Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:24:21Z : No. of bitstreams: 1 pavezzi_fc_dr_rcla.pdf: 679532 bytes, checksum: a99630bf198f33da999b112631255c08 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glucoamilase é uma enzima hidrolítica que catalisa a liberação sucessiva de β-D-glicose a partir do amido e oligossacarídeos relacionados. Neste trabalho foram estudadas as glucoamilases de Aspergillus awamori expressas em levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram utilizadas duas linhagens alteradas denominadas M1 e M2, e uma linhagem selvagem (WT), utilizada como parâmetros na comparação dos resultados. As enzimas foram produzidas em fermentação submersa, e amidos de diferentes origens vegetais foram utilizados como uma fonte extra de carbono na produção das enzimas. O melhor substrato para a produção da glucoamilase selvagem e da mutante M2 foi o amido de batata com 8,2 e 6,6 U/mL, respectivamente. Para a linhagem M1 foi o amido de mandioca com atividade enzimática de 5,9 U/mL. O amido de milho mostrou ser um substrato menos indicado para a produção destas enzimas. Para a purificação foi preparada uma coluna de afinidade com resina sepharoseTM 6B epóxi ativada ligada a acarbose, onde diferentes concentrações do ligante foram avaliadas. A coluna apresentou boa eficiência no processo de purificação conforme análise por eletroforese SDS-PAGE, com massas moleculares estimada em 100 kDa. A temperatura ótima de atividade das enzimas M1 e M2 foi 65 °C, enquanto que a selvagem teve sua atividade máxima em 60 °C. O pH ótimo de atuação das enzimas foi 4,5. As glucoamilases mutantes apresentaram maior termoestabilidade que a glucoamilase selvagem durante o processo de termoinativação, destacando principalmente a glucoamilase M2. A meia vida a 70 °C foi de 8,1 minutos para a enzima mutante M2, 4,1 minutos para a M1 e 3,0 minutos para a enzima selvagem. A energia de ativação para a desnaturação (Ead) foi de 252,9 e 262,8 KJ mol-1 para as enzimas M1 e M2 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para a selvagem. A maior energia dos mutantes indica maior resistência... / Glucoamylase is a hydrolytic enzyme that catalyzes the consecutive liberation of β-D-glucose from starch and related oligosaccharides. In this work glucoamylases from Aspergillus awamori expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae were studied. Two mutant strains, denominated M1 and M2, were used and one wild strain (WS) was used as parameter to compare the results. The enzymes were produced in submerged fermentation and starches from different botanical origins were used as extra carbon source for enzyme production. The best substrate for the production of wild glucoamylase and of mutant M2 was potato starch with 8.2 and 6.6 U/mL, respectively. For strain M1 the best substrate was cassava starch with enzymatic activity of 5.9 U/mL. Corn starch revealed to be a less indicated starch for the production of these enzymes. For purification, an affinity column was prepared with activated SepharoseTM 6B epoxy linked to acarbose, and different concentrations of ligand were evaluated. The column exhibited good efficiency during the purification process according to SDS-PAGE analysis, with molecular masses estimated in 100 kDa. Optimum temperature for activities of M1 and M2 enzymes was 65°C, while the wild one exhibited maximum activity at 60°C. Optimum pH for enzyme action was 4.5. Mutant glucoamylases presented higher thermostability than wild glucoamylase during the thermoinactivation process, with M2 standing out. Half life at 70°C was of 8.1 minutes for mutant enzyme M2, 4.1 minutes for M1 and 3.0 minutes for wild enzyme. Activation energy for denaturation (Ead) was 252.9 and 262.8 KJ mol-1 for enzymes M1 and M2 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild one. The higher energy of the mutants indicates higher resistance of the protein structure, since more energy is required for the molecule to enter a transition and unfolding state. Thermodynamic parameter ΔG was higher... