Les réactions de défense végétales sont souvent associées au développement de la réponse hypersensible (HR), une forme de mort cellulaire programmée qui confine l'agent pathogène au niveau du site d'infection. La frontière nette de la HR suggère l'existence de mécanismes efficaces qui contrôlent la frontière entre mort cellulaire et survie. Le facteur de transcription d'Arabidopsis AtMYB30 régule positivement la HR et les réponses de défense de la plante en augmentant la synthèse des acides gras à très longue chaîne (VLCFA) après infection bactérienne. L'activité d’AtMYB30 est étroitement contrôlée à l'intérieur des cellules végétales par des interactions protéine-protéine et des modifications post-traductionnelles. Au cours de mes travaux de thèse, nous avons identifié une protéase de la famille des subtilases (AtSBT5.2) en tant que partenaire protéique d’AtMYB30. Chose intéressante, nous avons montré que le transcrit d’AtSBT5.2 est épissée de façon alternative, conduisant à la production de deux produits de gènes distincts codant soit pour une isoforme sécrétée [AtSBT5.2 (a)] soit une isoforme intracellulaire [AtSBT5.2 (b)]. L'interaction spécifique d’AtMYB30 avec AtSBT5.2(b), mais pas avec AtSBT5.2(a), conduit à une rétention d’AtMYB30 à l'extérieur du noyau au sein de petites vésicules intracellulaires. Des plantes d’Arabidopsis mutantes atsbt5.2, ne montrant ni expression d’AtSBT5.2(a) ni d’AtSBT5.2(b), présentent des réactions de défense et de HR accrues. Ce phénotype étant abolie dans un fond génétique mutant atmyb30, AtSBT5.2 est donc un régulateur négatif de la résistance aux maladies induites par AtMYB30. Fait important, la surexpression de l’isoforme AtSBT5.2(b), mais pas celle de l’isoforme AtSBT5.2(a), dans le fond mutant atsbt5.2 rétablit les phénotypes présentés par les plantes mutantes atsbt5.2, ce qui suggère qu’AtSBT5.2(b) réprime spécifiquement la réponse de défense induite par AtMYB30. / Plants defence responses are often associated with the development of the so-called hypersensitive response (HR), a form of PCD that confines the pathogen to the infection site. The sharp boundary of the HR suggests the existence of efficient mechanisms that control cell death and survival. The Arabidopsis transcription factor AtMYB30 positively regulates plant defence and HR responses by enhancing the synthesis of sphingolipid-containing Very Long Chain Fatty Acids (VLCFA) after bacterial infection. The activity of AtMYB30 is tightly controlled inside plant cells through protein-protein interactions and post-translational modifications. During my PhD, we identified a protease of the subtilase family (AtSBT5.2) as a AtMYB30-interacting partner. Interestingly, we have shown that the AtSBT5.2 transcript is alternatively spliced, leading to the production of two distinct gene products that encode either a secreted [AtSBT5.2(a)] or an intracellular [AtSBT5.2(b)] protein. The specific interaction between AtMYB30 and AtSBT5.2(b), but not AtSBT5.2(a), leads to AtMYB30 specific retention outside of the nucleus in small intracellular vesicles. atsbt5.2 Arabidopsis mutant plants, in which both AtSBT5.2(a) and AtSBT5.2(b) expression was abolished, displayed enhanced HR and defence responses. The fact that this phenotype is abolished in an atmyb30 mutant background suggests that AtSBT5.2 is a negative regulator of AtMYB30-mediated disease resistance. Importantly, overexpression of the AtSBT5.2(b), but not the AtSBT5.2(a), isoform in the atsbt5.2 mutant background reverts the phenotypes displayed by atsbt5.2 mutant plants, suggesting that AtSBT5.2(b) specifically represses AtMYB30-mediated defence.

