京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18496号 / 理博第4011号 / 新制||理||1578(附属図書館) / 31382 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 西村 いくこ, 教授 鹿内 利治, 教授 長谷 あきら / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

Signal transduction pathways play a critical role in plant growth and reproduction by perceiving extracellular signals, leading to a cellular response. FERONIA (FER) is a transmembrane receptor kinase found on the plasma membrane in the model plant Arabidopsis thaliana and plays critical roles in growth, development, and fertilization. FER works upstream of master molecular switch RAC/ROP GTPase to regulate signaling into the cytoplasm. LORELEI-Like Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anchored Protein 1(LLG1) is a GPI-anchored protein and co-receptor of FER on the plasma membrane. LLG1 is responsible for chaperoning FER from the endoplasmic reticulum (ER) to its functional location on the plasma membrane. Rapid Alkalinization Factor 1 (RALF1) is a small, secreted growth-regulatory peptide that interacts with FER, regulating signaling activity. This interaction, among other, regulates the activity of a downstream plasma membrane proton ATPase (AHA2) which impacts cell growth. Additionally, published pulldown data indicates LLG1, FER, and RALF1 complex together. My data suggests that LLG1, in addition to localizing and chaperoning FER, binds directly to RALF1. My results show that this RALF1-LLG1 interaction is required for proper RALF1 mediated signaling through FER. Data also indicates that FER and LLG1 regulate RALF1 location on the plasma membrane. Additionally, RALF1 binds the MALA domain of FER. Another aspect of my thesis focuses on LURE1. LURE1 is a secreted cysteine-rich, defensin like protein which guides incoming pollen tubes to the ovule in a process called pollen tube guidance. LURE1 guides pollen tubes by binding with pollen-specific receptor kinase 6 (PRK6), located on the plasma membrane of the incoming pollen tubes, to facilitate proper fertilization. My data also shows that the ovule derived signaling molecule nitric oxide (NO), also regulated by FER, negatively impacts the property of LURE1, causing it to fall out of solution and aggregate. Furthermore, the negative impact of NO on LURE1 disrupts the binding affinity of LURE1 to PRK6. Together with data from my lab showing pollen tube arrival at the ovule triggers NO production in a FER dependent manner, my findings provide a biochemical explanation for why pollen tubes do not target fertilized ovules.

Tesis por compendio / [ES] Como precursores de las semillas, los óvulos representan un órgano fundamental durante el ciclo de vida de las plantas. Debido a su importancia, el desarrollo del óvulo ha sido estudiado durante décadas desde un punto de vista morfológico y molecular, lo que ha permitido dilucidar la compleja e intrincada red de regulación genética que lo rige. En concreto, la iniciación del óvulo está controlada por las hormonas vegetales auxinas, citoquininas y brasinoesteroides (BRs), siendo todas ellas reguladoras positivas del número de óvulos. Recientemente demostramos que las giberelinas (GAs) modulan negativamente el número de óvulos mediante la desestabilización de las proteínas DELLA. Sin embargo, aún debe aclararse cómo encajan las GAs y las proteínas DELLA en el modelo regulador de la iniciación de los óvulos. El trabajo presentado en esta tesis doctoral tiene como objetivo aclarar el mecanismo molecular por el cual las GAs actúan en la iniciación del óvulo. Después de una introducción general, en el Capítulo 1 mostramos que tanto las GAs como los BRs regulan el número de óvulos en Arabidopsis independientemente de los niveles de actividad de la otra hormona, lo que sugiere que las GAs y los BRs actúan de forma independiente para controlar la iniciación del óvulo. En el Capítulo 2 proporcionamos evidencias genéticas y moleculares que apuntan a que las proteínas DELLA participan en la iniciación de los óvulos mediante su interacción con el factor de transcripción CUC2 en las células placentarias. En conjunto, los hallazgos presentados aquí nos han permitido integrar a las GAs y proteínas DELLA en la red genética que guía el inicio de los primordios de óvulos. Una discusión final destaca las preguntas abiertas que aún deben abordarse para comprender completamente el control hormonal de la iniciación de los óvulos en las plantas. / [CAT] Com a precursors de les llavors, els òvuls representen un òrgan fonamental durant el cicle de vida de les plantes. A causa de la seva importància, el desenvolupament de l'òvul ha estat estudiat durant dècades des d'un punt de vista morfològic i molecular, el que ha permès dilucidar la complexa i intricada xarxa de regulació genètica que el regeix. En concret, la iniciació del òvul està controlada per les hormones vegetals auxines, citoquinines i brasinoesteroides (BRs), sent totes elles reguladores positives del nombre d'òvuls. Recentment demostrem que les gibberel·lines (GAs) modulen negativament el nombre d'òvuls mitjançant la desestabilització de les proteïnes DELLA. No obstant, encara s'ha d'aclarir com encaixen les GAs i les proteïnes DELLA al model regulador de la iniciació dels òvuls. El treball presentat en aquesta tesi doctoral té com a objectiu aclarir el mecanisme molecular pel qual les GAs actuen a la iniciació de l'òvul. Després d'una introducció general, al Capítol 1 mostrem que tant les GAs com els BRs regulen el nombre d'òvuls a Arabidopsis independentment dels nivells d'activitat de l'altra hormona, cosa que suggereix que les GAs i els BRs actuen de forma independent per controlar la iniciació de l'òvul. Al Capítol 2 proporcionem evidències genètiques i moleculars que apunten que les proteïnes DELLA participen en la iniciació dels òvuls mitjançant la seva interacció amb el factor de transcripció CUC2 a les cèl·lules placentàries. En conjunt, els descobriments presentats ací ens han permès integrar les GAs i proteïnes DELLA a la xarxa genètica que guia l'inici dels primordis d'òvuls. Una discussió final destaca les preguntes obertes que encara cal abordar per comprendre completament el control hormonal de la iniciació dels òvuls a les plantes. / [EN] As precursors of seeds, ovules represent a fundamental organ during the plant life cycle. Due to their importance, ovule development has been studied for decades from a morphological and molecular point of view, allowing the elucidation of a complex and intricate gene regulatory network governing it. Specifically, ovule initiation is controlled by the plant hormones auxins, cytokinins and brassinosteroids (BRs), all of them being positive regulators of ovule number. Recently, we demonstrated that gibberellins (GAs) negatively module ovule number by the destabilization of DELLA proteins. However, how GAs and DELLA proteins fit in the regulatory model for ovule initiation still needs to be clarified. The work presented in this PhD thesis aims to clarify the molecular mechanism by which GAs act in ovule initiation. After a comprehensive introduction, we show in Chapter 1 that both GAs and BRs regulate ovule number in Arabidopsis regardless of the activity levels of the other hormone, suggesting that GAs and BRs act independently to control ovule initiation. In Chapter 2 we provide genetic and molecular evidence pointing to DELLA proteins participating in ovule initiation by the interaction with the CUC2 transcription factor in placental cells. Collectively, the findings presented here allowed us to integrate GAs and DELLA proteins in the gene regulatory network guiding ovule primordia initiation. A final discussion highlights open questions that still need to be addressed to fully understand the hormonal control of ovule initiation in plants. / La realización de esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a un contrato para la Formación de Personal Investigador de la Universidad Politécnica de Valencia (durante un año y medio) y a un contrato para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/00331) del Ministerio de Universidades (durante dos años y medio). Las estancias breves en Chile y Francia fueron posible gracias a la financiación H2020-MSCA-RISE-2014 y a una ayuda EMBO Short-Term (STF 8961), respectivamente. El trabajo experimental ha sido financiado por los proyectos BIO2017-83138-R y PID2020-113920RB-100 del Ministerio de Ciencia e Innovación y AICO/2020/256 de la Generalitat Valenciana. / Barro Trastoy, D. (2022). Gibberellins and ovule number: a molecular mechanism [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/187756 / TESIS / Compendio

