Les mitochondries sont le siège de la respiration cellulaire et possèdent un petit nombre de gènes essentiels dont l’expression est dirigée presque exclusivement par des protéines d’origine nucléaire. Les protéines de la famille PPR (PentatricoPeptide Repeat) font partie de ces acteurs et interviennent à toutes les étapes de l’expression des ARNs des organites, allant de la transcription à la traduction. De manière intéressante, les végétaux codent de nombreuses protéines PPR (environ 500 chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana), et sont de fait des modèles idéaux pour comprendre le rôle et le fonctionnement de ces protéines. Elles correspondent à des protéines de liaison aux ARNs très spécifiques, caractérisées par la présence de répétitions en tandem d’environ 35 acides aminés. Au sein de la famille PPR, le sous-groupe de gènes appelé « Restorer of Ferility Like » (ou RFL) s’oppose aux autres PPR car ils subissent une sélection diversifiante, et non purifiante, comme c’est le cas pour les PPR classiques. Certaines protéines RFL décrites chez d’autres espèces modèles telles que le riz ou encore le radis, appelées restauratrices de fertilité, inhibent l’expression de gènes mitochondriaux inducteurs de stérilité mâle. La famille RFL comporte 26 membres chez Arabidopsis thaliana.Afin de mieux comprendre la diversité fonctionnelle des gènes RFL, notre équipe a procédé à la caractérisation de l’ensemble des mutants rfl chez Arabidopsis, et seules les lignées affectées dans les gènes RFL22 et RFL23 affichent des altérations phénotypiques remarquables. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les protéines RFL22 et RFL23 pour comprendre leur rôle et leur mécanisme d’action moléculaire. L’étude des mutants rfl22 et rfl23 a montré que ces gènes sont essentiels pour la mise en place de la chaine respiratoire. Le mutant rfl22 ne produit plus de cytochromes de type c matures (ce qui affecte l’activité des complexes respiratoires III et IV), tandis que le mutant rfl23 n’accumule plus de complexe I de la chaine respiratoire.Après avoir adapté le protocole de profilage de ribosomes aux mitochondries de plantes, j’ai pu découvrir que les protéines RFL22 et RL23 étaient indispensables à la traduction d’ARNm mitochondriaux spécifiques : ccmFn₂ codant une sous-unité du complexe hème lyase et nad4L codant une sous-unité du complexe I, respectivement. D’autre part, j’ai pu cartographier in vivo et in vitro une région pouvant correspondre au site de liaison de la protéine RFL22 sur l’ARNm ccmFN2.Mes résultats révèlent que quelques rares gènes RFL remplissent des fonctions essentielles chez les Arabidopsis. Contrairement aux autres gènes PPR, la conservation fonctionnelle des gènes RFL22 et RFL23 apparait toutefois limitée aux Brassicaceae. Des modifications particulières dans l’organisation ou l’expression des génomes mitochondriaux de cette famille de plantes pourraient être à l’origine du recrutement de gènes RFL à évolution rapide pour maintenir une expression appropriée de certains gènes mitochondriaux. / Mitochondria are the siege of cellular respiration and code a small number of essential genes whose expression is governed almost exclusively by nuclear-encoded proteins. The proteins PPR family (PentatricoPeptide Repeat) belong to these actors and intervene at all stages of RNAs expression in organelles, from transcription to translation. Interestingly, plants encode numerous PPR proteins (about 500 in the model specie Arabidopsis thaliana), and are therefore ideal models for understanding the role and function of these proteins. They correspond to very specific RNA binding proteins, characterized by the presence of tandem repeats of about 35 amino acids. Within the PPR family, a subgroup of genes called Restorer of Ferility Like (RFL) is opposed to other PPR because they undergo a diversifying, non-purifying selection, as is the case for classical PPR. Some RFL proteins described in other model species such as rice or radish, are known as fertility restorers, and inhibit the expression of mitochondrial genes inducing male sterility. The RFL family consists in 26 members in Arabidopsis thaliana.In order to better understand the functional diversity of RFL genes, our team has characterized all rfl mutants in Arabidopsis, and only two of them, affected in RFL22 and RFL23 genes display remarkable phenotypic alterations. During my thesis, I characterized RFL22 and RFL23 proteins to understand their role and molecular mode of action. The study of the mutants rfl22 and rfl23 showed that these genes are essential for the establishment of the respiratory chain. The mutant rfl22 no longer produces mature c-type cytochromes (which affects the activity of respiratory