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-17T14:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2391066 bytes, checksum: 8e9bf10066ba754750a62d4dc4175cc7 (MD5) Previous issue date: 2010-08-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Acerola is a tropical fruit of economic and nutrition potential, considering its high vitamin content C. During the ripeness processes including chemical and biochemical enzymatic activities. The peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) have been considered the main enzymes responsible for deterioration of quality in many fruits.The aim of this study was to determine enzymatic activity and some properties of peroxidase in the clones of acerola Okinawa and Emepa in three stages of maturation.In both clones the enzymatic activity (U) and specific activity (AE) were determined. Only the clone Okinawa were also determined pH and temperature optima and thermal stability of POD, by climate issues no availability of fruits Emepa clone. Data were subjected to descriptive statistics, normality test followed by ANOVA and t-Student test, completing the analysis of response surface in the pH and temperature optima and thermal stability. It was observed that POD and AE Units were higher (p<0.05) in clone Okinawa in relation to Emepa at all stages of maturation. In surface analysis, peroxidase showed maximum activity in phosphate buffer pH = 6.5 at T= 45°C. In studies of stability and thermal inactivation, there was marked loss of activity with increasing time and temperature.The total inactivation was not achieved, suggesting the presence of heat resistant isoenzymes, however 50% of maximum activity was achieved at 80°C and 4minute. After 24 hours of rest of the enzyme, recovery of enzymatic activity was observed at 90 ° C in all treatments. At 80°C decreased the activity of peroxidase, showing modest recovery in the shorter treatments. At 70°C there was no recovery of peroxidase. Such information is a prerequisite for new technologies that can prolong the shelf life of fruits / Acerola é um fruto tropical de potencial econômico e nutricional, considerando seu alto conteúdo de vitamina C. Durante o amadurecimento ocorrem processos de alterações químicas e bioquímicas incluindo atividades enzimáticas. A peroxidase (POD) e a polifenoloxidase (PPO) são as principais enzimas responsáveis pela deterioração da qualidade de muitos frutos. O objetivo deste trabalho foi determinar atividade enzimática e algumas propriedades da peroxidase da acerola nos clones Okinawa e Emepa em três estágios de maturação. Em ambos os clones a atividade enzimática (U), e atividade específica (AE) foram determinadas. Apenas no clone Okinawa também foram determinados pH e temperatura ótimos e estabilidade térmica da POD, por questões climáticas não houve disponibilidade de frutas do clone Emepa. Os dados foram submetidos à estatística descritiva, teste de normalidade seguido de ANOVA e t-Student, completando com a análise de superfície de resposta nos ensaios de pH e temperatura ótimos e da estabilidade térmica. Observou-se que Unidades de POD e AE foram superiores (p<0,05) no clone Okinawa em relação à Emepa em todos os estágios de maturação. Na análise de superfície, a peroxidase apresentou atividade máxima em tampão fosfato pH= 6,5 a T= 45°C. Nos estudos de estabilidade e inativação térmica, observou-se perda acentuada da atividade com aumento de tempo e temperatura. A inativação total não foi atingida, sugerindo a presença de isoenzimas termorresistentes, no entanto 50% da atividade máxima foram atingida com 80°C e 4minutos. Após 24horas de repouso da enzima, recuperação da atividade foi observada a 90°C em todos os tratamentos. A 80°C houve diminuição da atividade da peroxidase, demonstrando pequena recuperação nos tratamentos de menor tempo. A 70°C não houve recuperação da peroxidase. Tais informações são pré-requisitos para novas tecnologias que possam prolongar a vida de prateleira dos frutos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:34Z : No. of bitstreams: 1 pavezzi_fc_me_sjrp.pdf: 562701 bytes, checksum: ad3004ebc0e9ea82a7805aa4a75d67b8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A glucoamilase é uma enzima importante na produção enzimática de xarope de glicose a partir do amido. Neste processo o amido é primeiramente dextrinizado pela ação da a-amilase a aproximadamente 100°C. Em seguida, a suspensão de dextrinas é resfriada a uma temperatura próxima de 55°C para a sacarificação, pela ação da glucoamilase. A característica de alta termoestabilidade para essa enzima é fundamental para agilizar o processo e reduzir custos operacionais. O presente estudo visou à obtenção, caracterização físico-química, bem como a cinética de termoinativação das glucoamilases mutantes de Aspergillus awamori expressa em Saccharomyces cerevisiae. O gene da glucoamilase sofreu alterações através da técnica de PCR mutagênico, e os clones expressando glucoamilases mais termoestáveis foram selecionados e avaliados. A glucoamilase selvagem apresentou temperatura ótima de atividade a 58°C, as enzimas mutantes apresentaram atividades ótimas a 68°C para a linhagem M1, e 65°C para a linhagem M2. As