L’exosome joue un rôle fondamental dans la dégradation de 3’ en 5’ et la maturation des ARNs chez les eucaryotes. Le "coeur" de l’exosome est composé de 9 sous-unités (EXO9). EXO9 est catalytiquement inactif chez l’homme et la levure, et est associé à deux RNases, Rrp6 et Rrp44, responsables de l’activité exonucléolytique de l’exosome. Mes travaux de thèse démontrent que chez Arabidopsis, le coeur de l’exosome EXO9 possède une activité catalytique intrinsèque. Cette activité est dépendante de la présence de phosphate, produit des nucléosides diphosphates et est réversible. Elle possède de ce fait toutes les caractéristiques d’une activité phosphorolytique. L’activité d’EXO9 est impliquée dans l’élimination de sous-produits de la maturation des ARNr et dans la maturation de l’ARNr 5.8S, deux fonctions typiques de l’exosome. Mes travaux révèlent également que AtRRP44, EXO9 et AtRRP6L2 coopèrent de manière séquentielle pour la maturation de l’ARN 5.8S. Mes travaux de thèse constituent la base de travaux futurs visant à comprendre les rôles de l’activité phosphorolytique de l’exosome chez un organisme eucaryote. / The eukaryotic RNA exosome complex is the main 3’-5’ degradation machinery that plays an essential role in RNA decay, quality control and maturation. The exosome core complex (EXO9) is catalytically inert in yeast and humans, and therefore relies on the catalytic activity of associated RNases, Rrp6 and Rrp44. In this study I demonstrated that EXO9 is catalytically active in Arabidopsis. EXO9’s activity is phosphate-dependent, releases nucleoside diphosphates and is reversible, meeting all criteria of a phosphorolytic activity. Importantly, EXO9’s in vivo substrates include the archetypical exosome substrates, rRNA maturation by-products and 5.8S rRNA precursors. My data show that AtRRP44, EXO9 and AtRRP6L2 sequentially cooperate for the processing of 5.8S rRNA. This work sets a basis for studies aiming at further understanding the biological functions of EXO9’s phosphorolytic activity in a eukaryotic organism.

Le réchauffement climatique constitue une problématique d'actualité très préoccupante en raison de ses effets potentiels sur la biodiversité et le secteur agricole. Mieux comprendre l'adaptation des plantes face à ce phénomène récent représente donc un intérêt majeur pour la science et la société. L'étude de populations naturelles provenant d'un gradient d'altitude permet de corréler l'impact d'un ensemble de conditions climatiques (température, humidité, radiation, etc.) à des traits phénotypiques. Ces différentes populations sont dites adaptées à leurs conditions climatiques in natura. En cultivant ces plantes dans des conditions standardisées de laboratoire (intensité lumineuse, substrat, température, arrosage, etc...), la variabilité phénotypique observée, est alors due essentiellement à la variabilité génétique intrinsèque à chaque plante, donc à son génotype. La mise en culture de ces mêmes plantes en changeant une seule variable, par exemple la température, permet de mettre en évidence un phénotype caractéristique. Ce phénotype observé peut être une réponse d'acclimatation d'un génome adapté. Le projet WallOmics vise à caractériser l'adaptation des plantes à l'altitude par l'étude de populations naturelles d'Arabidopsis thaliana provenant des Pyrénées. Les acteurs moléculaires de l'adaptation des plantes au climat sont encore mal connus mais il apparaît que la paroi des cellules végétales pourrait avoir un rôle important dans ce processus. En effet, celle-ci représente le squelette des plantes et leur confère une rigidité tout en représentant une barrière externe sensible et dynamique face aux changements environnementaux. Sa structure et sa composition peuvent être modifiées à tout moment. Il est d'ailleurs possible de dire que cette paroi végétale donne la forme générale de la plante (taille, forme, densité, etc...), son phénotype observable. Ce projet se consacrera principalement à l'étude des parois des cellules végétales. Les nouvelles technologies ont permis l'émergence des données dites "omiques", c'est-à-dire de vastes ensembles de données provenant de niveaux biologiques multiples, comme des données écologiques, de phénotypages, biochimiques, protéomiques, transcriptomiques et génomiques. L'étude et la mise en relation de ces données ont favorisé le développement d'approches globales qui visent à établir une réponse à plusieurs échelles. C'est justement par ce type d'approche non mécanistique que le projet WallOmics a contribué à établir les bases moléculaires des modifications des parois face aux changements climatiques. / Global warming is a current issue of great concern because of its potential effects on biodiversity and the agricultural sector. Better understanding the adaptation of plants to this recent phenomenon is therefore a major interest for science and society. The study of natural populations from an altitude gradient allows correlating a set of climatic conditions (temperature, humidity, radiation, etc...) with phenotypic traits. These different populations are considered as adapted to their climatic conditions in natura. By cultivating these plants under standardized laboratory conditions (light intensity, substrate, temperature, watering, etc.), the observed phenotypic variability, is essentially due to the genetic variability intrinsic to each genotype. The growth of these same plants by changing a single variable, for example temperature, makes possible to highlight a characteristic phenotype. This phenotype may be an acclimation response of a relevant genome. The WallOmics project aims at characterizing the adaptation of plants to altitude by studying natural populations of Arabidopsis thaliana from the Pyrenees. The molecular actors of the adaptation of plants are still poorly described, but it appears that the plant cell wall could play an important role in this process. Indeed, it represents the skeleton of plants and gives them rigidity while representing a dynamic and sensitive external barrier to environmental changes. Its structure and composition can be modified at any time. It is also possible to say that the plant cell wall gives the general shape of the plant (size, shape, density, etc.), that is its observable phenotype. This project will focus mainly on the study of the plant cell wall. New technologies have enabled the emergence of the so-called "omics" data, large sets of data at multiple biological levels, such as ecological, phenotypic, metabolomic, proteomic, transcriptomic and genomic data. The study and the links between these data have favoured the development of integrative approaches aimed at establishing a response at several scales. It is precisely by this type of non- mechanistic approach that the WallOmics project has contributed to establish the molecular players of plant cell wall modifications in the global warming context.

