A leprose dos citros, principal doença viral que afeta a citricultura no Brasil, é causada pelo Citrus leprosis virus C (CiLV-C, gênero Cilevirus). CiLV-C possui um genoma bipartido de RNA de fita simples, polaridade positiva, que codifica para seis proteínas. O vírus é transmitido de planta a planta por ácaros Brevipalpus phoenicis e pode infectar mais de 40 espécies vegetais, produzindo lesões localizadas cloróticas ou necróticas ao redor do sítio de inoculação pelo ácaro. Invariavelmente, o patógeno não realiza movimento sistêmico em nenhuma de suas hospedeiras conhecidas. Para se revelar os mecanismos moleculares que determinam a atípica interação vírus/ácaro/planta, as atividades das principais vias de defesa foram avaliadas durante a infestação de A. thaliana com ácaros avirulíferos e virulíferos para o CiLV-C. A expressão de 19 genes marcadores associados às respostas de defesa do hospedeiro foi verificada mediante PCR quantitativo (RT-qPCR) em um experimento de time course (6, 12 e 24 horas após a infestação, e no momento do aparecimento dos sintomas de leprose). As análises demostraram que os genes envolvidos na via do ácido salicílico (SA) foram induzidos durante a interação com o ácaro e com o vírus. O perfil de expressão dos genes desta via durante a infestação com ácaros virulíferos foi similar ao observado com ácaros avirulíferos, porém a resposta da planta a ambos os estímulos foi mais intensa. Ademais, ambas as vias do ácido jasmônico e etileno foram ativadas durante a interação com o ácaro e reprimidas ao longo da infecção com o vírus, sugerindo uma interferência antagonística mediada pela via do SA. O mecanismo de silenciamento de RNA foi regulado de maneira diferencial em resposta à interação com ácaros avirulíferos e virulíferos. Diante da infecção viral, em tempos iniciais da infecção, as plantas responderam com a ativação de uma primeira linha de defesa mediada por AGO1, e depois alternaram para uma segunda linha de defesa mediada por AGO2. Os resultados indicam a ativação de um processo multifatorial em resposta ao CiLV-C e ao ácaro B. phoenicis em A. thaliana. / Citrus leprosis, the main viral disease affecting citrus orchards in Brazil, is caused by Citrus leprosis virus C (CiLV-C, genus Cilevirus). CiLV-C has a bipartite genome of singled stranded positive RNA, which encodes six proteins. CiLV-C is plant-to-plant transmitted by Brevipalpus phoenicis mites and can infect more than 40 plant species, invariably producing localized chlorotic or necrotic lesions around the site of feeding of the viruliferous mites. Viral long distance movement in its hosts is not accomplished. To unveil the mechanisms determining the unique characteristic of the virus/mite/plant interaction, activities of main plant defense pathways were evaluated during aviruliferous and CiLV-C viruliferous mite infestation in Arabidopsis thaliana. The expression of 19 marker genes involved in defense responses along a time course experiment (6, 12 and 24 hours after infestation, and after appearance of leprosis symptoms) was assessed by RT-qPCR. Analyses showed that genes involved in the salicylic acid (SA) pathway were up-regulated during plant interaction with mite and virus. The SA pathway expression profile observed at the infestation by viruliferous mites resembled those observed for the aviruliferous mites, but plant response to both stimuli was stronger. Both the jasmonic acid and ethylene pathways were activated during mite/plant interaction and were repressed at the course of infection with CiLV-C, suggesting an antagonistic effect mediated by the activated SA pathway. Gene silencing mechanism was differentially regulated in response to both aviruliferous and viruliferous mites. Upon viral infection, plants responded with the activation of an AGO1-mediated first defense line, in early times of infection; and then switched to an AGO2-mediated defense. Results indicate the activation of a multifactorial process in response to CiLV-C and B. phoenicis mites in A. thaliana.