glucoamilases mutantes M1 e M2 também apresentaram maior termoestabilidade que a enzima selvagem. As temperaturas de desnaturação térmicas na ausência de substrato por 1 hora foram 45, 50 e 55°C para as enzimas, selvagem, M1 e M2, respectivamente. Todas as enzimas apresentaram atividade ótima no pH 3,5 - 4,0, sendo que os mutantes M1 e M2 também exibiram maior estabilidade à variação de pH, retendo acima de 80% da atividade na faixa de pH 5,5 a 10,0. A meia vida (t1/2) a 70°C foi de 8,1 minutos para a glucoamilase mutante M2, 3,8 minutos para o mutante M1 e 3 minutos para a glucoamilase selvagem. A termoinativação das enzimas seguiram uma cinética de primeira ordem. A energia de desnaturação foi de 262,8 e 252,9 KJ mol-1 para os mutantes M2 e M1 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para... / Glucoamylase is an important enzyme for the production of glucose syrup made from starch. In this process, starch is initially dextrinized by the action of a a-amylase at approximately 100ºC. Secondly, the dextrins suspension is cooled down to a temperature near 55ºC for the saccharification, by the action of an glucoamylase. High thermostability is a fundamental characteristic for this enzyme to accelerate the process and to reduce operational costs. This work had the purpose of studying physicochemical characteristics as well as thermoinactivation kinetics of mutants glucoamylases of Aspergillus awamori expressed in Saccharomyces cerevisiae. Glucoamylases gene was modified through mutagenic PCR technique and the clones which produced more thermostable glucoamylases were selected and evaluated. The wild glucoamilase exhibited optimum temperature at 58ºC, the mutants from strain M1 and M2 acted optimally at 68ºC and 65ºC, respectively. The mutants M1 and M2 also exhibited higher thermostability when compared to the wild enzyme. Thermic denaturation temperatures in the absence of substrate for 1 hour were 45, 50 and 55ºC for the wild, M1 and M2 enzymes, respectively. All enzymes showed optimum activity at pH 3.5 4.0, and the mutants M1 and M2 also exhibited higher stability towards pH variation, maintaining 80% of activity in pH from 5.5 to 10.0. Half life (t1/2) at 70ºC was 8.1 minutes for mutant M2, 3.8 minutes for mutant M1 and 3 minutes for wild glucoamylase. The enzymes thermoinactivation followed a first order kinetics. Denaturation energy was 262.8 and 252.9 KJ mol-1 for mutants M2 and M1 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild enzyme. Thermodynamic parameter of thermoinactivation, .G was lower for wild glucoamylase showing a higher denaturation for the enzyme. All enzymes revealed similar activity profile on different substrates, of which corn starch was the best substrate for hydrolysis for all glucoamylases tested.

Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T16:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_EvandroAntoniode_M.pdf: 2108461 bytes, checksum: 6b52a40625238916bf0ef94067896ee2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A transglutaminase microbiana (MTGase; EC 2.3.2.13) é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações covalentes cruzadas entre proteínas, peptídeos e várias aminas primárias através da reação de acil transferência entre resíduos de glutamina e lisina. A incorporação de ligações covalentes cruzadas entre proteínas por ação da transglutaminase vem sendo empregada pela indústria alimentícia para modificar principalmente a textura, a viscosidade e a capacidade de formação de gel de alimentos. Este trabalho teve como principal objetivo estudar a estabilidade térmica, o efeito de inibidores e ativadores, a concentração e a purificação da transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. CBMAI 837. No estudo da estabilidade térmica da enzima verificou-se que a transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI 837 é uma enzima termossensível, estável em temperaturas abaixo de 40°C e rapidamente inativada acima de 50°C. Parâmetros cinéticos e termodinâmicos da desnaturação térmica da enzima foram determinados para as seis temperaturas estudadas. Os tempos de meia-vida da enzima a 55 e 60°C foram estimados em 3,5 e 1,9 minutos, respectivamente. A influência de alguns compostos no aumento da estabilidade térmica da enzima foi investigada, sendo verificado que a adição de EDTA e KCl na concentração de 1% e de cisteína e glutationa na concentração de 0,1% aumentaram a estabilidade térmica da transglutaminase durante incubação a 45°C por 30 minutos. O efeito de compostos como etanol, ativadores e inibidores enzimáticos na atividade da MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 