Le noyau est une innovation évolutive majeure caractéristique des organismes eucaryotes. Ces dernières années de nombreux travaux se sont intéressés à l’organisation de la chromatine dans l’espace nucléaire lors de l’interphase. Les protéines associées à la périphérie nucléaire ou ancrées dans la membrane nucléaire interne ont suscité un intérêt majeur due à leur contribution dans l’organisation spatiale de la chromatine. Chez les animaux, les lamines qui forment des filaments à la périphérie nucléaire et le complexe LINC, un complexe protéique reliant la membrane externe et interne du noyau sont connues pour interagir avec la chromatine, influencer l’organisation de cette dernière et moduler la régulation transcriptionnelle. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana utilisée dans ce travail, le complexe LINC est conservé, par contre les lamines ne le sont pas et seraient remplacées par d’autres acteurs spécifiques du règne végétal. Le travail détaillé dans ce manuscrit porte sur la mise en évidence d’un nouveau réseau d’interaction protéique localisé à la périphérie nucléaire et sur l’impact de ces protéines dans la morphologie du noyau et l’organisation de la chromatine. Mes travaux se sont concentrés sur les protéines à domaine SUN, l’une des composantes du complexe LINC et sur les protéines CRWN et KAKU4 présentes à la périphérie du noyau. Des cribles double hybride chez la levure m’ont permis d’identifier 24 partenaires protéiques potentiels dont plus d’un tiers sont des facteurs de transcription L’étude plus précise du facteur de transcription MaMYB pour lequel nous avons créé un allèle nul par la méthode CRISPR montre qu’il joue un rôle plus spécifique dans la formation des racines. L’étude de mutants combinatoires pour les gènes SUN, CRWN et KAKU4 montre des anomalies développementales notamment des tissus reproductifs. Enfin, une étude plus détaillée de la protéine KAKU4 suggère sa participation au maintien de la morphologie du noyau et au rapprochement de l’hétérochromatine vers la périphérie nucléaire. En résumé, mes travaux ont mis en évidence l’existence d’un réseau de facteurs de transcription recrutés à la périphérie nucléaire par les protéines SUN, CRWN et KAKU4. Ce réseau d’interaction protéine-protéine participerait à un mécanisme de séquestration de certains facteurs de transcription et/ou d'un rapprochement à la périphérie nucléaire de certains domaines de chromatine afin d’activer ou de réprimer leur transcription. / The nucleus is a major evolutionary innovation characteristic of eukaryotic organisms. In recent years, numerous studies have focused on the organization of chromatin in nuclear space during interphase. Proteins associated with the nuclear periphery or anchored in the inner nuclear membrane have been particularly studied for their contribution to the spatial organization of chromatin. In animals, the lamina that forms filaments at the nuclear periphery and the LINC complex, a protein complex linking the outer and inner membrane of the nucleus, are known to interact with chromatin, to influence its organization and to modulate transcriptional regulation. In the model plant Arabidopsis thaliana used in this work, the LINC complex is conserved, but not the lamina constituents, which are replaced by other specific actors of the plant kingdom. The work detailed in this manuscript identified a new protein interaction network located on the nuclear periphery and studied the impact of these proteins on nuclear morphology and chromatin organization. My work focused on SUN-domain proteins, one of the components of the LINC complex, and on the CRWN and KAKU4 proteins at the periphery of the nucleus. Double hybrid screens in yeast allowed me to identify 24 potential protein partners, more than a third of which are transcription factors. The more precise study of the transcription factor MaMYB for which we created a null allele using the CRISPR method, shows that it plays a more specific role in root formation. The study of mutant combinations for SUN, CRWN and KAKU4 genes reveals developmental abnormalities, particularly in reproductive tissue. Finally, a more detailed study of the role of the KAKU4 protein suggests that it contributes to the morphology of the nucleus in maintaining heterochromatin at the nuclear periphery. In summary, we propose the existence of a transcription factor network recruited to the nuclear periphery by SUN, CRWN and KAKU4 proteins. This protein-protein interaction network would participate in the sequestration of certain transcription factors and/or the localization of certain chromatin domains to the nuclear periphery in order to activate or suppress their transcription.