complexes III and IV), whereas the mutant rfl23 no longer accumulates complex I of the respiratory chain.After adjusting the ribosome profiling protocol to plant mitochondria, I discovered that RFL22 and RL23 proteins were essential for specific mitochondrial mRNAs translation : ccmFN2 mRNA encoding a subunit of heme lyase complex and nad4L transcript encoding a subunit of complex I. Furthermore, I was able to map a region in vivo and in vitro that could correspond to the binding site of the RFL22 protein on the ccmFN2 mRNA.My results show that a few rare RFL genes perform essential functions in Arabidopsis. By opposition to other PPR genes, the functional conservation of RFL22 and RFL23 genes appears limited to Brassicaceae. Specific modifications in organization or expression of the mitochondrial genomes of this family of plants could be at the origin of the recruitment of rapidly changing RFL genes to maintain proper expression of certain mitochondrial genes.

L'expression des ARN mitochondriaux et chloroplastiques des plantes implique un grand nombre de modifications post-transcriptionnelles, parmi lesquelles l'épissage des introns est un processus essentiel. Sur la base de leur structure et des mécanismes d'épissage associés, les introns peuvent être classés en deux familles et ceux présents dans les organites des plantes appartiennent au groupe II. Les introns mitochondriaux et chloroplastiques de groupe II sont fortement dégénérés et ont perdu la capacité de s'auto-épisser in vivo. Leur élimination nécessite l’action de nombreux facteurs protéiques codés dans le noyau et importés dans les organites. Les protéines de liaison à l'ARN jouent un rôle prédominant dans ce processus complexe. Les protéines ribosomales sont des protéines abondantes se liant à l'ARN et peuvent être recrutées pour remplir diverses fonctions annexes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la fonction des protéines de type uL18 chez Arabidopsis, qui comprend 8 membres. Ces protéines partagent un domaine uL18 plutôt dégénéré, mais dont la structure est conservée, et dont la fonction initiale est de permettre l’association avec l’ARNr 5S. Nos résultats ont montré que cinq protéines de type uL18 sont adressées aux mitochondries et trois aux chloroplastes. Deux d’entre elles correspondent à de véritables protéines ribosomales uL18 associées aux ribosomes des organites, tandis que deux autres (uL18-L1 et uL18-L8) se sont transformées en facteurs d'épissage et sont nécessaires à l'élimination d’introns mitochondriaux ou chloroplastiques spécifiques. L'analyse d'un troisième membre de la famille, uL18-L5, a révélé qu'il participait à l'épissage de nombreux introns mitochondriaux. Mes résultats ont permis de révéler que les facteurs dérivés des protéines ribosomales uL18 jouent un rôle essentiel dans l’épissage des introns du groupe II mitochondriaux ou chloroplastiques chez les végétaux et que ces fonctions ciblent sot un seul intron ou bien plusieurs d’entre eux. / RNA expression in plant organelles implies a large number of post-transcriptional modifications in which intron splicing is an essential process. Based on RNA structures and splicing mechanisms, introns can be classified into two families and organellar introns of seed plants are categorized as group II. Organellar group II introns are highly degenerate and have lost the ability to self-splice in vivo. Their removal from transcripts is thus facilitated by numerous nuclear-encoded proteins that are post-translationaly imported into organelles. Among them, RNA binding proteins play predominant roles in this complex process. Ribosomal proteins are abundant RNA-binding proteins and could be recruited to carry out multifarious auxiliary functions. During my thesis, I investigated the function of the uL18 ribosomal-like protein family in Arabidopsis that comprises 8 members. The members of this protein family share a rather degenerate but structurally conserved uL18 domain whose original function is to permit association with the 5S rRNA. Our results showed that five uL18-Like proteins are targeted to mitochondria and three to chloroplasts. Two of these proteins correspond to real ribosomal uL18 proteins that incorporate into organellar ribosomes, while two other members (uL18-L1 and uL18-L8) have turned into splicing factors and are required for the removal of specific mitochondrial or plastid group II introns. The analysis of a third member, uL18-L5, revealed that it participated in the splicing of numerous mitochondrial introns. Our results revealed that uL18-like factors play essential roles in group II intron splicing in both mitochondria and plastids of plants and that these functions could target a single or multiple introns.