foi estudado. O etanol na concentração de 10% (v:v) apresentou pouco efeito na atividade enzimática, enquanto que concentrações acima de 40% (v:v) provocaram rápida inativação da enzima. A MTGase foi ativada na presença de EDTA e cisteína e inativada na presença de iodoacetamida e ácido cloromercuribenzóico, sugerindo que esta é uma enzima cálcio independente com um resíduo de cisteína no sítio ativo. No estudo da concentração da MTGase foram avaliados diferentes métodos, sendo verificado que a precipitação com sulfato de amônio a 80% de saturação foi o método mais efetivo, possibilitando a concentração do sobrenadante de cultivo cerca de 4,5 vezes com rendimento de 142%. A aplicação da preparação enzimática bruta concentrada de MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 em proteína texturizada de soja apresentou efeito similar ao da enzima comercial Activa® TG-BP quando aplicada nas mesmas condições. Na purificação da MTGase de Streptomyces sp. CBMAI 837 em coluna de afinidade Blue Sepharose CL-6B foram separadas 3 frações com atividade de transglutaminase (TG-BS1, TG-BS2 e TG-BS3), indicando a presença de isoenzimas. A massa molecular da MTGase presente nas frações purificadas TG-BS2 e TG-BS3 foi estimada em cerca de 35 KDa por SDS-PAGE. As três frações obtidas foram caracterizadas quanto ao pH ótimo de atividade enzimática. Foi observado que a fração parcialmente purificada TG-BS1 apresentou atividade ótima em pH 10,0 e um segundo pico de atividade em pH 6,0, enquanto as frações purificadas TG-BS2 e TG-BS3 apresentaram pH ótimo de atividade em pH 6,5 e também um segundo pico de atividade em pH 10,0 / Abstract: The microbial transglutaminase (MTGase, EC 2.3.2.13) is an enzyme capable of catalyzing the formation of covalent cross-links among proteins, peptides and various primary amines by reaction of acyl transfer between glutamine and lysine residues. The incorporation of covalent cross-links between proteins by the action of transglutaminase has been used by the food industry to modify especially the texture, viscosity and gel forming ability of foods. This work aimed to study the thermal stability, effect of inhibitors and activators, concentration and purification of microbial transglutaminase produced by strain Streptomyces sp. CBMAI 837. It was observed in the study of thermal stability of the enzyme that the transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837 is a thermosensitive enzyme, stable at temperatures below 40°C and rapidly inactivated above 50°C. Kinetic and thermodynamic parameters of thermal denaturation of the enzyme were determined for six temperatures. It was estimated that the half-life times of the enzyme at 55 and 60°C were 3.5 and 1.9 minutes, respectively. The influence of compounds to increase the thermal stability of the enzyme was investigated, and it was found that the addition of EDTA and KCl at a concentration of 1% and cysteine and glutathione at a concentration of 0.1% increased the thermal stability of transglutaminase during the incubation at 45°C for 30 minutes. The effect of compounds such as ethanol, activators and inhibitors on enzymatic activity of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 was studied. The ethanol concentration 10% (v/v) had little effect on enzyme activity, while concentrations above 40% (v/v) resulted in rapid inactivation of the enzyme. The MTGase was activated in the presence of EDTA and cysteine and inactivated in the presence of iodoacetamide and chloromercuribenzoic acid, suggesting that this is a calcium independent enzyme with a cysteine residue at the active site. Different methods were evaluated in the study of the concentration of MTGase, confirming that the precipitation with ammonium sulfate at 80% saturation of the culture supernatant was the method more effective, being concentrated this enzyme about 4.5 fold with a yield of 142%. The application of crude enzyme preparation of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 concentrated by ammonium sulfate in texturized soy protein showed a similar effect to the one of commercial enzyme Activa® TG-BP when applied under the same conditions. Three fractions with transglutaminase activity (TG-BS1, TG-BS2 e TG-BS3) were separated in the purification of MTGase from Streptomyces sp. CBMAI 837 in column affinity Blue Sepharose CL-6B, indicating the presence of isoenzymes. The molecular mass of MTGase present in the purified fractions TG-BS2 e TG-BS3 was estimated at about 35 KDa by SDS-PAGE. The three fractions were characterized by optimum pH of enzymatic activity. It was observed that the