Chez les plantes supérieures, la distribution des sucres entre organes sources et puits requiert l'activité de transporteurs membranaires de sucre. Les flux de sucre variant au cours du développement de la plante et en réponse à des stress, il est logique de penser que les transporteurs de sucres sont impliqués dans ces changements. Le but du travail était de suivre la répartition des sucres et l'expression des transporteurs correspondants dans les racines de la plante modèle Arabidopsis thaliana, en réponse à un stress osmotique. Afin de pouvoir récolter des racines, un système de culture en hydroponie a été mis en place. Après avoir vérifié l'homogénéité des plantes cultivées dans ce système, une étude de l'expression des gènes de transporteurs de sucre a été effectuée au cours du développement des plantes et de d'une journée (24h), en utilisant la technique de macroarray. Cette étude a révélé l'expression dans les racines de 3 transporteurs de saccharose (AtSUC1, AtSUC2 et AtSUC5), 2 transporteurs de polyols (AtPLT5 et AtPLT6) et 2 transporteurs d'hexoses (AtSTP7 et AtSTP13). Le suivi de la teneur en sucres solubles et en amidon ainsi que du transport à longue distance de [U-14C]-saccharose a permis d'émettre des hypothèses quant au rôle des transporteurs de sucres exprimés dans la racine. Afin de mimer un stress hydrique en hydroponie, un protocole d'application progressif d'un agent osmotique (polyéthylène glycol 6000) dans le milieu de culture a été élaboré. Ce système a permis de mettre en évidence que 5 des gènes de transporteurs de sucre identifiés dans la racine ont une expression qui varie dans ces conditions. Trois d'entre eux sont fortement réprimés : AtSUC1 / In plants, sugar allocation between source and sink organs is based on the activity of membrane transporters for sugars. As sugar fluxes are changing during development and in response to stress, sugar transporters are supposed to be involved in those changes. The aim of this work was to study sugar allocation and the corresponding transporters gene expression in the roots of the model plant Arabidopsis thaliana during an osmotic stress. In order to have access to the roots, an hydroponic culture system was developped. The homogeneity of the plants obtained with this system was checked and the expression of sugar tranporter genes was followed during development and during a 24h period was studied by a macro-array technique. The expression in the roots of the following genes was found: 3 sucrose transporters (AtSUC1, AtSUC2 and AtSUC5), 2 polyol transporters (AtPLT5 and AtPLT6) and 2 hexose transporters (AtSTP7 and AtSTP13). The sugar and starch content and the long distance of 14C-sucrose were measured and used to build some hypothesis on the role of sugar transporters in the roots. To mimick a water stress, an osmotic stress due to the progressive addition of Polyethylene-glycol was applied. This system demonstrated that 5 of the identified transporter genes display a change in expression: 3 are repressed (AtSUC1, AtSUC5 and AtPLT6) and 2 are over expressed (AtSUC2 and AtSTP13). Moreover, soluble sugar and starch accumulate in the leaves and 14C-sucrose transport to the roots is decreased in plants subjected to an osmotic stress. The respective role of transporters is discussed. The gene expression data were also confirmed with plants grown in rhizoboxes.

Afin d’étudier la prise en charge des histones H3 jusqu’à l’ADN et pour comprendre l’influence de leur dynamique dans l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, une analyse des chaperonnes d’histones a été menée. Nous avons identifié et caractérisé les sous-unités du complexe HIR, impliqué dans l’assemblage de la chromatine réplication-indépendante chez Arabidopsis. La perte d’AtHIRA, la sous-unité centrale du complexe, affecte le niveau d’histone soluble, l’occupation nucléosomale des régions euchromatiniennes et héterochromatiniennes ainsi que la mise sous silence transcriptionnel des séquences d’ADN répétées. Alors que le complexe HIR ne participe pas à l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, j’ai montré que CAF-1, impliqué dans l’assemblage de la chromatine au cours de la réplication, joue un rôle central dans la formation des chromocentres. Lors du développement post-germinatif des cotylédons, les séquences d’ADN répétées centromériques et péricentromériques se concentrent dans les chromocentres et s’enrichissent en histone H3.1 de manière CAF-1 dépendante. Cet enrichissement, associé à des modifications post-traductionnelles d’histones associées à un état répressif de la transcription, participe à la formation des chromocentres et met en évidence l’importance de l’assemblage de la chromatine par CAF-1 dans la structure et le maintien du génome. Alors que la perte individuelle de HIR ou de CAF-1 n’affecte pas la viabilité, l’absence des deux complexes altère fortement l’occupation nucléosomale et le développement des plantes. Ceci suggère que la compensation fonctionnelle entre ces complexes de chaperonnes ainsi que la plasticité des voies de dépôt des histones restent limitées. / To understand how histones H3 are handled and how histone dynamics impact higher-order chromatin organization such as chromocenter formation in Arabidopsis, a comprehensive analysis of the different histone chaperone complexes is required. We identified and characterized the different subunits of the Arabidopsis HIR complex. AtHIRA is the central subunit and its loss affects non-nucleosomal histone levels, reduces nucleosomal occupancy not only at euchromatic but also at heterochromatic targets and alleviates transcriptional gene silencing. While the HIR complex-mediated histone deposition is dispensable for higher-order organization of Arabidopsis heterochromatin, I show that CAF-1 plays a central role in chromocenter formation. During postgermination development in cotyledons when centromeric and pericentromeric repeats cluster progressively into chromocenter structures, these repetitive elements but not euchromatic loci become enriched in H3.1 in a CAF-1- dependent manner. This enrichment, together with the appropriate setting of repressive histone post-translational marks, contributes to chromocenter formation, identifying chromatin assembly by CAF-1 as driving force in formation and maintenance of genome structure. Finally, while absence of HIR or CAF-1 complexes sustains viability, only the simultaneous loss of both severely impairs nucleosomal occupancy and plant development, suggesting a limited functional compensation between the different histone chaperone complexes and plasticity in histone variant interaction and deposition in plants.