L'expression du génome plastidial, un des trois génomes (nucléaire, mitochondrial et plastidial) qui coexistent dans les cellules végétales, est assurée par trois ARN polymérases. Deux NEP (Nuclear-Encoded RNA Polymerase) transcrivent la plupart des gènes de ménage tandis que la PEP (Plastid-Encoded RNA Polymerase) transcrit principalement les gènes liés à la fonction photosynthétique en s'associant à des facteurs de transcription d'origine nucléaire (facteurs sigma) importés dans le plaste. De précédents travaux dans l'équipe ont montré que, contrairement aux observations généralement admises, les trois ARN polymérases sont nécessaires pour assurer une germination efficace des graines d'Arabidopsis. L'objectif de notre travail est de comprendre comment ces enzymes ont été mises en place au cours de la formation de la graine. Pour cela, nous avons analysé l'expression de l'appareil transcriptionnel et du transcriptome plastidial durant les trois phases de formation de la graine d'Arabidopsis thaliana, c'est à dire l'embryogenèse, la maturation (phase photosynthétique) et la dessiccation. L'expression globale du transcriptome plastidial montre que les changements quantitatifs des transcrits sont les plus élevés pour les transcrits des gènes liés à la fonction photosynthétique. Ils sont très fortement exprimés pendant la phase de la maturation et diminuent ensuite, comme leurs protéines correspondantes. Nous observons également une forte accumulation des protéines codant les NEP et les sous unités de la PEP pendant la période de maturation des graines, suivie d'une forte diminution pendant la dessiccation. Cependant, les ARNm correspondants augmentent pendant la dessiccation. Le stockage de ces ARNm codant l'appareil transcriptionnel constitue une étape cruciale pour l'efficacité de la germination de la graine. La quantité de matériel biologique disponible pour ces études étant très limitée, nous avons développé une nouvelle technique de détection des ADNc sur lame de quartz, utilisant la microscopie TIRF. Cette méthode augmente la résolution (elle permet la détection de molécules uniques) et diminue considérablement la quantité de matériel nécessaire à l'hybridation. Finalement, nous avons analysé les conditions sous lesquelles se déroule la photosynthèse embryonnaire. Ces études ont montré que la photosynthèse dans l'embryon se déroule dans un environnement particulier, hypoxique, et sous un éclairement enrichi en longueurs d'onde vertes. Cependant, la structure et le fonctionnement de l'appareil photosynthétique sont semblables à ceux d'une feuille. Nous avons également montré que l'étape transitoire de la photosynthèse embryonnaire est indispensable à la vigueur germinative des graines. Les résultats obtenus lors de ce travail apportent de nouvelles informations sur le fonctionnement de la transcription plastidiale au cours de la formation de la graine. L'importance de l'accumulation d'ARNm, de certaines protéines ainsi que celle de la photosynthèse embryonnaire dans la vigueur germinative ont été soulignées. Ces données permettent de comprendre comment l'efficacité de la germination est conditionnée par la phase de formation de la graine. / Transcription of the plastid genome, one of the three genomes (nuclear, mitochondrial and plastidial) that co-exist in the plant cell, is performed by three ARN polymerases. Two NEPs (Nucleus-Encoded Plastid RNA polymerases) transcribe mainly housekeeping genes and one PEP (plastid-encoded RNA polymerase) transcribes principally photosynthesis related genes. PEP needs transcription factors of the sigma type that are nucleus-encoded. We have previously shown that all three RNA polymerases are present in dry seeds and are necessary for efficient germination. These findings raised the question of how theses RNA polymerases come into the dry seeds and what is the importance of plastid gene expression during seed formation. To answer this question my work consisted in the characterization of plastid gene expression profiles and the expression of the components of the plastid transcriptional machinery during the three phases of seed formation, i. e. embryogenesis, maturation (embryonic photosynthesis) and desiccation. The analysis of global plastid transcriptome patterns shows that mRNAs encoding proteins engaged in photosynthesis show the highest quantitative changes during seed formation. Highest mRNA levels are observed during maturation. During desiccation, photosynthesis related mRNA levels as well as the levels of the corresponding proteins strongly decrease. Concerning the expression of NEP and PEP components, we observe also a peak of protein accumulation during maturation that is followed by a strong diminution of the protein levels. On the other hand, the corresponding mRNAs increase continuously during desiccation. This means that these mRNAs accumulate without being translated. We conclude that the storage of mRNAs coding components of the plastid transcriptional machinery in dry seeds is important for efficient germination. Regarding the limited amount of biological material that