partially purified fraction TG-BS1 showed optimal activity at pH 10.0 and a second peak of activity at pH 6.0, while the purified fractions TG-BS2 e TG-BS3 showed optimum pH activity at pH 6.5 and also a second peak of activity at pH 10.0 / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by isabel silva (isabel_manaus@yahoo.com.br) on 2017-06-22T15:28:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / CAPES / The advancement of molecular technologies in the scientific field has enabled the development of various forms of access to the genetic material of organisms in order to locate, map, isolate, characterize and decode the target genes of a particular individual or a set of individuals coexisting in a specific environment. Metagenomic studies are very promising in several areas of biotechnology, such as the discovery of new molecules of industrial biotechnological interest, the investigation of new antibiotics and drugs, the bioremediation of environments impacted with toxic metals and the prospection of various enzymes. The objective of this work was characterize enzymatically a previously screened lipase enzyme from Metagenomic Library of Terra Preta de Índio. Lipase gene sequence was isolated from the metagenomic library and expressed in Pichia pastoris under control of PGK promoter. Recombinant lipase was characterized by hydrolysis activity of lipid substrates and synthesis ability in organic solvent. In silico analyzes infer the identification of extracellular lipase belonging to the lipase family, superfamily -hydrolase and lipase activity molecular function. Enzyme was efficiently produced in P. pastoris and recombinant lipase showed activity of 374.59 U/mL hydrolyzing p-nitrophenyl palmitate, Vmax (ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km (ap.) 1,4 mM and Kcat (ap.) 103,7 S-1. Enzyme had maximum activity at pH 8.0, temperature 90 ºC and remained stable at high temperatures. Synthesis ability was evaluated by the formation of ethyl laurate by esterification reaction of lauric acid with ethanol, yielding 70% conversion in 45 minutes. Recombinant protein is characterized as an alkaline, thermotolerant, activated by calcium, EDTA e detergents. / O avanço das tecnologias moleculares no campo científico, possibilitou o desenvolvimento de diversas formas de acesso ao material genético dos organismos, de forma a ser possível localizar, mapear, isolar, caracterizar e decodificar os genes alvo de um indivíduo particular ou de um conjunto de indivíduos coexistentes em um ambiente específico. Estudos metagenômicos são bastante promissores em diversas áreas da biotecnologia, como nas descobertas de novas moléculas de interesse biotecnológico industrial, na investigação de novos antibióticos e fármacos, na biorremediação de ambientes impactados com metais tóxicos e na prospecção de enzimas diversas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar enzimaticamente uma enzima lipase previamente rastreada de uma Biblioteca Metagenômica de Terra Preta de Índio. A sequência correspondente ao gene de lipase foi isolada da biblioteca metagenômica, clonada e expressada em Pichia pastoris sob controle do promotor PGK. A lipase recombinante foi caracterizada pela atividade de hidrólise de substratos lipídicos e capacidade de síntese em solvente orgânico. Análises in silico da sequência proteica inferem a identificação de uma lipase extracelular pertencente à / - hidrolase e com função molecular para atividade lipásica. A enzima foi produzida eficientemente em P. pastoris e a lipase recombinante apresentou atividade de 374,59 U/mL hidrolisando p-nitrofenil palmitato, Vmax(ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km(ap.) 1,4 mM e Kcat(ap.) 103,7 S-1. A enzima possuiu atividade máxima em pH 8,0, temperatura 90 ºC e se manteve estável em altas temperaturas. A capacidade de síntese foi avaliada pela formação de laurato de etila pela reação de esterificação do ácido láurico com etanol apresentando rendimento de 70% em 45 minutos de reação. A proteína recombinante se caracteriza como uma enzima alcalina, termotolerante, ativada por cálcio, EDTA e detergentes.