Le colza d’hiver (Brassica napus) est cultivé pour l’huile contenue dans ses graines ainsi que pour les tourteaux qui sont une source de protéines pour l’alimentation animale. La culture de colza demande de forts apports d’azote et cette espèce est caractérisée par sa faible efficacité d’utilisation de l’azote. Une forte proportion de l’azote absorbé est restituée au sol lors de la chute précoce des feuilles au stade végétatif. L’amélioration de la remobilisation de l’azote est donc de première importance pour améliorer le rendement de cette culture tout en satisfaisant le besoin de réduction des intrants. La glutamine et l’asparagine jouent un rôle important dans le transport de l’azote au sein de la plante, notamment au cours de la sénescence foliaire. Les deux familles multigéniques des glutamine synthétases cytosoliques (GLN1) et des asparagine synthétases (ASN) assurent leur synthèse. Ce travail de thèse s’est intéressé à ces enzymes chez deux Brassicacées : le colza et Arabidopsis thaliana. Dans un premier temps, l’expression des gènes GLN1 a été étudiée chez Arabidopsis par une combinaison d’approches de biologie moléculaire, cellulaire et de cytologie. Les spécificités d’expression de chacun des cinq gènes d’Arabidopsis ont été mises en évidence. L’identification des gènes BnaGLN1 chez Brassica napus a permis une analyse de leur expression en fonction de l’âge des feuilles et de la disponibilité en azote. Les profils d’expression observés chez le colza se sont révélés similaires à ceux des gènes homologues d’Arabidopsis, amenant l’hypothèse d’une conservation des fonctions chez les deux espèces. Le rôle des gènes GLN1 d’Arabidopsis dans la remobilisation de l’azote vers les graines a été étudié grâce à un marquage ¹⁵N effectué sur des mutants simples. Le rôle des gènes GLN1 dans la remobilisation de l’azote des tissus végétatifs vers les tissus reproducteurs a été mis en évidence sans toutefois cibler spécifiquement une isoforme. L’étude de la famille ASN chez Arabidopsis a permis de mettre en évidence des profils d’expression spécifiques en fonction des organes, de l’âge des tissus et de la disponibilité en azote pour chacun des trois gènes. Le marquage ¹⁵N a également révélé une implication des gènes ASN1 et ASN2 dans la remobilisation de l’azote de la rosette vers les tissus reproducteurs. Les travaux présentés dans ce manuscrit sont une base pour de futures approches translationnelles vers le colza. / Winter oilseed rape (Brassica napus) is grown for its oil-rich seeds and for proteins, used in animal feed cake. It requires high nitrogen inputs due to the low efficiency of nitrogen utilization that characterizes this species. A large proportion of absorbed nitrogen is indeed returned to the soil when leaves fall. Improving nitrogen remobilization to promote seed filling is then required to improve yield and limit fertilizer use. Asparagine and glutamine are important amino acids for phloem translocation. This thesis focuses on the two multigenic families in charge of asparagine and glutamine synthesis: cytosolic glutamine synthetase (GLN1) and asparagine synthetase (ASN). Studies were performed on the two Brassicaceae, rapeseed and Arabidopsis thaliana. The GLN1 gene expressions were investigated in Arabidopsis by a combination of molecular biology and cytology. The five GLN1 genes are differentially expressed in Arabidopsis depending on ageing and nitrogen availability. The identified BnaGLN1 genes in Brassica napus also showed age and nitrogen dependent expressions. Interestingly, expression profiles were similar between homologous genes in Arabidopsis and rapeseed, suggesting that homologous genes share similar function in the two species. The role of Arabidopsis GLN1 genes for nitrogen remobilization to the seeds was monitored using ¹⁵N tracing experiments on individual mutants. The GLN1 genes play a role in the remobilization of nitrogen from the rosette leaves to the reproductive organs. However, their effect is weak and non-specific of one GS1 isoform. ASN genes also presented specific expression profiles depending on organs, age and nitrogen availability. The ¹⁵N tracing revealed that ASN1 and ASN2 are both involved in nitrogen remobilization from the rosette to the seeds. Our studies provide a basis for future translational approaches to improve oilseed rape.