is available for these types of studies, we have developed a new method for cDNA analyses on microchips that utilises quartz plates and TIRF microscopy. In this way we can visualise single molecules and the amount of necessary material is considerable diminished. Finally, we have also partially characterized the conditions under which embryonic photosynthesis is performed. These studies show that photosynthesis occurs in a special environment that is characterized by hypoxic atmosphere and green enriched light. However, the structure and functioning of the photosynthetic apparatus in seed chloroplasts seems to be very similar to that of chloroplasts in green leaves. This opens the question of how seed photosynthesis can be efficient. On the other hand we have shown that embryonic photosynthesis is indeed very important for efficient germination. Altogether, results provide new information on the functioning of plastid photosynthesis and transcription during seed formation. They underline the importance of the accumulation of NEP and PEP coding mRNAs in dry seeds. We suggest that embryonic photosynthesis influences seed germination not only by providing reserve compounds but also by producing NEP and PEP proteins. Although the majority of these proteins are degraded during desiccation, traces persist and are stored in dry seeds thus assuring immediate transcription of the plastid genome during imbibition/stratification. Our results explain how efficiency of germination is conditioned during seed formation.

Les organes aériens des plantes sont générés par le méristème apical caulinaire (MAC), dont la mise en place et le maintien ont été largement étudiés. Alors qu’un vaste réseau de gènes assure une régulation robuste de la population de cellules souches, deux gènes se distinguent ; CLAVATA3 (CLV3) et WUSCHEL (WUS). CLV3 s’exprime dans les cellules souches et code pour un peptide signal dont la liaison à des récepteurs transmembranaires mène à la sous-régulation de WUS. Ce dernier code pour un facteur de transcription dans le centre organisateur sous-jacent. En retour, WUS active directement l’expression de CLV3 et l’équilibre entre ces deux molécules est primordial pour la restriction de la population de cellules souches. La perte d’activité de CLV3 conduit à une augmentation de la taille du MAC, tandis que la perte d’activité de WUS abolit le MAC. Selon le modèle actuel, l’apex élargi des mutants clv3 est composé de cellules souches en sur-prolifération. Précédemment, notre groupe a couplé la microscopie à force atomique (mesurant la rigidité cellulaire) à la microscopie confocale (déterminant l’identité cellulaire) et a montré que l’identité des cellules souches est corrélée à une rigidité plus élevée. Dans cette thèse, je montre que les MAC clv3 ont des défauts d’organisation et de mécanique puisque leurs cellules sont moins rigides que ce que prédit le modèle, suggérant que les MAC clv3 diffèrent mécaniquement des cellules souches. J’examine cette contradiction en utilisant un ensemble de gènes exprimés dans différents domaines du MAC pour montrer que les MAC clv3 sont des mosaïques de cellules exprimant simultanément des gènes indiquant un état indifférencié et d’autres indiquant des états de différenciation. De plus, je montre que la composition cellulaire du MAC clv3 diffère de celle du sauvage, que la taille des cellules est dérégulée et que la surface du MAC clv3 est altérée.Notre hypothèse est que les cellules des MAC clv3 subissent un phénomène de ‘stop-start’, au cours duquel leur identité oscille entre cellule souche et cellule différenciée, conduisant à des changements morphométriques à l’origine des phénotypes clv3. En résumé, le ré-examen du rôle que joue CLV3 dans la morphogenèse au niveau du MAC, et donc du modèle CLV-WUS d’homéostasie des cellules souches, me mène à la conclusion que notre vision actuelle est limitée et que les paramètres mécaniques sont à prendre en compte pour une compréhension plus exhaustive des cellules souches. / The shoot apical meristem (SAM) gives rise to above-ground organs and its establishment and homeostasis have been extensively studied. While a vast genetic network ensures the robust regulation of the stem cell population, two genes, CLAVATA3 (CLV3) and WUSCHEL (WUS), are key players. CLV3 is expressed in stem cells and encodes a secreted peptide to signal via transmembrane receptors to downregulate WUS, which encodes a transcription factor in the underlying organising centre. In turn, WUS directly activates the expression of CLV3 and the balance between the two molecules restrains the stem cell pool. The loss of CLV3 activity leads to an increase in SAM size, whereas the loss of WUS activity abolishes the SAM. The prevailing model is that the enlarged clv3 apex is composed of over-proliferating stem cells.Previously, our group coupled atomic force microscopy (to measure cell rigidity) and confocal microscopy (to determine cell identity) to show that stem cell identity correlates with increased stiffness. In this thesis, I show that in addition to altered mechanics, enlarged