational mutation, based on optimization of charge-charge interactions, that leads to thermostability increase. This work can count on the collaboration of an experimental group of Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE) that performs the wet lab tests and validates the suggested mutations.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O presente trabalho teve como objetivo avaliar os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos e a atividade da polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) nas etapas de processamento e durante a vida de prateleira do suco tropical de manga nÃo adoÃado envasado pelo processo hot fill. Foram retiradas amostras apÃs as etapas de despolpa, homogeneizaÃÃo e pasteurizaÃÃo e do produto logo apÃs o processamento e aos 55, 110 e 165 dias de armazenamento (28ÂC Â 2ÂC). A acidez total titulÃvel, pH, sÃlidos solÃveis totais (ÂBrix), aÃÃcares redutores e totais, Ãcido ascÃrbico, carotenÃides, antocianinas e cor (L*, a* e b*) foram analisados. Os resultados apresentaram que o pH, a acidez total titulÃvel, o conteÃdo de aÃÃcar total e carotenÃides nÃo apresentaram significÃncia estatÃstica ao nÃvel de 5% durante o perÃodo de armazenagem. Foi observada uma maior atividade da PPO durante as etapas de processamento estudadas bem como na vida de prateleira do produto, de um modo geral mantendo-se oscilante. A POD apresentou atividade crescente nas etapas de processamento e em seguida mantendo-se constante durante o armazenamento. Conclui-se que os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos para esse produto encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela LegislaÃÃo Brasileira e o tratamento tÃrmico nÃo se apresentou eficiente para a inativaÃÃo dessas enzimas, devido possivelmente a presenÃa de isoformas com diferentes graus de termoestabilidade e/ou renaturaÃÃo de isotipos. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos e a atividade da polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) nas etapas de processamento e durante a vida de prateleira do suco tropical de manga nÃo adoÃado envasado pelo processo hot fill. Foram retiradas amostras apÃs as etapas de despolpa, homogeneizaÃÃo e pasteurizaÃÃo e do produto logo apÃs o processamento e aos 55, 110 e 165 dias de armazenamento (28ÂC Â 2ÂC). A acidez total titulÃvel, pH, sÃlidos solÃveis totais (ÂBrix), aÃÃcares redutores e totais, Ãcido ascÃrbico, carotenÃides, antocianinas e cor (L*, a* e b*) foram analisados. Os resultados apresentaram que o pH, a acidez total titulÃvel, o conteÃdo de aÃÃcar total e carotenÃides nÃo apresentaram significÃncia estatÃstica ao nÃvel de 5% durante o perÃodo de armazenagem. Foi observada uma maior atividade da PPO durante as etapas de processamento estudadas bem como na vida de prateleira do produto, de um modo geral mantendo-se oscilante. A POD apresentou atividade crescente nas etapas de processamento e em seguida mantendo-se constante durante o armazenamento. Conclui-se que os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos para esse produto encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela LegislaÃÃo Brasileira e o tratamento tÃrmico nÃo se apresentou eficiente para a inativaÃÃo dessas enzimas, devido possivelmente a presenÃa de isoformas com diferentes graus de termoestabilidade e/ou renaturaÃÃo de isotipos. / The present work aimed to evaluate the physicochemical and chemical parameters and polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) activity on the processing stages and shelf life of the tropical non sweetened mango juice preserved by hot fill method. The samples were removed afterwards the pulp discharged, homogenation, pasteurization and the product in the end of the processing and after 55, 110 and 165 days of storage (28ÂC Â 2ÂC). Total titratable acidity, pH, total soluble solids (ÂBrix), reducing and total sugar, ascorbic acid, carotenoids, anthocyanins and colour (L*, a* e b*) were analysed. The results showed that pH, total titratable acidity, total sugar content and carotenoids not have a statistical significance at a level of 5% along the storage time. It was observed a higher PPO activity during the studied processing stages and in the shelf life of the product, keeping oscillating in a general manner. The POD showed an increasing activity during the processing stages and keeping stable along the storage. In conclusion the physicochemical and chemical parameters for this product were within the limits