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cassiane Minelli.pdf: 1637307 bytes, checksum: b5227c9445b1a0b3f8dcc8fcef9bcfd3 (MD5) Previous issue date: 2013-06-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / One of the biggest successes of Brazilian agriculture is the Pro-Alcohol, whose base of support is the culture of sugar cane, which leaves a lapse of activity in the offseason. In view of this, several alchool industries have been investing in other cultures, where the starch is the primary source for the alcohol production. The pursuit of amylase in thermotolerant Bacillus sp. And rhizobia from Amazonian soils is a strategy to be used for the bio-industries to reduce or stop importing them. Mutation was made from two Bacillus sp. containing amylases by exposure to ultraviolet light. Also tested were 40 strains of rhizobia for the presence of thermophilic amylases. Enzyme assays were performed to check for amylase activity at different temperatures, times, pHs, thermal shock and thermal stability. The Bacillus sp. ITAAM 023M mutant showed higher amylolyse than mutant ITAAM 010M. The amylases of the two Bacillus sp mutants and rhizobias proved quite diverse as their characteristics, indicating they are different from each other. The temperature with higher amylase activity of the mutants ITAAM 010M and ITAAM 023M was 100 ˚C. Amylase from the mutant ITAAM 010M showed greater activity in pH 4.5, and from the ITAAM 023M at pH 7.5. Their amylases showed high sensitivity to thermal shock. Amylase from mutant ITAAM 010M showed high thermostability at temperature of 90 ˚C. The amylase from ITAAM 023M, at a temperature of 80˚C. The highest activity shown by ITAAM 010M amylase was 1.6 U / ml and the ITAAM 023M, 1.5 U / mL. From the 40 rhizobia, 17 grew well in culture medium containing starch, 19 produced amylolytic halo, and 11 proved to be thermophiles. Rhizobia INPA INPA R001 and INPA R020 showed the highest rates of amylolyse. Their amylase showed greater activity at 90˚C. Amylase of INPA R001 showed higher activity at 100˚C, and from INPA R020, 30˚C. Amylase from INPA R001 showed greater activity at pH 4.5 and from INPA R020, at pH 7.5. Their amylases showed high sensitivity to thermal shock. Amylase from INPA R020 showed higher thermostability at 90 °C and from INPA R001 at 100˚C. The higher activity shown by amylase of rhizobia INPA R001 was 1.6 U/mL, and from INPA R020, 7.5 U/mL / Um dos maiores sucessos da agricultura brasileira é o Pró-Álcool, cuja base de sustentação é a cultura da cana-de-açúcar, que deixa um lapso de atividade na entressafra. Em vista disso, diversas usinas vêm investindo em outras culturas, onde o amido é a fonte primária para a produção do álcool. A busca de amilases termotolerantes em Bacillus sp. e em rizóbios de solos da Amazônia é uma estratégia a ser usada para que as bioindústrias reduzam ou parem de importá-las. Foi feita a mutação de dois Bacillus sp. contendo amilases com exposição à luz ultravioleta. Foram testadas também, 40 estirpes de rizóbio quanto à presença de amilases termotolerantes. Foram feitos ensaios enzimáticos para a verificação de atividade amilolítica em diferentes temperaturas, tempos, pHs, choque térmico e termoestabilidade. O mutante de Bacillus sp. ITAAM 023M mostrou maior índice de amilolise do que o ITAAM 010M. As amilases dos dois mutantes de Bacillus sp e dos rizóbios mostraram-se bem diversificadas quanto às suas características, indicando serem diferentes umas das outras. A temperatura com maior atividade das amilases dos mutantes ITAAM 010M e ITAAM 023M foi 100˚C. A amilase do mutante ITAAM 010M mostrou maior atividade em 4,5, e a do ITAAM 023M em pH 7,5. Suas amilases mostraram alta sensibilidade ao choque térmico. A amilase do mutante ITAAM 010M mostrou maior termoestabilidade na temperatura de 90˚C. A do ITAAM 023M, na temperatura de 80˚C. A maior atividade mostrada pela amilase do ITAAM 010M foi de 1,6 U/mL e a do ITAAM 023M, 1,5 U/mL. Dos 40 rizóbios, 17 cresceram bem em meio de cultura contendo amido, 19 produziram halo amilolítico e 11 se mostraram termofílicos. Os rizóbios INPA R001 e INPA R020 mostraram os maiores índices de amilolise. Suas amilases mostraram maior atividade a 90˚C. A amilase do INPA R001 mostrou maior atividade a 100˚C, e a do INPA R020 a 30˚C. A amilase do INPA R001 mostrou maior atividade no pH 4,5 e a do INPA R020 no pH 7,5. Suas amilases mostraram alta sensibilidade ao choque térmico. A amilase do INPA R020 mostrou maior termoestabilidade a 90ºC e a do INPA R001 a 100˚C. A maior atividade amilolítica mostrada pela amilase do rizóbio INPA R001 foi de 1,6 U/mL e a do rizóbio INPA R020, 7,5 U/mL