La cuticule est une couche hydrophobe déposée à la surface des organes aériens des plantes terrestres. Elle joue de nombreux rôles allant de la résistance face à divers stress biotiques et abiotiques à son implication dans divers processus de développement. Bien que la compréhension de la biosynthèse des composés cuticulaires a considérablement augmenté ces dernières années, les mécanismes de transport de ces lipides cuticulaires à travers la paroi et d'assemblage au sein de la cuticule, sont encore peu caractérisés. Les nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Protein), sont codées par une famille multigénique impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques. Parmi les rôles proposés pour les nsLTPs, il est supposé depuis longtemps qu'elles pourraient transporter les précurseurs cuticulaires à travers la paroi et ainsi contribuer à la formation de la cuticule. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes servis du modèle des hypocotyles étiolés d'A. thaliana afin de caractériser le fonction biologique d'AtLTP2. En effet, AtLTP2 est une protéine de transfert de lipides présente de façon abondante et est la seule représentante des nsLTPs dans le protéome pariétal des hypocotyles étiolés. Nous avons tout d'abord confirmé que l'expression d'AtLTP2 est forte dans les très jeunes stades de développement de la plantule étiolée et est restreinte aux cellules de l'épiderme des organes aériens, sur lesquelles se dépose la cuticule. Conformément aux résultats de protéomique obtenus au préalable, AtLTP2 fusionnée à un marqueur fluorescent est localisée au niveau de la paroi mais également et de façon surprenante au niveau des plastes. Cette remarquable double localisation d'une nsLTP dans la paroi et dans les plastes n'a à ce jour, jamais été décrite. De plus, le mode de transport d'AtLTP2 vers les plastes est particulièrement original puisque la protéine emprunte d'abord la voie de sécrétion avant d'être finalement adressée aux plastes. En analysant l'adressage de différentes versions d'AtLTP2 tronquée, nous avons pu montrer que c'est certainement sa conformation tertiaire qui est cruciale pour sa localisation plastidiale. Par des approches de génétique inverse, nous avons pu montrer que les mutants atltp2 présentaient une augmentation importante de la perméabilité de sa cuticule fortement corrélée à une ultrastructure de l'interface cuticule-paroi très perturbée alors qu'aucun changement dans la composition biochimique de la cuticule n'a été détecté. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau rôle structural pour AtLTP2, elle interviendrait pour maintenir l'adhésion des deux couches que sont la cuticule hydrophobe et la paroi hydrophile. Ainsi, en maintenant l'intégrité de l'interface entre la cuticule et la paroi, AtLTP2 participerait au maintien de la fonction de barrière cuticulaire limitant les pertes d'eau. De façon intéressante, la double localisation d'AtLTP2 dans la paroi et les plastes nous laisse supposer que d'autres fonctions pourraient être assignées à AtLTP2. L'identification des mécanismes moléculaires mis en jeu dans le maintien de l'homéostasie cuticule-paroi et dans la double localisation d'AtLTP2 constituera un challenge pour de futures recherches visant à toujours mieux identifier les acteurs de la formation de cette barrière protectrice, la cuticule. / The cuticle is a hydrophobic layer that covers the surface of the aerial organs of land plants. The cuticle plays numerous roles in plants from resistance against biotic and abiotic stresses to several developmental processes. Although the understanding of the biosynthesis of cuticle has considerably increased last years, the mechanisms underlying the transport of cuticular lipids through the cell wall and their assembly within the cuticle have been poorly characterized. nsLTPs (non-specific Lipid Transfer Proteins) are encoded by a multigenic family in A. thaliana and are involved in several biological processes. Among the different roles proposed for nsLTPs, it has long been suggested that they could transport cuticular precursor across the cell wall and then could contribute to the cuticle formation, despite the absence of formal