clv3 SAM also display severe defects in cell organisation. I find that cells in clv3 SAM are soft, instead of being stiff, as we had predicted in light of the model regarding the clv3 phenotype. Our data instead suggest that clv3 SAM differ mechanically from stem cells. I further investigate this contradiction using genetic markers for different domains of the SAM and show that clv3 SAM are in fact mosaic structures, made up of cells that simultaneously express genes that indicate an undifferentiated state and several that indicate multiple states of differentiation. Additionally, I show that the cellular makeup of mutant SAM is significantly altered from the wild type, with a misregulation of cell size in the outer cell layers. Furthermore, mutant SAM also display altered surface smoothness from wild-type SAM.Our working hypothesis is that in clv3 mutant SAM, cells undergo a constant stop-start phenomenon, where they cycle between stemness and specification, resulting in cell-level morphometric changes that generate the characteristic clv3 phenotypes. In summary, during my thesis, I have re-examined the role of CLV3 in morphogenesis at the SAM, and thus the CLV-WUS model of stem cell homeostasis. I conclude that the existing view in the field is limited, and that mechanical parameters need to be considered for a fuller understanding of stem cells.

L’hydrolyse des triglycérides (TG) du tissu adipeux est initialisée par l’action de l’adipocyte TG lipase (ATGL), activée par son cofacteur la protéine CGI-58. Des mutations du gène codant les protéines CGI-58 ou ATGL sont respectivement à l’origine du syndrome de Chanarin-Dorfmann et de maladies de stockagede lipides neutres. La protéine CGI-58 appartient à la famille des a/ß-hydrolases, elle en possède la triade catalytique Ser-Asp/Glu-His caractéristique des carboxylester hydrolases, ainsi que le motif HX4D, caractéristique d’une activité acyltransférase. A ce jour, le rôle de la protéine CGI-58, chez les mammifères ou chez les plantes, n’est pas totalement éclairci, de même que son activité enzymatique. Dans le but de mieux comprendre le rôle de cette protéine CGI-58 dans le métabolisme lipidique, nous avons développé une nouvelle stratégie, en générant notamment de nouveaux plasmides qui nous ont permis d’exprimer et de purifier la protéine CGI-58 de souris et de plantes, ainsi que l’ATGL murine, dans différents souches d’E. coli, pour tester l’activité in vitro de ces protéines. De plus, nous avons mis en place, en utilisant ces plasmides générés et différentes souches E. coli, un système qui nous a permis de tester in vivo, dans E. coli, l’activité acyltransférase (LPAAT et/ou LPGAT) de la protéine CGI-58. En utilisant ces différentes techniques, nous avons pu montrer, aussi bien in vivo qu’in vitro, que la protéine CGI-58 de plante, ainsique celle de mammifère, ne possède ni activité LPAAT ni activité LPGAT, et que la protéine CGI-58 de plante est dépourvue d’activité TG lipase ou phospholipase. Cependant, nous avons montré, en analysant, par chromatographie sur couche mince et par spectrométrie de masse, des extraits lipidiques des différentes souches d’E. coli exprimant la protéine CGI-58, que l’expression de la protéine de plante, et non celle de mammifère, aboutit à une diminution du taux de phosphatidylglycérol (PG) dans les différentes souchestestées, et a contrario nous avons montré que la mutation de la sérine, ainsi que la mutation de l’histidine de la triade catalytique potentielle, restaure le phénotype sauvage. Ces résultats nous ont permis de proposer que la protéine CGI-58 de plante est impliquée dans le métabolisme du PG / Triglycerides (TG) hydrolysis in adipose tissue is initialized by the action of the adipose TG lipase (ATGL) and its cofactor, the CGI-58 protein. Mutations in the gene coding the CGI-58 or ATGL proteins are the cause of the syndrome of Chanarin-Dorfman and of neutral lipids storage disease, respectively. CGI-58 protein belongs to the a/ß-hydrolase family, harboring the catalytic triad Ser-Asp/Glu-His, characteristic of carboxylester hydrolases, as well as the HX4D motif, characteristic of acyltransferase activity. Nowadays, the role and the enzymatic activity of the CGI-58 protein, in mammalians and plants, are not quite clear. In order to better understand the function of CGI-58 protein in lipid metabolism, we developed a new strategy using a new set of plasmids that enabled us, with the use of pET28b(+) plasmid, to express and purify the CGI-58 protein of mice and plants as well as the murine ATGL. These proteins were expressed in different E. coli strains, to test in vitro their activity. In addition, we have set up, using the generated plasmids and different E. coli strains, a system that allowed us to test the in vivo acyltransferase activity (LPAAT and/or LPGAT) of the CGI-58 proteins expressed in E. coli. Using these techniques, we demonstrated in vivo and in vitro that both mice and plant CGI-58 proteins, are neither able to catalyze a LPAAT or a LPGAT reaction, and that the plant CGI-58 protein is devoid of TG lipase or phospholipase activity. However we have shown, by analyzing lipid extracts, by thin layer chromatography and by mass spectrometry of different E. coli strains expressing the CGI-58 protein, that the expression of the plant CGI-58 protein, but not the mice one, results in a decrease of phosphatidylglycerol (PG) content in the different strains tested. However the mutation of the serine or histidine residue of the putative catalytic triad restores the wild-typephenotype. These results allowed us to propose that plant CGI-58 protein is involved in the metabolism of PG