Le déterminisme du sexe est un processus qui aboutit à la séparation physique des structures à l’origine des gamètes mâles et femelles, soit sur des fleurs séparées sur une même plante, pour les espèces monoïques, soit sur des individus séparés, dans le cas des espèces dioïques. Ce mécanisme favorise la fécondation croisée et augment ainsi la variabilité génétique. Il pourrait être influencé par les facteurs endogène (génétique ou hormonal) ou environnementaux. Chez le melon, le déterminisme du sexe est contrôlé par le gène A (andromonoecious) et le gène G (gynoecious). Le gène A code pour 1-aminocyclopropane-1-carboxylique acide synthase (ACS), un enzyme impliqué dans la voie de biosynthèse d’éthylène qui inhibe le développement des étamines dans les fleurs femelles. Le gène G code pour une protéine C2H2 à doigt de zinc appartenant à la famille WIP de facteurs de transcription qui inhibe le développement des capelles dans les fleurs mâles. Chez Arabidopsis thaliana, Il y a six gènes WIP et on en sait très peu sur leur fonction moléculaire. TT1/AtWIP1 est impliqué à l’accumulation de PA dans endothélium de graines. NTT/AtWIP2 est impliqué dans le développement de TRANSMITTING TRACT de carpelle. Dans cette thèse, nous avons essayé de mettre en évidence la fonction moléculaire de gènes WIP. Dans cette étude, nous avons montré que les gènes WIP des espèces différents partiellement restaurent le phénotype de graines jaune de tt1-3 mutants et régulent positivement les gènes tardifs de biosynthèse de flavonoïdes chez Arabidopsis thaliana La complémentation fonctionnelle de mutants tt1-3 par le gène WIP de melon et le gène WIP de la mousse montre que les gènes WIP ont la même fonction globale mais diffèrent à l’échelle spatio-temporelle. Il a été montré que le second motif conservé, à l’extrémité N-terminal, du gène TT1 était essentiel pour qu’il soit fonctionnel. La substitution d’acides aminés de ce motif (N2) par des alanines diminue l’accumulation de proanthocyanidines (PA) dans l’endothélium de la graine. TT1 perturbe également le développement des pétales, des étamines et des carpelles quand il est surexprimé de manière ectopique sous le contrôle des promoteurs d’AP3 et CRC. Il a été exprimé dans les racines secondaires sous le promoteur du gène SOLITARY ROOT (SLR/IAA14) ainsi que dans les stipules sous le promoteur du gène GLABROUS1 (GL1). TT1 inhibe le développement des racines secondaires et la formation des trichomes sur les feuilles. Dans cette étude, nous avons constaté que TT1 agit comme un inhibiteur de la formation d’organes quand il est exprimé de manière ectopique. On cherchera dans cette étude à comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’arrêt du développement de ces organes au cours du déterminisme du sexe et a évoqué de nouvelles pistes pour expliquer ce processus. / Sex determination in plants is a process that results the development of either male or female flower on the same or different individuals. This mechanism enhances the cross pollination and raises the genetic variability. It can be influenced by endogenous (genetic or hormonal) and/or external environmental factors. In melon, gene A arrests the stamen development in the female flowers and gene G arrests the development of carpel in the male flowers hence these two genes control the sex determination mechanism in melon. Gene A encodes 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (ACS), an enzyme which is involved in the ethylene biosynthesis pathway. Gene G encodes a C2H2 zinc finger proteins that belongs to WIP family of transcription factors. In Arabidopsis thaliana, there are six WIP genes and very little is known about their molecular function. TT1/AtWIP1 is involved in the accumulation of PA in the seed endothelium. NTT/AtWIP2 is involved in the development of transmitting tract in the carpel. In this thesis, we tried to highlight the molecular function of the WIP genes. Here we show that WIP genes from different species partially restore the yellow seed coat color phenotype of tt1-3 mutant and upregulate the late flavonoid biosynthetic genes. The functional complementation of tt1-3 mutants by WIPs from Cucumis melo and Physcomitrella patens indicates that WIP genes have the same global function but differ on the spatio-temporal level. Second conserved motif in the N-terminus of TT1 protein was found to be essential for its proper function as alanine scanning of N2 motif of TT1 decreased the accumulation of PAs in the seed endothelium. TT1 disturbed the development of petals, stamens and carpels in flower when ectopically expressed under AP3 and CRC promoter. TT1 was expressed in the lateral roots under the promoter of SOLITARY ROOT (SLR/IAA14) and in the stipules under the promoter of GLABROUS1 (GL1). TT1 was able to inhibit the development of the lateral roots and leaf trichomes. In this study, we found that TT1 can act as organ inhibitor when ectopically expressed. Our study will help us to understand the organ arrest during sex determination mechanism and will evoke new dimensions for further explanations of this process.