evidence for individual members. Here we took advantage of the A. thaliana etiolated hypocotyls model to characterize the biological function of AtLTP2. Indeed, AtLTP2 was found to be abundant and the unique nsLTP member in the cell wall proteome of etiolated hypocotyls. We have first confirmed the high level of AtLTP2 expression during the young developmental stages of etiolated seedlings that was restricted to the epidermal cells of aerial organs, that are covered by the cuticle. In agreement with the cell wall localization determined by previous proteomic studies, we localized AtLTP2 fused to a fluorescent marker to the cell wall, but also and surprisingly to the plastids. This remarkable dual localization in the cell wall and plastids was never described before for a nsLTP. Furthermore, the mechanism of AtLTP2 transport to the plastids was particularly original because AtLTP2 can first undergo import into the ER/ secretory pathway and then sorting to the cell wall and the plastids. By studying the sub-cellular localization of truncated version of AtLTP2, we have shown that its tertiary conformation was crucial for the plastidial localization. By using reverse genetic approaches, we have shown that atltp2 mutants displayed a high increase in cuticle permeability strongly correlated with a deep modification of the ultra-structure at the cuticle-cell wall interface, while no changes in biochemical composition of the cuticle were detected. These results prompt us to suggest a novel structural role for AtLTP2. AtLTP2 could be involved in maintaining the accurate sealing between the hydrophobic cuticle and the hydrophilic underlying cell wall. Then, by preserving the integrity of the cuticle-cell wall interface, AtLTP2 could act on the barrier function of the cuticle limiting water loss. Interestingly, the dual localization to the cell wall and plastids suggested that other functions could be assigned to AtLTP2. The elucidation of the molecular mechanisms by which AtLTP2 establish cell wall-cuticle homeostasis and the exact function of the dual targeting will be challenging tasks in the future to better identify the main actors of the formation of the cuticle.

Porteur redox intervenant dans nombre de processus métaboliques, le NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) est central pour les cellules vivantes. Outre son importance dans le métabolisme oxydoréductif, des données récentes suggèrent fortement d’autres rôles importants pour le NAD dans la signalisation cellulaire. Un système inductible d’enrichissement en NAD en surproduisant la quinolinate phosphoribosyltransférase (QPT) d’Escherichia coli chez Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l’implication du NAD dans les mécanismes spécifiques de défenses qui régissent les interactions plante-pathogène. Par ailleurs, une dérégulation de la synthèse de NAD sur l’étape enzymatique catalysée par la QPT endogène d’Arabidopsis thaliana souligne le rôle critique du NAD dans la balance C/N des plantes, en particulier en bouleversant l’assimilation de l’azote en conditions photorespiratoires. Ces travaux nous ouvrent à une nouvelle compréhension des mécanismes de signalisation impliquant le NAD dans les grandes fonctions métaboliques des plantes. / Plant development and functions are underpinned by redox reactions which depend on cofactors such as pyridine nucleotides as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Beside its redox properties, NAD has recently been implicated in cellular signalling. An inducible system based on Escherichia coli quinolinate phosphoribosyltransferase (QPT) overproduction in transgenic Arabidopsis thaliana was set up as a convenient experimental technique to raise NAD content. This build-up highlights the involvement of NAD in plant-pathogen specific defense mechanisms. Furthermore, manipulating endogenous Arabidopsis thaliana QPT levels was used to deregulate NAD production. Such an approach points out the critical role of NAD in C/N interactions by shaking up nitrogen assimilation upon photorespiratory conditions. These results pave the way for a new understanding of signalling mechanisms involving NAD in plants major metabolic functions.