Pectic polysaccharides, a class of plant cell wall polymers, form one of the most complex networks known in nature. Despite their complex structure and their importance in plant biology, little is known about the molecular mechanism of their biosynthesis, modification, and turnover, particularly their structure-function relationship. One way to gain insight into pectin metabolism is the identification of mutants with an altered pectin structure. Those were obtained by a recently developed pectinase-based genetic screen. Arabidopsis thaliana seedlings grown in liquid medium containing pectinase solutions exhibited particular phenotypes: they were dwarfed and slightly chlorotic. However, when genetically different A. thaliana seed populations (random T-DNA insertional populations as well as EMS-mutagenized populations and natural variations) were subjected to this treatment, individuals were identified that exhibit a different visible phenotype compared to wild type or other ecotypes and may thus contain a different pectin structure (pec-mutants). After confirming that the altered phenotype occurs only when the pectinase is present, the EMS mutants were subjected to a detailed cell wall analysis with particular emphasis on pectins. This suite of mutants identified in this study is a valuable resource for further analysis on how the pectin network is regulated, synthesized and modified. Flanking sequences of some of the T-DNA lines have pointed toward several interesting genes, one of which is PEC100. This gene encodes a putative sugar transporter gene, which, based on our data, is implicated in rhamnogalacturonan-I synthesis. The subcellular localization of PEC100 was studied by GFP fusion and this protein was found to be localized to the Golgi apparatus, the organelle where pectin biosynthesis occurs. Arabidopsis ecotype C24 was identified as a susceptible one when grown with pectinases in liquid culture and had a different oligogalacturonide mass profile when compared to ecotype Col-0. Pectic oligosaccharides have been postulated to be signal molecules involved in plant pathogen defense mechanisms. Indeed, C24 showed elevated accumulation of reactive oxygen species upon pectinase elicitation and had altered response to the pathogen Alternaria brassicicola in comparison to Col-0. Using a recombinant inbred line population three major QTLs were identified to be responsible for the susceptibility of C24 to pectinases. In a reverse genetic approach members of the qua2 (putative pectin methyltransferase) family were tested for potential target genes that affect pectin methyl-esterification. The list of these genes was determined by in silico study of the pattern of expression and co-expression of all 34 members of this family resulting in 6 candidate genes. For only for one of the 6 analyzed genes a difference in the oligogalacturonide mass profile was observed in the corresponding knock-out lines, confirming the hypothesis that the methyl-esterification pattern of pectin is fine tuned by members of this gene family. This study of pectic polysaccharides through forward and reverse genetic screens gave new insight into how pectin structure is regulated and modified, and how these modifications could influence pectin mediated signalling and pathogenicity. / Pektin Polysaccharide, eine Klasse pflanzlicher Zellwand Polymere, formen eine der komplexesten natürlichen Strukturen. Trotz seiner immensen Bedeutung in der Biologie der Pflanzen sind die Kenntisse über die molekularen Mechanismen der Pektin Biosynthese, dessen Modifikation und Abbau überraschend gering. Eine Möglichkeit neue Einblicke in den pflanzlichen Pektin Metabolismus zu erhalten, ist die Identifizierung von Mutanten mit veränderter Pektinstruktur. Solche Mutanten konnten durch ein neuatiges Selektionsverfahren gefunden werden. Zieht man Keimlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) in Flüssigmedium mit Pektinase an, so lässt sich ein typischer Phänotyp beobachten: Die Pflanzen sind kleinwüchsig und leicht chlorotisch. Diesem Verfahren wurden Populationen verschiedener Genotypen (Insertions Linien, EMS Mutanten, natürlich vorkommende Varianten) ausgesetzt. Auf diese Weise wurden Individuen identifiziert, die gegenüber der Pektinase Behandlung eine verminderte oder erhöhte Resistenz aufweisen, was auf eine veränderte Pektinstruktur hindeutet. Die EMS Mutanten wurden einer detaillierten Zellwand Analyse unterzogen. die so in dieser Arbeit identifizierte Kollektion von Mutanten stellt eine wertvolle Ressource