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés « NGT » pour « Nouvelles GlycosylTransférases », présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes α-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1). / The plant cell wall not only defines the unique biology of the plants but also have practical applications as feedstock for biomaterials and for the production of biofuels. Plant primary cell wall is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and pectins. Significant progress has been made recently in identifying the enzymes involved in plant cell wall biosynthesis, but only a handful of those have been involved in pectin biosynthesis. With the aim of identifying new putative glycosyltransferases (GTs), in lab Hansen et al 2009 designed a bioinformatic strategy and identified a new group of 24 genes called “NGT” for (Novel Glycosyltransferase) which were considered “strong” candidates for putative glycosyltransferase activities. In order to determine the putative role of these NGT genes in plant cell wall biosynthesis, we designed a functional genomics strategy, analysing in parallel Arabidopsis T-DNA mutant lines and performing heterologous expression of candidate genes. I have characterized 15 homozygous mutant lines among the group of 24 putative NGT genes through PCR. We analysed the homozygous mutants for phenotypic alteration such as dwarfing or organ malformation and found that some of mutant lines have narrow leaves as compared to Wild type plants. In parallel I have carried out the cell wall chemical analysis of 12 homozygous mutant lines and did not get any strong difference in neutral monosaccharide composition. The detailed and complete analysis (chemical, expression and microscopic analysis) of all the above mentioned genes could have been time consuming and an overwhelming work, so I focused on At5g28910 (named NGT1) which harbours a fucosyltransferase peptide signature and on At5g14550 (named P), a gene belonging to the DUF266 gene family. Homozygous T-DNA mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 lines were analyzed and showed a reduced growth phenotype (leaf area). Leaf area was quantified at various development stages using ImageJ, and showed a 38% reduction in mutants. Additionally, biochemical characterization of the cell wall was performed showing a reduction in neutral monosaccharide contents, like arabinose, rhamnose and galactose in mutant cell wall. Furthermore glycosyl linkage analysis of mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 has shown that 5-Arabinofuranose (5-Araf) and 3,5-Arabinofuranose (3,5-Araf ) contents were decreased as compared to Wild type Col0 cell wall. These results were also confirmed by immunolabeling of stem cross section of mutant and wild type plants. The complementation of the mutant plants through Agrobacterium transformation resulted in the complete restoration of plant phenotype. Taken together, these data suggest that NGT1 could be an arabinosyltransferase. In order to characterize its biochemical activity, the NGT1 protein was heterologously expressed in Pichia pastoris. The recombinant protein was used to perform in vitro activity tests, but we were unable to demonstrate any neither fucosyltransferase (on the basis of peptide signature) nor arabinosyltransferase activity. In parallel to this study, I contributed to the heterologous expression and characterization of two biochemically characterized Arabidopsis GTs involved in xyloglucan synthesis: the fucosyltransferase (AtFUT1) and xylosyltransferase (AtXT1). I have successfully expressed a truncated and active form of AtFUT1, which represents an essential step for further structural studies that will be undertaken in the lab.