Le développement et le fonctionnement harmonieux des plantes dépendentde cofacteurscomme le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Outre ses rôles dansle recyclage rédox,le NAD est aussi impliqué dans des processus de signalisationcellulaire, particulièrementsollicités en situation de stress. Cela fait du NAD l’un desdéterminants majeurs del’homéostasie énergétique des plantes et donc des rendements descultures. Par uneapproche de génétique inverse ciblant la L-aspartate oxydase (AO),première enzyme de lavoie de biosynthèse du NAD, nous avons obtenu des plantes aux teneursconstitutivementaugmentées et diminuées en nucléotides à pyridine. L’étude de cesplantes a permisd’établir que (1) le NAD stimule la croissance, le développement et laproductivité desplantes, (2) coordonne les métabolismes photosynthétique, respiratoireet azoté, et (3)intervient dans les mécanismes de résistance aux stress biotiques etabiotiques. Les travauxcités ci-dessus font l’objet d’une valorisation industrielle. / The harmonious development and functioning of plants depend on severalcofactors such asnicotinamide adenine dinucleotide. Besides its roles in redox recycling,the NAD is alsoinvolved in cellular signalling processes, which are central actors instress situations. TheNAD is thus one of the main determinants of plant energy homeostasis,and therefore of cropyield. Through a reverse genetics approach targeting the L-aspartateoxidase (AO) – the firstcommitted enzyme of NAD biosynthesis – plants with constitutive eitherincreased ordecreased levels of pyridine nucleotides have been obtained. A furtherstudy of these plantsenabled to show that the NAD (1) can improve the growth, development andproductivity ofplants, (2) coordinates photosynthetic, respiratory and nitrogenmetabolisms, and (3) actsupon biotic and abiotic stress resistance mechanisms. This research isbeing valuedindustrially.

Au cours des interactions plante/agent pathogène, la disponibilité en sucres est un des enjeux majeurs pour les deux partenaires. Il s'établit donc une compétition vis-à-vis des ressources carbonées entre l'agent pathogène hétérotrophe pour le carbone et la plante consommant de l'énergie pour se défendre. Les transporteurs de sucres sont les acteurs moléculaires qui interviennent dans cette compétition et probablement dans le devenir de l'interaction. L'objectif de cette étude est de déterminer l'implication des transporteurs de sucres au cours de l'interaction entre la plante modèle Arabidopsis thaliana et le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea.Parmi la famille des transporteurs d'hexoses (STPs) d'A. thaliana, l'expression du gène STP13 est régulée positivement durant l'infection par B. cinerea. Le rôle potentiel de STP13 au cours de cette interaction a donc été étudié à l'aide de plantes transgéniques (Knock-Out et surexpresseur). Le suivi du développement des symptômes et la mesure d'absorption du glucose ont permis de montrer des modifications phénotypiques entre les différents génotypes étudiés. Les résultats indiquent une corrélation entre le niveau d'expression de STP13, le transport de glucose et le développement du champignon, confortant ainsi le rôle de STP13 dans la tolérance face à B. cinerea.Les résultats préliminaires de l'étude du transport de glucose à l'échelle cellulaire montrent une inhibition dans des conditions mimant l'infection. Ces analyses ont été effectuées grâce à un modèle constitué d'une suspension cellulaire d'A. thaliana subissant un traitement éliciteur à partir d'un extrait protéique de B. cinerea.Nous nous sommes également intéressés au transport de saccharose à l'échelle de la plante infectée. Nos résultats suggèrent que l'inoculation par le champignon modifie les flux de saccharose classiquement observés créant ainsi une nouvelle force d'appel. Ainsi, la feuille infectée se comporte comme un nouveau puits. Ces travaux de recherche s'inscrivent dans la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes de transport des sucres qui permettra à terme d'agir sur les capacités de résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes. / During plant/pathogen interactions, sugar availability is one of the major issues for both partners. There is a competition for the same carbohydrates necessary for carbon supply on the pathogen's side and to support the additional energy demand for plant's defense. Sugar transporters are the molecular actors in this competition which is determinant for the final outcome of the interaction. In this study, we characterized the implication of sugar transporters in the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and the necrotrophic fungus Botrytis cinerea.Among the A. thaliana hexose transporter family (STPs), STP13 is induced during B. cinerea infection. A potential role of STP13 in this interaction was investigated using transgenic plants (Knock-Out and over-expressor lines). Disease symptoms characterization and glucose uptake assays showed phenotypical variations between the different genotypes. It seems that STP13 expression, glucose uptake and fungus spreading are correlated pointing to a role of STP13 in tolerance to B. cinerea. Other preliminary results showed an inhibition of the cellular glucose uptake upon condition mimicking B. cinerea infection. These analyses were performed on a model composed of an A. thaliana cell suspension elicited with a proteinaceous extract from B. cinerea.We also studied sucrose fluxes in the whole infected plant. Our results suggest that fungus inoculation modifies the usual fluxes creating a new sink.This study may lead to a better understanding of sugar transport mechanisms to improve plant resistance capacity against pathogens in the future.