für weitere Forschungsansätze zur Regulation, Biosynthese und Modifikation des Pektins dar. Die Lokalisation der Insertionen in den T-DNA Linien führte zur Identifikation interessanter Gene, zu denen der putative Zuckertransporter PEC100 gehört. Dieses Gen steht vermutlich in Verbindung mit der Synthese von Rhamnogalakturonan-I, einem Bestandteil des Pektins. In dieser Arbeit konnte PEC100 im Golgi Apparat, dem Ort der Pektin Biosynthese, lokalisiert werden. Die natürlich vorkommende Variante C24 ist besonders empfindlich gegenüber der Pektinase. Diese Empfindlichkeit konnte anhand rekombinanter Inzucht Linien auf drei bedeutende quantitative Merkmalsloci (QTL) eingegrenzt werden. C24 zeigte zudem ein gegenüber der Referenz verändertes Massenprofil der Oligogalakturonide. Diese werden derzeit als Signalmoleküle in der pflanzlichen Pathogenabwehr diskutiert, was mit der in dieser Arbeit geseigten Resistenz von C24 gegenüber Schwarzfleckigkeit verursachende Pilz (Alternaria brassicicola) korreliert. In einem revers-genetischen Ansatz wurden zudem Mitglieder der Pektin Methyltransferase Familie als potentielle Enzyme getestet, die die Pektin Methylesterifikation beeinflussen könnten. Diese Mutation in einer dieser Methyltransferasen führte zu Veränderungen des Oligogalakturonid Massenprofils. Dies bestätigt die Hypothese, dass Mitglieder dieser Genfamilie an der Regulation der Methylesterifikation von Pektin beteiligt sind. Die vorliegende Studie, in der ein genetishen Selektionverfahren und Methoden der reversen Genetik kombiniert wurden, hat neue Einblicke in die Regulation und Modifikation von Pektin geliefert.

About 2,000 of the more than 27,000 genes of the genetic model plant Arabidopsis thaliana encode for transcription factors (TFs), proteins that bind DNA in the promoter region of their target genes and thus act as transcriptional activators and repressors. Since TFs play essential roles in nearly all biological processes, they are of great scientific and biotechnological interest. This thesis concentrated on the functional characterisation of four selected members of the Arabidopsis DOF-family, namely DOF1.2, DOF3.1, DOF3.5 and DOF5.2, which were selected because of their specific expression pattern in the root tip, a region that comprises the stem cell niche and cells for the perception of environmental stimuli. DOF1.2, DOF3.1 and DOF3.5 are previously uncharacterized members of the Arabidopsis DOF-family, while DOF5.2 has been shown to be involved in the phototrophic flowering response. However, its role in root development has not been described so far. To identify biological processes regulated by the four DOF proteins in detail, molecular and physiological characterization of transgenic plants with modified levels of DOF1.2, DOF3.1, DOF3.5 and DOF5.2 expression (constitutive and inducible over-expression, artificial microRNA) was performed. Additionally expression patterns of the TFs and their target genes were analyzed using promoter-GUS lines and publicly available microarray data. Finally putative protein-protein interaction partners and upstream regulating TFs were identified using the yeast two-hybrid and one-hybrid system. This combinatorial approach revealed distinct biological functions of DOF1.2, DOF3.1, DOF3.5 and DOF5.2 in the context of root development. DOF1.2 and DOF3.5 are specifically and exclusively expressed in the root cap, including the central root cap (columella) and the lateral root cap, organs which are essential to direct oriented root growth. It could be demonstrated that both genes work in the plant hormone auxin signaling pathway and have an impact on distal cell differentiation. Altered levels of gene expression lead to changes in auxin distribution, abnormal cell division patterns and altered root growth orientation. DOF3.1 and DOF5.2 share a specific expression pattern in the organizing centre of the root stem cell niche, called the quiescent centre. Both genes redundantly control cell differentiation in the root´s proximal meristem and unravel a novel transcriptional regulation pathway for genes enriched in the QC cells. Furthermore this work revealed a novel bipartite nuclear localisation signal being present in the protein sequence of the DOF TF family from all sequenced plant species. Summing up, this work provides an important input into our knowledge about the role of DOF TFs during root development. Future work will concentrate on revealing the exact regulatory networks of DOF1.2, DOF3.1, DOF3.5 and DOF5.2 and their possible biotechnological applications. / Mehr noch als Tiere, die ihren Lebensraum unter widrigen Umständen verlassen können, sind Pflanzen mit einem festen Standort auf ihre Anpassungsfähigkeit angewiesen. Einen entscheidenden Beitrag dazu leistet die Genregulation, d.h. das gezielte An- und Ausschalten von Erbanlagen, den Genen. Vermittelt wird dieser Regulationsprozess unter anderem durch Transkriptionsfaktoren: Proteine, die die Fähigkeit besitzen, an bestimmte Regionen der Gene zu binden und damit deren Aktivität zu beeinflussen. In der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), die als Modellpflanze in der Genetik verwendet wird, existieren etwa 2000 solcher Transkriptionsfaktoren, eingeteilt in Familien, von denen einige auch in tierischen Organismen auftreten, andere pflanzenspezifisch sind. Auf Grund ihrer Funktion als wichtige Kontrollelemente sind sie von großem wissenschaftlichem und biotechnologischem Interesse. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die Funktion von vier pflanzenspezifischen Transkriptionsfaktoren, genannt DOF1.2, DOF3.1, DOF3.5 und DOF5.2, untersucht werden, welche durch ihre spezifische Aktivität in der Wurzelspitze der Ackerschmalwand identifiziert wurden. Um die Funktion dieser vier Regulatoren aufzuklären, wurden an der Modellpflanze gentechnische Veränderungen durchgeführt und die so veränderten, auch als transgen bezeichneten Pflanzen mit molekularbiologischen und physiologischen Methoden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass DOF1.2 und DOF3.5 eine wesentliche Funktion beim gerichteten Wurzelwachstum spielen und ein seitliches Wachsen der Wurzel aufgrund veränderter Umwelteinflüsse verhindern, bzw. hervorrufen können. Die beiden anderen Proteine DOF3.1 und DOF5.2 erfüllen ihre Funktion in der Stammzellnische der Wurzel. Vergleichbar mit tierischen Stammzellen sind auch pflanzliche Stammzellen nicht zu einem bestimmten Zelltyp herangereift, sondern verbleiben in einem sogenannten undifferenzierten Zustand. Es konnte gezeigt werden, dass DOF3.1 und DOF5.2 zum Erhalt dieses Zustands benötigt werden, da nach Inaktivierung beider Proteine Zellspezialisierungen auftreten, die bei gentechnisch unveränderten Pflanzen nicht auftreten. Desweiteren konnte in dieser Arbeit geklärt werden, welcher Proteinabschnitt der DOF-Proteine für ihren Transport in den Zellkern notwendig ist. Denn da die pflanzlichen Erbanlagen im Zellkern vorliegen, muss für eine Einflussnahme auf deren Aktivität zunächst ein Transport der Regulationsproteine in den Zellkern stattfinden. Zusammengenommen konnte mit dieser Doktorarbeit das Wissen über Transkriptionsfaktoren und Entwicklungsprozesse der Wurzel erheblich erweitert werden. Zudem ist die Grundlage für interessante zukünftige Arbeiten gelegt worden. Dabei wird es von zentraler Bedeutung sein, komplexe Regulationsnetzwerke verstehen zu lernen und durch gezielte Manipulationen biotechnologisch nutzen zu können.

Diese Arbeit umfasst die Archivierung, Visualisierung anhand bioinformatischer Methoden und Interpretation eines vorhandenen Messdatensatz (Element [ICP-MS]-, Ionen [IC]- und Metabolitdaten [RP-HPLC und GC/TOF-MS]) der Pflanze Arabidopsis thaliana getrennt in Blätter und Wurzeln. Die Pflanzen wurden den sechs Mangelsituationen der Nährstoffe Eisen, Kalium, Magnesium, Stickstoff, Phosphor und Schwefel ausgesetzt und zu neun Messzeitpunkten [0.5-, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-in Tagen und „resupply“ (vier Stunden nach dem vierten Tag)] analysiert. Es erfolgte die Integration der Messdaten in eine SQlite-Datenbank. Die Veranschaulichung erfolgte mit Hilfe der Programmiersprache R. Anhand einiger Pakete zur Erweiterung des Funktionsumfangs von R wurde erstens eine Schnittstelle zur SQLite- Datenbank hergestellt, was ein Abfragen an diese ermöglichte und zweitens verhalfen sie zu der Erstellung einer Reihe zusätzlicher Darstellungsformen (Heatmap, Wireframe, PCA). Selbstgeschriebene Skripte erlaubten den Datenzugriff und die grafische Ausgabe als z. B. Heatmaps. In der Entstehung dieser Arbeit sind weiterhin zwei weitere Visualisierungsformen von PCA-Daten entwickelt worden: Das Abstandsdiagramm und die animierte PCA. Beides sind hilfreiche Werkzeuge zur Interpretation von PCA-Plots eines zeitlichen Verlaufes. Anhand der Darstellungen der Element- und Ionendaten ließen sich die Nährstoffmangelsituationen durch Abnahme der entsprechenden Totalelemente und Ionen nachweisen. Weiterhin sind starke Ähnlichkeiten der durch RP-HPLC bestimmten Metaboliten unter Eisen-, Kalium und Magnesiummangel erkannt worden. Allerdings gibt es nur eine geringe Anzahl an Interkationen der Metabolitgehalte, da der Großteil der Metabolitlevel im Vergleich zur Kontrolle unverändert blieb. Der Literaturvergleich mit zwei Publikationen, die den Phosphat- und Schwefelmangel in Arabidopsis thaliana untersuchten, zeigte ein durchwachsenes Ergebnis. Einerseits gab es eine gleiche Tendenz der verglichenen Aminosäuren zu verzeichen, aber andererseits wiesen die Visualisierungen auch Gegensätzlichkeiten auf. Der Vergleich der mit RP-HPLC und GC/TOF-MS gemessenen Metaboliten erbrachte ein sehr kontroverses Ergebnis. Zum einen wurden Übereinstimmungen der gleichen Metaboliten durch gemeinsame Cluster in den Heatmaps beobachtet, zum anderen auch Widersprüche, exemplarisch in den Abstandsdiagrammen der Blätterdaten jedes Verfahrens, in welchen unterschiedliche Abstandshöhepunkte erkennbar sind. / This manuscript deals with archiving, visualization with bioinformatic methods and the interpretation of an existing measuring dataset (element [ICP-MS]-, ions [IC]- and metabolit data [RP-HPLC and GC/TOF-MS]) of