Les modifications de la chromatine jouent un rôle fondamental dans le contrôle de l’expression des gènes de stress et la mise en place d’une réponse physiologique appropriée en réponse aux signaux environnementaux. Les complexes répressifs polycomb (PRC pour Polycomb Repressive Complexes), PRC1 et PRC2 permettent la répression des gènes via le dépôt des marques H3K27me3 et H2AUb. Ce projet de thèse vise à explorer le rôle de la protéine LHP1, une sous-unité du complexe PRC1 chez Arabidopsis thaliana, dans la régulation de l’homéostasie de la marque H3K27me3 et des voies de signalisation activées par les stress. Nous avons utilisé une approche intégrative pour identifier les réponses immunitaires dé-régulées dans le mutant lhp1 ; mettant ainsi en évidence le rôle de la protéine LHP1 dans la répression de la branche dépendante de MYC2 de la signalisation par l’Acide Jasmonique et l’éthylène. La perte de la protéine LHP1 induit une baisse du niveau de la marque H3K27 me3 dans le corps des gènes ANAC019 et ANAC055, ce qui augmente leur expression et la dérégulation de leurs cible, conduisant ainsi à une résistance accrue aux pucerons, ainsi qu’à une sensibilité plus importante à l’ABA et à une meilleure tolérance à la sècheresse. D’autre part, l’activation de cette voie de signalisation dans le mutant lhp1 induit une baisse d’accumulation de l’Acide Salicylique (SA), due à la dé-régulation des gènes ICS1 et BSMT1, ainsi qu’à une sensibilité accrue au pathogène hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Afin de mieux comprendre la fonction moléculaire de LHP1, nous avons étudié son interaction génétique avec l’histone déméthylase REF6. Nous avons analysé des données de ChIP-seq menées dans les mutants lhp1 et ref6 ainsi que dans le double mutant à la lumière des phénotypes développementaux et physiologiques de ces lignées, mettant ainsi en évidence le rôle complexe de LHP1 dans l’homéostasie de la marque H3K27me3. D’après ces résultats, nous proposons que d’une part, LHP1 est requise pour le recrutement d’histone méthyltransférases sur certains gènes afin de permettre le dépôt de la marque, et que d’autre part, LHP1 protège d’autre loci de l’activité de déméthylases telles que REF6. Nous avons aussi étudié les mécanismes conduisant à une augmentation des niveaux de H3K27me3 sur certains gènes dans le mutant lhp1, et montrons que LHP1 réprime le gène MEA. L’expression ectopique de ce gène dans les tissus somatiques du mutant lhp1 est probablement responsable de l’hyper-méthylation de nombreux loci. Ce groupe de gènes hyper-méthylés dans le mutant lhp1 est enrichi en gènes annotés comme étant impliqués dans les réponses immunitaires, affectant ainsi la régulation transcriptionnelle des gènes de défense, ce qui contribue à la sensibilité accrue du mutant lhp1 aux pathogènes nécrotrophes. Ainsi, nous proposons que l’homéostasie de la marque H3K27me3 est essentielle au développement harmonieux ainsi qu’aux réponses immunitaires de la plante, et que LHP1 contribue au maintien de l’équilibre entre diverses voies de réponse au stress et les processus de croissance. / Chromatin modifications and regulation play a major role in the expression of stress-responsive genes and the instauration of appropriate physiological responses to environmental cues in plants. Polycomb Repressive Complexes (PRCs), PRC1 and PRC2,are involved in the repression of protein-coding genes through the deposition of H3K27me3 and H2Aub. This thesis project explores the role of LHP1, an Arabidopsis thaliana PRC1 protein, in the regulation of H3K27me3 homeostasis and stress-responsive signaling pathways. We used an integrative approach for the identification of immune related pathways de-regulated in the lhp1 mutant, finding that LHP1 is required for the repression of the MYC2 branch of jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) pathway of immunity. Loss of LHP1 induces the reduction in H3K27me3 levels in the gene bodies of ANAC019 and ANAC055, leading to their up-regulation and the mis-regulation of their downstream targets, increasing aphid resistance, ABA sensitivity and drought tolerance in Arabidopsis.On the other hand, the up-regulation of this pathway in lhp1 reduces Salicylic Acid (SA) content caused by a de-regulation of ICS1 and BSMT1, as well as increased susceptibility to the hemibiotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.In order to deepen our comprehension of the molecular role of LHP1, we studied the genetic interaction between this histone reader and the REF6 demethylase. We integrated ChIP-seq, developmental and physiological data of the single lhp1 and ref6 mutants, as well as their respective double