Les jasmonates jouent des rôles essentiels en réponse aux stress environnementaux et dans le développement des plantes. Jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile), la forme hormonale active, est sous un contrôle métabolique strict. Nos études biochimiques, génétiques et métaboliques ont montré que l’inactivation de JA-Ile est contrôlée par 2 voies, l’une oxydative par les cytochromes P450 CYP94 et l’autre hydrolytique par les amido-hydrolases IAR3 et ILL6. Ces enzymes définissent une grille métabolique vers de nombreux jasmonates. Ces conversions constituent un mécanisme général contrôlant le turnover de JA-Ile et les réponses induites, opèrant après blessure, infection par le champignon Botrytis cinerea ou le développement floral. En outre, les CYP94s oxydent le conjugué Jasmonoyl-Phenylalanine (JA-Phe) accumulé dans les feuilles blessées. Les CYP94s catalysent la carboxylation de JA-Ile et de JA-Phe via un intermédiaire aldéhyde, le JA-Ile-aldéhyde étant accumulé in vivo. Ces travaux élucident un nouveau catabolisme hormonal de plantes et son impact sur un réseau métabolique dynamique et complexe par l’action concertée de deux familles d’enzymes. / Jasmonates are plant molecules playing essential roles in response to environmental stresses and in plant development. Jasmonoyl-Isoleucine (JA-Ile) is an active hormonal form of jasmonates so it is crucial for the plant to control its levels. Biochemical, genetic and metabolic studies showed that JA-Ile inactivation after wounding is controlled by two pathways, based on oxidations by cytochromes P450 of the CYP94 family and on cleavage by the amido-hydrolases IAR3 and ILL6. These enzymes also define a pathway for tuberonic acid (12OH-JA) production from JA. CYP94-catalyzed oxidations seem to be a general mechanism to control JA-Ile hormone turnover, jasmonate signaling and responses as it also occurs upon infection by the fungus Botrytis cinerea and in floral development. CYP94s oxidize also the Jasmonoyl-Phenylalanine (JA-Phe) conjugate accumulated in wounded leaves. CYP94s mediated JA-Ile and JA-Phe carboxylation includes an aldehyde intermediate, that of JA-Ile being accumulated in vivo.This work highlights the dynamic metabolism of jasmonate derivatives in a complex branched network involving the concerted action of two enzyme families.