Le rétromère est un complexe multiprotéique qui régule le trafic intracellulaire et qui est conservé chez les eucaryotes. Chez la levure et les animaux, le complexe rétromère est impliqué dans le recyclage des régulateurs de la polarité cellulaire. Chez Arabidopsis thaliana, les travaux de notre équipe ont démontré que ce complexe est requis pour la localisation polaire des transporteurs d’auxine de la famille PIN. Au cours de mon travail de thèse, j’ai approfondi la caractérisation de la fonction du composant AtVPS29 du rétromère et démontré son rôle dans la régulation de la croissance cellulaire polarisée et dans la polarité planaire chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Les mutants perte de fonction vps29 présentent des défauts de croissance polaire des tubes polliniques et des poils absorbants, et également des défauts de morphogenèse des cellules épidermiques des cotylédons. Les petites GTPases ROP (Rho-Of-Plant) sont les régulateurs majeurs de la polarité cellulaire chez les plantes. ROP1 est requis pour la croissance du tube pollinique, et ROP2 pour la morphogenèse des poils absorbants et des cellules épidermiques des cotylédons. Le travail décrit ici est destiné à comprendre les liens fonctionnels et moléculaires entre AtVPS29 et les protéines ROP. Mes résultats suggèrent que l’activité de ROP2 est dépendante de VPS29. J’ai également établi que VPS29 était nécessaire pour assurer la localisation subcellulaire de ROP1 et de ROP2. Chez les mutants vps29, l’analyse de la voie de signalisation ROP2 suggère que l’activité de ROP2 est fortement dérégulée. Ainsi, nos données montrent que le complexe rétromère de plante régule le trafic membranaire des protéines ROP, assurant la localisation de leur activité dans les bons territoires cellulaires, et in fine, la croissance polaire des cellules. Ces données suggèrent que le complexe rétromère de plante pourrait réguler la formation et/ou le maintien de la polarité chez différents types de cellules végétales. Ils soulignent également l’importance du trafic endocytique dans la régulation de la polarité cellulaire chez les plantes. / The retromer complex is a coat pentameric complex, strongly conserved among eukaryotes and involved in intracellular trafficking. In yeast and animals, the retromer complex participates in the polar targeting of regulators of cell polarity. Our group has previously shown that the retromer is required for the polar localization of auxin carrier proteins of the PIN-FORMED (PIN) family in Arabidopsis thaliana. Here, I demonstrate that the plant retromer component AtVPS29 regulates cell polarity, with a specific focus on polar cell growth and planar cell polarity in the model plant A. thaliana. Null vps29 mutants display defects in both pollen tube and root hair tip growth, as well as in the diffuse polar growth of epidermal pavement cells. Rho-of-plant (ROP) small GTPases are master regulators of cell polarity in plants. ROP1 is required for pollen tube growth, while ROP2 coordinates root hair and pavement cell morphogenesis. The aim of my work was focused on the functional and the molecular links between the AtVPS29 and ROP proteins. My results indicate that ROP2 signaling activity is VPS29-dependent in root hairs and in pavement cells. They also suggest that VPS29 is required for the proper localization of ROP1 and ROP2. The analysis of ROP2 signaling pathway in the vps29 mutant, suggest that ROP2 activity is completely deregulated in the absence of VPS29. Altogether, my data indicate that the plant retromer mediates ROP membrane trafficking to allow the proper localization of its activity, a prerequisite for cell polar growth. These findings suggest that the plant retromer might regulate maintenance and/or establishment of cell polarity in various cell types and further emphasize the importance of endocytic recycling in the regulation of polarity in plants.