mutant, finding that LHP1 plays different roles in the regulation of H3K27me3 homeostasis. Based in on our results we propose that on the one hand, LHP1 is necessary for the recruitment of histone methyltransferases to certain genes to promote the deposition of H3K27me3, while in some other targets it protects this histone mark from the demethylase activity of REF6. We also addressed the phenomenon of H3K27me3 gain in lhp1, and we provide evidence for the role of LHP1 in the repression of MEA, a gene that is de-repressed in the lhp1 mutant and may contribute to the ectopic hyper-methylation of several loci. This set of hyper-methylatedloci in lhp1 is enriched in immune-related genes, impacting the transcriptional regulation of immune responses, a process that contributes to the increased lhp1 susceptibility to necrotrophic pathogens. Therefore, we propose that H3K27me3 homeostasis is a key phenomenon behind developmental and innate immune processes in Arabidopsis, and that LHP1 plays a role as a keeper of the trade-off between diverse stress signaling pathways but also between these and developmental programs.

A la lumière, l’activité carboxylase de la RuBisCO permet de fixer le CO2 inorganique en matière organique, sous forme de 3-phosphoglycérate (3-PGA), qui sera utilisé pour la biosynthèse de sucres, d’acides organiques et aminés, de la paroi végétale etc. Cependant, elle possède aussi une activité oxygénase qui produit du 3-PGA et du 2-phosphoglycolate. Ce dernier composé étant toxique, il est métabolisé en 3-PGA par le cycle photorespiratoire qui se déroule dans le chloroplaste, le peroxysome et la mitochondrie. Malgré une perte partielle en carbone et en azote, l’importance de la photorespiration pour les plantes est illustré par les phénotypes néfastes que les mutants d’enzymes photorespiratoires présentent dans l’air (comme un retard de croissance, la chlorose, et de la létalité) et qui sont absents en fort CO2. Ceci pourrait refléter des interactions étroites entre la photorespiration et le métabolisme primaire des plantes. Afin de mieux comprendre ces interactions et la mise en place des phénotypes photorespiratoires, des mutants pour la glycolate oxydase (GOX) et la glutamate:glyoxylate aminotransférase ont été caractérisés à travers plusieurs analyses complémentaires: des échanges gazeux, de la fluorescence chlorophyllienne, du marquage des métabolites avec du 13C, des dosages de métabolites, de cofacteurs, et de la RuBisCO. Les résultats montrent que, suite à un transfert de fort CO2 dans l’air, l’inhibition de la photosynthèse observée chez nos mutants est principalement due à un défaut du recyclage du carbone photorespiratoire qui diminue l’activité de la RuBisCO. Cette inhibition photosynthétique a un impact négatif sur la quantité de RuBisCO dans les feuilles de ces mutants par rapport aux plantes contrôles. De plus, lorsque l’inhibition de la photosynthèse est trop importante chez nos mutants photorespiratoires, la carence en carbone déclenche de la sénescence dans leurs feuilles âgées. En parallèle, une comparaison des paramètres cinétiques de la GOX d’A. thaliana (plante en C3) et de Z. mays (plante en C4) associée à la mesure d’effets isotopiques 13C et 2H a révélé que ces enzymes partageaient des paramètres Michaéliens équivalents pour le glycolate, ainsi qu’un mécanisme réactionnel identique mettant en jeu un transfert d’hydrure. / In the light, the RuBisCO carboxylase activity assimilates inorganic CO2 into organic compounds, via the production of 3-phosphoglycerate (3-PGA) that is used for the biosynthesis of sugars, organic and amino acids, plant cell walls etc. However, it also has an oxygenase activity that makes 3-PGA and 2-phosphoglycolate (2-PG). The toxic 2-PG is metabolized to 3-PGA by the photorespiratory cycle, which takes place in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Despite a partial loss of carbon and nitrogen, the importance of photorespiration for growth can be seen by the negative phenotypes exhibited by photorespiratory enzyme mutants in air (i.e. slow growth, leaf chlorosis, and sometimes lethality), which are not observed under high CO2 conditions. This may reflect the metabolic interactions between photorespiration and plant primary metabolism. To better understand such interactions and the development of photorespiratory phenotypes, mutants for glycolate oxidase (GOX) and glutamate:glyoxylate aminotransferase have been characterized by several complementary methods: analysis of gas exchanges, chlorophyll fluorescence,13C-labeling of metabolites, measurements of metabolites, cofactors and RuBisCO levels. The results show that, after a high CO2-to-air