L'ozone troposphérique est un polluant secondaire majeur. Outre son rôle de gaz à effet de serre direct, l'ozone fait partie des polluants atmosphériques les plus toxiques et la pollution qu’elle engendre, affecte aussi bien la santé humaine que la productivité végétale. Les travaux présentés dans cette thèse porte sur l’étude du rôle des canaux ioniques de la membrane plasmique en réponse à une forte exposition à l’ozone ainsi que leurs interactions avec les évènements de signalisation mis en place lors du processus de PCD induit par ce stress sur des cellules en culture d’A. thaliana. Nous avons montré que cette mort cellulaire génétiquement contrôlée est caractérisée par une plasmolyse semblable à « l’Apoptosis Volume Decrease » (AVD) décrit en animal. Ce processus est promu par des cascades de signalisation où, dans un premier temps, les canaux anioniques sont très précocement activés potentiellement par l’acide oxalique issu de la dégradation de l’ascorbate par l’O3. Les données suggèrent une interconnexion entre les courants anioniques, l’influx cacique et une génération de ROS dépendante de la NADPH oxydase. Dans un deuxième temps, des canaux K+ rectifiants sortants sont activés de manière retardée et participent à la PCD. Cette activation retardée pourrait être due à une régulation post-transcriptionnelle des canaux GORK induite par l’O2•-. Enfin, nous avons également mis en évidence des activités enzymatiques de type caspase, au niveau cytoplasmique et nucléaire. Ces activités enzymatiques semblent être corrélées à la baisse de la teneur vacuolaire en ions K+, mais des données complémentaires sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes sous-jacents. Ce travail souligne l’importance et la complexité de la régulation des canaux anioniques et potassiques et ce, dans les processus de signalisation et la mécanistique menant à la mort cellulaire programmée chez les plantes. / Tropospheric ozone is a major secondary pollutant. In addition to its role in greenhouse effect gas, ozone is one of the most toxic air pollutants, and its pollution affects both human health and crop productivity. The work presented in this thesis concerns the role of ion channels in the plasma membrane in response to acute exposure to ozone and their interactions with signaling events leading to O3-induced PCD in A. Thaliana cultured cells. We have shown that cell death was genetically controlled and characterized by cell shrinkage similar to the mechanism of "Apoptosis Volume Decrease" (AVD) described in animal. This process is initially promoted by an early activation of a plasma membrane anion channel, amongst which ascorbate-derived oxalic acid production potentially participates to this activation. Our data further suggests an interplay between anion channel with well known plant responses to O3, Ca2+ influx and NADPH-oxidase generating reactive oxygen species (ROS) in mediating the oxidative cell death. In a second step, K+ outwards rectifying currents are activated in a delayed manner and participate to PCD. This delayed activation could be due to O2•- post-transcriptional regulation of GORK channels. Finally, we also demonstrated caspase-like activities in the cytoplasm and the nucleus. These enzyme activities appear to be correlated with the decrease in vacuolar K+ ion content, but require additional data to understand the underlying mechanisms. This work highlights the importance and the complexity of ion channels regulation in the signaling pathway and the mechanistic processes leading to programmed cell death in plants.

La Mort Cellulaire Programmée (MCP) est un processus essentiel pour plusieurs aspects de la vie des plantes, incluant le développement et les réponses aux stress. Des analyses génétiques ont permis d’identifier plusieurs acteurs clés de la MCP chez Arabidopsis thaliana,, dont l’enzyme MIPS1, qui catalyse une étape limitante de la biosynthèse du myo-inositol (MI), composé cellulaire majeur à l’origine de nombreux dérivés. Une des caractéristiques les plus importantes du mutant mips1, désactivé pour cette protéine, est l’apparition de lésions sur les feuilles de rosette, dépendante des conditions lumineuses et due à de la MCP impliquant la voie de l’acide salicylique. Ces données avaient permis de révéler un rôle du MI, ou de ses dérivés, dans le contrôle de la MCP. Mon travail de thèse a consisté à rechercher et à caractériser des suppresseurs du mutant mips1 par deux approches complémentaires : une approche gène candidat par comparaison de transcriptome et une stratégie de génétique directe suite au crible de mutations secondaires extra-géniques abolissant le phénotype de mort cellulaire de mips1. Les analyses effectuées sur différents suppresseurs ont mis en évidence l’implication de plusieurs facteurs dans la MCP, tels que le facteur de polyadénylation CPSF30, d’une héxokinase ou encore de la protéine PCB2 intervenant dans la biosynthèse de la chlorophylle. La caractérisation de ces suppresseurs a permis de démontrer l’importance de différentes voies comme la maturation des ARNm, le métabolisme carboné primaire ou l’activité chloroplastique dans le contrôle de la MCP dépendante de l’accumulation de MI. Ce travail apporte de nombreuses perspectives, visant à mieux appréhender les différentes voies de régulation de la MCP indispensables pour un développement correct et pour faire face à des stress