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-30T18:51:47Z No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T18:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Enzymes of the xylanolytic complex, from microorganisms, have been an increasingly important biotechnological tool mainly in industrial processes that require high temperatures, such as in the baking industry, animal feed, textile, pulp and cellulose. Among the fungi producing thermostable enzymes, Thermomyces lanuginosus has been evidenced as a good producer of xylanases. In this context, xylanase from the recently isolated thermophilic fungus of the Paraná Atlantic Forest, T. lanuginosus, was purified, biochemically characterized, as well as a structureactivity correlation study of the enzyme was investigated through circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Extracellular xylanase was purified after four steps of ion exchange chromatographic columns and molecular filtration. The purity and molecular mass (21.3 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE and MALDI-TOF/MS. The xylanase is highly specific to the beechwood xylan substrate and generated mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3), products characteristic of the action of endoxylanase. The enzyme was able to cleave the xylooligosaccharides xylotetraose and xylopentaose, except xylobiose and xylotriose. It exhibit higher activity at pH 6.5 and temperature of 75°C, with stability between pH 5.0-8.0 for 100 hours and thermostability between 40 and 75°C for 5 hours. The deconvolution of the circular dichroism spectrum (CD) enzyme revealed a secondary conformation rich in β-structures with transition midpoint temperature (Tm) of 73.0  0.2°C. In this structural study, xylanase reveals that to perform high enzymatic activity, it was necessary a conformational change. Its secondary structure is conserved even at pH extremes at temperatures up to 70°C and in the presence of MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) and high concentration of guanidine (6 M). Intrinsic fluorescence reveals that the tertiary structure is influenced by pH, guanidine (1 M) associated with temperature and in the presence of MnCl2 and DTT, whereas extrinsic fluorescence, using the ANS probe, shows changes in pH extremes and in the presence of MnCl2 and DTT. Fluorescence results suggest that both the increased enzymatic activity in the presence of cofactors and the loss of activity at extreme pH values are related to changes in the tertiary structure of the enzyme. Thus, T. lanuginosus xylanase has interesting biochemical characteristics for application in several industrial sectors that mainly use high temperature conditions. / As enzimas do complexo xilanolítico, provenientes de microrganismos, têm se tornado uma ferramenta biotecnológica cada vez mais importante, principalmente em processos industriais que requerem temperaturas elevadas, como na indústria de panificação, de rações animais, têxtil, polpa e celulose. Dentre os fungos produtores de enzimas termoestáveis, Thermomyces lanuginosus tem se destacado como bom produtor de xilanases. Nesse contexto, a xilanase do fungo termofílico recentemente isolado da Mata Atlântica do Paraná, T. lanuginosus, foi purificada, caracterizada bioquimicamente, bem como um estudo de correlação estruturaatividade da enzima foi investigado através das espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. A xilanase extracelular foi purificada após quatro etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica e filtração molecular. A pureza e massa molecular (21,3 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE e MALDI-TOF/MS. A xilanase é altamente específica para o substrato xilano de beechwood e gerou principalmente xilobiose (X2) e xilotriose (X3), produtos característicos da ação de endoxilanase. A enzima foi capaz de clivar os xilooligossacarídeos xitotetraose e xilopentaose, exceto a xilobiose e xilotriose. Exibe maior atividade em pH 6,5 e temperatura de 75°C, com estabilidade entre os pH 5,0-8,0 durante 100 horas e termoestabilidade entre 40 e 75°C durante 5 horas. A deconvolução do espectro de dicroísmo circular (CD) da enzima revela uma conformação secundária rica em estruturas-β, com temperatura do ponto médio da transição (Tm) de 73,0  0,2°C. Neste estudo estrutural, a xilanase revelou que, para desempenhar elevada atividade enzimática, foi necessário ocorrer mudança conformacional. Sua estrutura secundária é conservada mesmo em extremos de pH, em temperaturas até 70°C e na presença de MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) e elevada concentração de guanidina (6 M). A fluorescência intrínseca revela que a estrutura terciária sofre influência do pH, guanidina (1 M) associado à temperatura e na presença de MnCl2 e DTT, enquanto a fluorescência extrínseca, utilizando a sonda ANS, revela mudanças em extremos de pH e na presença de MnCl2 e DTT. Os resultados da fluorescência sugerem que tanto o aumento da atividade enzimática na presença dos cofatores quanto a perda da atividade em valores extremos de pH relacionam-se às alterações da estrutura terciária da enzima. Dessa forma, a xilanase de T. lanuginosus possui características bioquímicas interessantes para aplicação em diversos setores industriais que utilizam principalmente condições de temperatura elevada.