transfer, the inhibition of photosynthesis in the mutants is mainly due to a defect in photorespiratory carbon recycling leading to a decreased RuBisCO activity. The inhibition of carbon assimilation negatively impacts mutant leaf RuBisCO content when compared to wild-type plants. In the mutants, when photosynthetic inhibition is too high, the resulting carbon starvation triggers the onset of senescence in their old leaves. In parallel to this work, a comparison of the kinetic parameters of GOX from A. thaliana (C3 plant) and Z. mays (C4 plant) coupled to measurements of 13C and 2H kinetic isotopic effects showed that these enzymes share similar Michaelian parameters for glycolate, and a similar hydride transfer reaction mechanism.

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne sont des parasites obligatoires des plantes capables d’infecter un large panel de plantes d’intérêt agronomique. Ces parasites ont la capacité d’induire la différenciation de cinq à sept cellules racinaires en cellules géantes, hypertrophiées, métaboliquement actives et multinucléées. Ces cellules géantes constituent le site nourricier indispensable au nématode, et sur lequel il va s’alimenter jusqu’à sa reproduction. Le développement de ces cellules entraine une déformation racinaire appelée « galle » qui va perturber l’absorption de nutriments de la plante et l’affaiblir. Des études transcriptomiques ont montré qu’une vaste reprogrammation transcriptionnelle a lieu lors de la formation de la galle. Cette thèse vise à caractériser le rôle des petits ARN, des ARN non codants, au cours de la formation des galles induites par M. incognita. Les petits ARN non codants sont des régulateurs clés de l’expression génique et comprennent deux grandes familles : les microARN (miARN) et les petits ARN interférents (siARN). Pour cela, les petits ARN de racines de la plante modèle Arabidopsis thaliana saines et infectées par le nématode à galle M. incognita ont été caractérisés par séquençage haut débit à 7 et 14 jours après infection, deux stades importants du développement des cellules géantes. Cette étude a permis d’identifier 24 miARN d’Arabidopsis différentiellement exprimés dans les galles en comparaison aux racines non infectées. L’analyse fonctionnelle de ces miARN a permis de valider le profil d’expression dans les galles de cinq miARN et de démontrer le rôle de miR159 dans la réponse de la plante à M. incognita. De plus, une approche pangénomique a été réalisée afin d’identifier les gènes susceptibles d’être régulés par les siARN lors de l’interaction. En conclusion, ce travail a contribué à démontrer d’une part l’implication des miARN dans l’interaction plante - nématode à galles et a permis l’identification des gènes potentiellement régulés par les siARN lors de l’interaction et impliqués dans la formation des cellules géantes induites par les nématodes à galles. / Root-Knot-Nematodes are obligate plant parasites able to infect a large panel of cultivated plants. These parasites have the ability to induce redifferentiation of five to seven root cells into specialized giant cells, hypertrophied, multinucleated and metabolically overactive. These giant cells form the feeding site upon which nematodes feed continuously until reproduction. Giant cells development leads to a root deformation, named gall, which disturbs plant nutrients absorption causing its weakening. Transcriptomic studies showed that a huge transcriptional reprogramming occurs during gall development. This project aims to characterize the role of small RNAs, non-coding RNAs, during gall development induced by M. incognita. Small non-coding RNAs are key regulators of gene expression and include two major families: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs). Thus, small RNAs from roots of the model plant Arabidopsis thaliana healthy or infected by M. incognita were characterized by Next Generation Sequencing at 7 and 14 days after infection, two important stages of gall development. This study led to the identification of 24 plant microRNAs differentially expressed in galls compared to uninfected roots. Functional analysis of these miRNAs validated the expression pattern in galls of five miRNAs and demonstrated the role of miR159 in the plant response to M. incognita. In addition, a genome-wide approach was used to identify genes that could be regulated by siRNAs during the interaction. In conclusion, this work contributed todemonstrate, on one hand, the involvement of microRNAs in the plant - RKN interaction and allowed the identification of genes potentially regulated by small interfering and involved in the formation of giant cells induced by root-knot nematodes.