biotiques et abiotiques chez les plantes. / Programmed cell death (PCD) is essential for several aspects of plant life, including development and stress responses. Mutational analyses have identified several key PCD components in Arabidopsis thaliana, as the enzyme MIPS1 catalysing the limiting step of myo-inositol (MI) synthesis, crucial cellular compound at the root of many derivatives. One of the most striking features of mips1, disrupted for this protein, is the light-dependent formation of lesions on leaves due to Salicylic Acid (SA)-dependent PCD, revealing roles for MI or inositol derivatives in the regulation of PCD. My thesis work was to find and characterize suppressor of mips1 mutant using two complementary approaches: a gene candidate approach by transcriptomic comparisons and a strategy of direct genetic by screening for extra genic secondary mutations that abolish mips1 cell death phenotype. Analysis of different suppressors revealed the involvement of several factors in MCP, such as the polyadenylation factor CPSF30, a hexokinase or the protein PCB2 operating in chlorophyll biosynthesis. Characterization of these suppressors allowed us to demonstrate crucial role of functions as mRNA maturation, primary carbohydrate metabolism or chloroplastic activity in the regulation of MCP depending on MI accumulation. This work brings many opportunities, to better understand the different regulatory pathways of PCD essential for proper development and to cope with biotic and abiotic stress in plants.

Par quel mécanisme les protéines de signalisation sont ciblées à un compartiment membranaire spécifique est une question fondamentale en biologie cellulaire. Les phosphatidylinositol phosphates (PIPs) sont des lipides anioniques qui jouent un rôle majeur dans ce phénomène. Ces lipides sont en très faible quantité dans la bicouche membranaire mais sont des sites d'ancrage spécifiques aux différents compartiments membranaires, et contribuent ainsi à leur identité. Il a été proposé que cette organisation s'apparente à un "code", qui peut être lu par des protéines qui intéragissent spécifiquement avec ces PIPs (Kutateladze 2010). Nous avons établi une carte de la localisation des différents PIPs dans les cellules d'épiderme racinaire chez Arabidopsis, et nous avons trouvé que les PIPs ne s'accumulent pas à un compartiment donné mais plutôt que chaque PIP est distribué dans plusieurs compartiments distincts, et à différentes concentrations (Simon, Platre et al., 2014). Ces données suggèrent que le "code PIP" n'est pas suffisant pour expliquer la sélection des protéines liant les lipides parmi les différents compartiments membranaires de la cellule chez la plante. Les PIPs sont des lipides négativement chargés et nous avons proposé que cette propriété physique pourrait contribuer à l'identité des membranes en régulant leurs charges de surface. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons développé une collection de biosenseurs génétiquement codés pour analyser les charges de surface des membranes au niveau subcellulaire, in vivo. Nous avons trouvé que la membrane plasmique a une signature électrostatique spécifique contrôlée par le PI(4)P. De plus, ce champ électrostatique dépendent du PI(4)P contrôle la localisation et la fonction de plusieurs protéines agissant en aval de récepteurs kinase ou impliquées dans certaines voies de signalisation hormonale tel que l’auxine ou les brassinosteroïdes. Ainsi, les PI(4)P sont de véritables marqueurs de la membrane plasmique qui sont essentiels pour l’homéostasie des membranes et le développement des plantes. / How signaling proteins are targeted to specific membrane compartments is a fundamental question in cell and developmental biology. Phosphoinositides, a class of anionic lipids, take center stage in this process. They are minor lipids of the membrane bilayer that provide specific docking sites on membrane compartments and contribute to their identity. As such it has been proposed that there is a “phosphoinositide code” that allows the targeting of lipid binding proteins to specific membrane compartments (Kutateladze 2010). We recently mapped the localization of the different phosphoinositides in Arabidopsis epidermal cell, and found that they do not accumulate to a specific compartment but rather that each phosphoinositide is distributed to several compartments, albeit at different concentration (Simon et al., 2014). These data suggest that, unlike in other eukaryotic cells, the “phosphoinositide code” hypothesis is not sufficient to explain membrane selectivity of lipid binding proteins in plants. Phosphoinositides are negatively charged lipids and we hypothesized that this physical property might also contribute to membrane identity by regulating surface charges. To investigate membrane electrostatic properties at the subcellular level, we designed a set of genetically encoded biosensors able to report membrane surface charges. We found that the plasma membrane (PM) has a specific electrostatic signature that is controlled by the phosphoinositide PI4P. We further show that this PI4P-dependent electrostatic field controls the PM localization and function of several proteins involved in receptor kinase and phytohormone signaling as the auxin or brassinosteroids. Thus, PI(4)P are plasma membrane markers which are essential for the membrane homeostasis and plants development.