An understanding of the potential roles as lipid mediators of a family of bioactive metabolites called N-acylethanolamines (NAEs) depends on their accurate identification and quantification. The levels of 18C unsaturated NAEs (e.g. NAE18:2, NAE 18:3, etc.) in wild-type seeds (about 2000 ng/g fw) generally decreased by about 80% during germination and post-germinative growth. In addition, results suggest NAE-degradative fatty acid amide hydrolase (FAAH) expression does not play a major role in normal NAE metabolism as previously thought. Seedlings germinated and grown in the presence of abscisic acid (ABA), an endogenous plant hormone, exhibited growth arrest and secondary dormancy, similar to the treatment of seedlings with exogenous N­lauroylethanolamine (NAE12:0). ABA-mediated growth arrest was associated with higher levels of unsaturated NAEs. Overall, these results are consistent with the concept that NAE metabolism is activated during seed germination and suggest that the reduction in unsaturated NAE levels is under strict temporal control and may be a requirement for normal seed germination and post-germinative growth.

N-Acylethanolamines (NAEs) are bioactive acylamides that are present in a wide range of organisms. Because NAE levels in seeds decline during imbibition similar to ABA, a physiological role was predicted for these metabolites in Arabidopsis thaliana seed germination and seedling development. There is also a corresponding increase of AtFAAH (fatty acid amide hydrolase), transcript levels and activity, which metabolizes NAE to ethanolamine and free fatty acids. Based on whole genome microarray studies it was determined that a number of up-regulated genes that were responsive to NAE were also ABA responsive. NAE induced gene expression in these ABA responsive genes without elevating endogenous levels of ABA. It was also determined that many of these NAE/ABA responsive genes were associated with an ABA induced secondary growth arrest, including ABI3. ABI3 is a transcription factor that regulates the transition from embryo to seedling growth, the analysis of transcript levels in NAE treated seedlings revealed a dose dependent, inverse relationship between ABI3 transcript levels and growth, high ABI3 transcript levels were associated with growth inhibition. Similar to ABA, NAE negatively regulated seedling growth within a narrow window of early seedling establishment. When seedlings are exposed to NAE or ABA within the window of sensitivity, the induction of genes normally associated with the ungerminated desiccation tolerant state resumed. The NAE tolerant FAAH overexpressor and the NAE sensitive FAAH knockout both had a NAE/ABA sensitive window similar to the wild type A. thaliana. The abi3-1 ABA insensitive mutant does not undergo growth arrest upon exposure to ABA, but NAE did induce growth arrest when treated within the sensitivity window. This evidence showed that although NAE functions within an ABA dependent pathway, it also functions in an ABA independent signaling pathway. The FAAH overexpressor is tolerant to NAE through its ability to quickly metabolize NAE from the growth media, yet it is hypersensitive to ABA. The FAAH overexpressor also displayed hypersensitivity to GA, which improved its delayed germination in non-stratified seed, while the FAAH knock out showed GA insensitivity. Overall, these results showed that NAE functions as a negative regulator of germinating seed and seedling growth in ABA dependent and independent signaling pathways, and that altered NAE metabolism may interfere with ABA/GA perception in germinating seed.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.