La régénération in vitro est un processus complexe largement utilisé pour la multiplication végétative ainsi qu'en recherche fondamentale pour étudier l'organogenèse. Malgré les diverses applications de la caulogenèse in vitro, les mécanismes de régulation impliqués restent mal caractérisés. Avant le début de mon doctorat, nous avons identifié un mutant d'Arabidopsis thaliana chez lequel un défaut du complexe I de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (CTEm) entraîne une augmentation du taux de régénération comparé au sauvage, mesurée sur des cals issus de protoplastes. Au début de mon projet doctoral, j'ai confirmé le lien entre le dysfonctionnement respiratoire et l'augmentation des taux de régénération en utilisant un inhibiteur spécifique du complexe I appelé roténone. Pour comprendre ce phénomène, j'ai étudié les mécanismes moléculaires et biochimiques liant la respiration mitochondriale et l'organogenèse in vitro. J'ai analysé différents mutants affectés dans l'activité du complexe I et conclu que le retard de croissance qui en découle est positivement corrélé avec le taux de régénération. Pour comprendre comment les perturbations de la CTEm affectent la formation des bourgeons, j'ai comparé les profils d'expression des gènes dans des tissus mutants du complexe I et dans des cals traités avec la roténone. Les résultats obtenus montrent, d’une part, que le profil d’expression des gènes est différent chez le sauvage et chez les mutants du complexe I et, d’autre part, que la roténone induit un stress oxydatif, inhibe la prolifération cellulaire et module les régulations hormonales. J'ai confirmé que la réponse oxydative induite par la roténone est rapidement relayée dans le cytosol en utilisant un bio-senseur de l’état redox cellulaire. Nos résultats suggèrent un lien de causalité entre un stress oxydatif induit par des perturbations respiratoires et la hausse du taux de régénération. Nos travaux pointent vers des méthodes alternatives pour améliorer l'efficacité de l'organogenèse in vitro par inhibition transitoire d'activités mitochondriales. / In vitro shoot regeneration is a complex process routinely used for vegetative propagation and to study plant organogenesis. Despite multiple applications of in vitro shoot initiation, the regulatory mechanisms involved remain poorly understood. Prior to the beginning of my PhD thesis, we identified an Arabidopsis thaliana mutant in which a defect in the complex I of the mitochondrial electron transport chain (mETC) results in a higher shoot regeneration rate compared to wild type, measured on protoplast-derived calli. At the beginning of my PhD project, I confirmed the link between the respiratory defect and the shoot regeneration boost with a specific complex I inhibitor called rotenone. To understand this phenomenon, I investigated the molecular and biochemical mechanisms linking mitochondrial respiration and shoot organogenesis. For this purpose, I analyzed different mutants affected in the complex I activity and concluded that the resulting growth retardation is positively correlated with the regeneration rate. To understand how mETC perturbations promote shoot regeneration, I compared gene expression profiles in complex I mutant tissues and in calli treated with rotenone. Our data show, on the one hand, that gene expression profiles are different in complex I mutants and, on the other hand, that rotenone induces an oxidative stress, inhibits cell proliferation, and modulate hormonal regulations. I confirmed that the oxidative response induced by rotenone is rapidly relayed in the cytosol with a redox- sensitive biosensor. Altogether, our results suggest a causal link between an oxidative stress caused by respiratory impairments and shoot regeneration enhancement. Our findings point to alternative methods to promote in vitro organogenesis via transient inhibition of mitochondrial activities.