Ce travail est basé sur le constat du manque de méthodes permettant l'analyse intégrée des processus contrôlant le développement végétatif d'Arabidopsis thaliana dans les études phénotypiques multi-échelles. Un phénotypage préliminaire de la croissance foliaire de 91 génotypes a permis de sélectionner 3 mutants et des variables d'intérêt pour une étude plus poussée du développement de la pousse. Un pipeline de méthodes d'analyses combinant techniques d'analyse d'images et modèles statistiques a été développé pour intégrer les mesures faites à l'échelle de la feuille et de la pousse. Des modèles multi-phasiques à changements de régime semi-markovien ont été estimés pour chaque génotype permettant une caractérisation plus pertinente des mutants. Ces modèles ont validé l'hypothèse selon laquelle le développement de la rosette peut être découpé en une suite de phases de développement, pouvant varier selon les génotypes. Ils ont aussi mis en évidence le rôle structurant de la variable «trichome abaxial», bien que les phases de développement ne puissent être entièrement expliquées par ce trait. Un 2nd pipeline d'analyses combinant une méthode semi-automatique de segmentation d'images de l'épiderme foliaire et l'analyse des surfaces de cellules par un modèle de mélange de lois gamma à paramètres liés par une loi d'échelle a été développé. Ce modèle nous a permis d'estimer la loi du nombre de cycles d'endoréduplication. Nous avons mis en évidence que cette loi dépendait du rang de la feuille.Le cadre d'analyses multi-échelles développé et testé durant cette thèse devrait être assez générique pour être appliqué à d'autres espèces végétales dans diverses conditions environnementales. / This study is based on the observation of a lack of methods enabling the integrated analysis of the processes controlling the vegetative development in Arabidopsis thaliana during multi-scale phenotypic studies. A preliminary leaf growth phenotyping of 91 genotypes enabled to select 3 mutants and different variables of interest for a more in depth analysis of the shoot development.We developed a pipeline of analysis methods combining image analysis techniques and statistical models to integrate the measurements made at the leaf and shoot scales. Semi-Markov switching models were built for each genotype, allowing a more thorough characterization of the studied mutants. These models validated the hypothesis that the rosette can be structured into successive developmental phases that could change depending on the genotype. They also highlighted the structuring role of the ‘abaxial trichomes' variable, although the developmental phases cannot be explained entirely by this trait. We developed a second pipeline of analysis methods combining a semi-automatic method for segmenting leaf epidermis images, and the analysis of the obtained cell areas using a gamma mixture model whose parameters of gamma components are tied by a scaling rule. This model allowed us to estimate the mean number of endocycles. We highlighted that this mean number of endocycles was function of the leaf rank.The multi-scale pipeline of analysis methods that we developed and tested during this PhD should be sufficiently generic to be applied to other plant species in various environmental conditions.