the plant Arabidopsis thaliana – for either its leaves and roots. These plants have been subjected to six situations of deficiency according to the nutrients iron, potassium, magnesium, nitrate, phosphor, and sulfur. They have been analyzed for nine time-points of measurement [0.5-, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- in days and “resupply” (four hours after the fourth day). While the measuring data has been integrated in a SQLite-database, its illustration has been carried out with the help of the programming language R. In order to extend the functional range of R, first, an interface to the SQLite-database has been established, which offered the query to this and, secondly, it helped to create a row of additional display formats (heatmaps, wireframe, PCA). Self-written scripts allowed the access to the data and the graphical output, for example as heatmaps. Additionally two more visualization formats for the PCA-data have been designed in the development of this manuscript: the distance-diagram and the animated PCA. Both are useful tools to interpret PCA-plots during a specific course of time. Based on the illustration of element and ion data the situations of deficiency for several nutrients could be detected by the decrease of the corresponding total-elements and ions. Furthermore, obvious similarities between the metabolits, which were measured through RP-HPLC, have been examined under iron-, potassium- and magnesium-deficit. There are certainly only a low number of interactions regarding to the content of metabolits because most of the metabolit level did not change in comparison to the control. The comparative study of specialist literature – in this case of two particular publications –, which analyzed the deficit of phosphate and sulfate in Arabidopsis thaliana, presented an intermingled result. On the one hand a similar tendency of the compared amino acid could be observed, but on the other hand the visualizations showed opposites, too. The comparison of the metabolits measured by RP-HPLC and GC/TOF-MS effected a very controversial result. Although there are analogies between the same metabolits through common clusters in the heatmaps, contradictory elements can also be found – for example in the distance-diagram of the data of the leaves for each procedure in which different distance-peaks are recognizable.

Les plantes conservent la capacité à former de nouveaux organes tout au long de leur vie grâce au maintien de structures contenant des cellules souches, les méristèmes. La formation des fleurs, structures reproductives de la plante, est une étape essentielle de son cycle de vie. Afin d’assurer un développement floral complet, un méristème doit être formé de novo au sein du jeune bouton floral. Des données éparses de la littérature indiquent que le facteur de transcription LEAFY, en plus d’être un régulateur clé de l’identité florale, est aussi impliqué dans la mise en place du méristème floral.Dans la première partie de ce travail nous explorons le rôle de LEAFY dans l’initiation du méristème floral. Cette étude est concentrée sur un gène cible de LEAFY, le facteur de transcription REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAX1). Nous montrons notamment que la voie régulée par LEAFY/RAX1 agit en parallèle du facteur de transcription REVOLUTA pour permettre la mise en place du méristème floral.Dans la deuxième partie de ce travail nous étudions les propriétés du domaine N-terminal de LEAFY. Ce domaine permet l’oligomérisation de LEAFY ainsi que potentiellement sa liaison aux régions fermées de la chromatine. Nous étudions également de manière plus exploratoire le rôle de ce domaine dans la régulation de l’expression du gène AGAMOUS, un important régulateur du développement floral. / Plants have the capacity to continuously produce organs throughout their life because they maintain stem cells containing structures called meristems. The formation of flowers is an essential step of the plant’s life-cycle. In order to ensure flower development, a new meristem must be formed within the young flower bud. Various data across the literature indicate that the transcription factor LEAFY is involved flower meristem formation in addition to its role as a master regulator of flower identity.In the first part of this work we explore the role of LEAFY in the initiation of flower meristem. This study focuses on a LEAFY target gene, the transcription factor REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAX1). We show that the LEAFY/RAX1 pathway acts in parallel of the transcription factor REVOLUTA to allow flower meristem formation.In the second part of this work we study the properties of the N-terminal domain of LEAFY. This domain mediates LEAFY oligomerization and potentially its binding to closed chromatin regions. We also study in a more prospective manner the role of this domain in the transcriptional regulation of AGAMOUS, an important regulator of flower development.

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. / Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.