Le cuivre (Cu) est un nutriment essentiel à la vie des organismes mais aussi, lorsqu’il est présent en excès, un constituant toxique de la cellule. Pour faire face à des concentrations élevées en Cu dans l’environnement, les plantes ont développé des mécanismes complexes d’homéostasie et de tolérance au Cu. L’objectif de ce travail est d’apporter une contribution à la compréhension de ces mécanismes en utilisant la plante modèle Arabidopsis thaliana. Dans un premier temps, nous avons montré que l’excès de Cu2+ entraînait une réorganisation de l’architecture du système racinaire caractérisée par une inhibition de la croissance de la racine primaire et l’augmentation de la densité de racines latérales. Nous avons mis en évidence plusieurs processus métaboliques qui pourraient être impliqués dans cette réorganisation, tels que des changements dans l’homéostasie minérale, le statut hormonal, et la production de lignine. Une approche de génétique classique a ensuite été entreprise afin de mieux comprendre les composants moléculaires impliqués dans cette réponse. Un criblage de mutants a été effectué sur excès de Cu2+ dans le but d’isoler des mutants présentant un phénotype racinaire altéré par le Cu2+. Un mutant sensible au Cu2+ (appelé cop29) a été sélectionné en raison de sa forte inhibition de croissance racinaire sur excès de Cu2+. Le clonage positionnel du mutant, combiné avec des approches génomiques, a permis d’identifier le gène At3g14190 comme étant le gène muté responsable du phénotype de cop29. Ce gène encode une protéine de fonction encore inconnue. La caractérisation phénotypique de cop29 a révélé que le mutant était également sensible à l’excès de Zn2+, Mn2+ et Na+. De plus, nous avons montré qu’en présence d’un excès de Cu2+ ou de NaCl le mutant présentait des concentrations en K+ significativement plus faibles que le type sauvage. Etant donné que le maintien de l’homéostasie du K+ joue un rôle essentiel dans la tolérance des plantes à l’excès de Cu ou de NaCl, nous avons émis l’hypothèse que ces faibles concentrations en K+ pourraient être la cause du phénotype de cop29. Par ailleurs, l’utilisation des banques de données génomiques et protéomiques a mis en avant que la protéine COP29 pourrait également jouer un rôle dans la régulation du cycle cellulaire. Les perspectives consisteront à découvrir la fonction de la protéine COP29 et contribueront ainsi à mettre en évidence un nouveau composant moléculaire impliqué dans la tolérance des plantes aux stress. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

published_or_final_version / abstract / Botany / Master / Master of Philosophy

The inhibitory effects of NaCl, L- and D-asparagine, and asparagine substrate analogs, beta-aspartyl hydroxamate (AAH) and albizziin, alone or in combination on Columbia Arabidopsis seed germination and seedling survival were characterized under aseptic conditions. Germination on an agar medium supplemented with inorganic nutrients was prevented by 200 mM NaCl, 20 mM L-asparagine, 60 mM D-asparagine, 1.4 mM AAH, or 8 mM albizziin. Established seedlings were generally more tolerant to these chemicals than germinating seeds. Exogenous L- and D-asparagine partly reversed the inhibitory effects of NaCl on seed germination. L-asparagine also partly reversed AAH inhibition of germination. A M2 seed bank was created from the self-pollinated progeny of ethyl methane sulfonate treated seeds. Arabidopsis mutants having increased tolerance to NaCl and AAH, but not albizziin, were successfully selected from this seed bank.