Submitted by Ariane Souza (arianedocarmosouza@gmail.com) on 2018-08-14T02:02:56Z No. of bitstreams: 2 Ariane do Carmo Souza dissertação mestrado.pdf: 1195184 bytes, checksum: e6271bca7a0f0772ac6bb6269483b8fd (MD5) Carta para repositorio Ariane do Carmo Souza.pdf: 105567 bytes, checksum: 2517d898996d34fae9bd02b616df2176 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (ri.bar@ufscar.br) on 2018-08-17T12:57:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ariane do Carmo Souza dissertação mestrado.pdf: 1195184 bytes, checksum: e6271bca7a0f0772ac6bb6269483b8fd (MD5) Carta para repositorio Ariane do Carmo Souza.pdf: 105567 bytes, checksum: 2517d898996d34fae9bd02b616df2176 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (ri.bar@ufscar.br) on 2018-08-17T12:57:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ariane do Carmo Souza dissertação mestrado.pdf: 1195184 bytes, checksum: e6271bca7a0f0772ac6bb6269483b8fd (MD5) Carta para repositorio Ariane do Carmo Souza.pdf: 105567 bytes, checksum: 2517d898996d34fae9bd02b616df2176 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T19:25:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ariane do Carmo Souza dissertação mestrado.pdf: 1195184 bytes, checksum: e6271bca7a0f0772ac6bb6269483b8fd (MD5) Carta para repositorio Ariane do Carmo Souza.pdf: 105567 bytes, checksum: 2517d898996d34fae9bd02b616df2176 (MD5) Previous issue date: 2018-06-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The alternaria brown spot, caused by Alternaria alternata f sp. citri, causes large economic damages in tangor Murcott (Citrus sinensis Osbeck x Citrus reticulata [L.] Blanco). Its control is carried out through the spraying of agrochemicals, implying up to 15 pulverizations per year, which causes an increase in the production costs of the cultures and damages to the environment. As an alternative, the use of microorganisms, in particular Bacillus spp., has been used to diseases’ control. Therefore, the aim of this work was to evaluate the viability of Bacillus spp in in vitro and in vivo conditions. The methodologies were based on the interactions between biological control agents (Bacillus spp.) and the phytopathogen A. alternata, evaluated by the paired culture technique, by the production of volatile, thermostable and cell-free metabolites by different Bacillus spp. isolates. The molecular identification of the isolates tested and the efficacy of bacterial isolates were evaluated in leaves and plants under greenhouse conditions. The results showed that most of the isolates affected the development of phytopathogen and produced some types of metabolite, being antibiosis one of the probable mechanisms of action of the bacterium. The isolates ACB-01, ACB-07, ACB-08, ACB-18 and ACB-57 presented potential for disease control of A. alternata. / A mancha marrom de alternaria, causada por Alternaria alternata f sp. citri, causa grandes danos econômicos em tangor Murcott (Citrus sinensis L. Osbeck x Citrus reticulata [L.] Blanco). Seu controle é realizado através de pulverizações com agroquímicos, implicando em até 15 pulverizações por ano, o que acarreta em aumento no custo de produção da cultura e prejuízos ao meio ambiente. Como alternativa, o uso de microrganismos, em particular, as bactérias do gênero Bacillus spp., têm sido empregadas para o controle de doenças. Portanto, esse trabalho teve por objetivo avaliar em condições in vitro e in vivo a viabilidade de 47 isolados de Bacillus spp. para o controle da doença. As metodologias foram embasadas nas interações entre agentes de controle biológico (Bacillus spp.) e o fitopatógeno A. alternata avaliadas pela técnica de cultivo pareado, pela produção de metabólitos voláteis, termoestáveis e livre de células por diferentes isolados de Bacillus spp.. Realizou-se, ainda, a identificação molecular dos isolados testados e a eficácia dos isolados da bactéria em folhas destacadas e em plantas, sob condições de casa de vegetação. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos isolados afetou o desenvolvimento do fitopatógeno e produziram algum tipo de metabólito, sendo, a antibiose um dos prováveis mecanismos de ação da bactéria. Os isolados ACB-01, ACB-07, ACB-08, ACB-18 e ACB-57 apresentaram potencial para o biocontrole de A. alternata.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.