established by the Brazilian legislation and the thermal treatment was not efficient to inactivate these enzymes probably due to the possible presence of isoforms with different thermo stability grades and/or isotypes renaturation. / The present work aimed to evaluate the physicochemical and chemical parameters and polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) activity on the processing stages and shelf life of the tropical non sweetened mango juice preserved by hot fill method. The samples were removed afterwards the pulp discharged, homogenation, pasteurization and the product in the end of the processing and after 55, 110 and 165 days of storage (28ÂC Â 2ÂC). Total titratable acidity, pH, total soluble solids (ÂBrix), reducing and total sugar, ascorbic acid, carotenoids, anthocyanins and colour (L*, a* e b*) were analysed. The results showed that pH, total titratable acidity, total sugar content and carotenoids not have a statistical significance at a level of 5% along the storage time. It was observed a higher PPO activity during the studied processing stages and in the shelf life of the product, keeping oscillating in a general manner. The POD showed an increasing activity during the processing stages and keeping stable along the storage. In conclusion the physicochemical and chemical parameters for this product were within the limits established by the Brazilian legislation and the thermal treatment was not efficient to inactivate these enzymes probably due to the possible presence of isoforms with different thermo stability grades and/or isotypes renaturation.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O presente trabalho teve como objetivo avaliar os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos e a atividade da polifenoloxidase (PPO) e peroxidase (POD) nas etapas de processamento e durante a vida de prateleira do suco tropical de manga nÃo adoÃado envasado pelo processo hot fill. Foram retiradas amostras apÃs as etapas de despolpa, homogeneizaÃÃo e pasteurizaÃÃo e do produto logo apÃs o processamento e aos 55, 110 e 165 dias de armazenamento (28ÂC Â 2ÂC). A acidez total titulÃvel, pH, sÃlidos solÃveis totais (ÂBrix), aÃÃcares redutores e totais, Ãcido ascÃrbico, carotenÃides, antocianinas e cor (L*, a* e b*) foram analisados. Os resultados apresentaram que o pH, a acidez total titulÃvel, o conteÃdo de aÃÃcar total e carotenÃides nÃo apresentaram significÃncia estatÃstica ao nÃvel de 5% durante o perÃodo de armazenagem. Foi observada uma maior atividade da PPO durante as etapas de processamento estudadas bem como na vida de prateleira do produto, de um modo geral mantendo-se oscilante. A POD apresentou atividade crescente nas etapas de processamento e em seguida mantendo-se constante durante o armazenamento. Conclui-se que os parÃmetros fÃsico-quÃmicos e quÃmicos para esse produto encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela LegislaÃÃo Brasileira e o tratamento tÃrmico nÃo se apresentou eficiente para a inativaÃÃo dessas enzimas, devido possivelmente a presenÃa de isoformas com diferentes graus de termoestabilidade e/ou renaturaÃÃo de isotipos. / The present work aimed to evaluate the physicochemical and chemical parameters and polyphenoloxidase (PPO) and peroxidase (POD) activity on the processing stages and shelf life of the tropical non sweetened mango juice preserved by hot fill method. The samples were removed afterwards the pulp discharged, homogenation, pasteurization and the product in the end of the processing and after 55, 110 and 165 days of storage (28ÂC Â 2ÂC). Total titratable acidity, pH, total soluble solids (ÂBrix), reducing and total sugar, ascorbic acid, carotenoids, anthocyanins and colour (L*, a* e b*) were analysed. The results showed that pH, total titratable acidity, total sugar content and carotenoids not have a statistical significance at a level of 5% along the storage time. It was observed a higher PPO activity during the studied processing stages and in the shelf life of the product, keeping oscillating in a general manner. The POD showed an increasing activity during the processing stages and keeping stable along the storage. In conclusion the physicochemical and chemical parameters for this product were within the limits established by the Brazilian legislation and the thermal treatment was not efficient to inactivate these enzymes probably due to the possible presence of isoforms with different thermo stability grades and/or isotypes renaturation.