To survive, an organism must constantly adjust its internal state to changes in the environment from which it receives signals. The signals set off a chain of events referred to signal transduction. Signal transduction systems are especially important in multicellular organisms, such as plants and animals, because of the need to coordinate the activities of hundreds to trillions of cells. Plants, in particular, have a special need for perceiving signals from their environment because of their static nature. As in the animal cell, the first steps in perception of a signal include signal interaction with a receptor, signal amplification through second messenger production, and signal termination through second messenger hydrolysis. Myo-inositol polyphosphate 5-phosphatases (5PTases) (EC 3.1.3.56) have unique signal terminating abilities toward the second messenger inositol trisphosphate (Ins (1,4,5)P3, InsP3). In Arabidopsis thaliana there are 15 members of the 5PTase family, the majority of which contain a single 5PTase catalytic domain. Four members of the Arabidopsis 5PTase family, however, have a unique protein domain structure, with additional N-terminal WD40 repeats that are implicated in protein-protein interactions. The research presented here focused on the identification of 5PTase interacting proteins and the characterization of their functional role in Arabidopsis. To accomplish this goal, I examined a 5PTase13-interacting protein, the sucrose (Suc) nonfermenting-1-related kinase, SnRK1.1, an important energy sensor that is highly conserved among eukaryotes. My identification of a 5PTase13:SnRK1.1 complex points to the novel interaction of this metabolic modulator and inositol signaling/metabolism. 5PTase13 , however, plays a regulatory role in other plant specific processes as well, since I also identified the Arabidopsis homolog (Atp80) of the human WDR48 (HsWDR48, Hsp80) as a novel protein interactor of 5PTase13. My results indicate that Atp80 is important for leaf emergence, development and senescence likely via a regulatory interaction with 5PTase13 and PINOID â binding protein (PBP1). / Ph. D.

La présente étude nous a permis de développer un système rapporteur, basé sur le gène bactérien codant pour la β-glucuronidase (GUS), afin de mesurer l’instabilité des microsatellites chez Arabidopsis thaliana. Les microsatellites sont des séquences particulières du génome susceptibles à des mutations fréquentes qui se produisent au cours de la réplication. On a démontré dans ce projet une corrélation entre la longueur du microsatellite et son taux de mutation. De même, l’orientation du microsatellite influence son instabilité. Dans deux études ultérieures, nous avons également étudié l’implication des gènes de correction des mésappariements (système MMR, « Mismatch repair ») dans l’instabilité des microsatellites. Le système MMR corrige les erreurs survenues au cours de la réplication des microsatellites. Nous avons montré que l’inactivation des gènes AtPMS1 et AtMSH2 entraîne l’augmentation de l’instabilité des séquences répétées, d’où l’importance de ces gènes dans le maintien de la stabilité des microsatellites en particulier et du génome en général. / The present study allowed us to develop a reporter system based on a bacterial gene encoding for β-glucuronidase (GUS), in order to measure microsatellite instability in Arabidopsis thaliana. Microsatellites are particular regions of the genome undergoing frequent mutations during replication. A correlation between length of the repetitive tracts and microsatellite instability was demonstrated. Besides, the orientation of the microsatellite influenced its instability. In two later studies, we have also studied the effect of mismatch repair genes (MMR) on microsatellite instability. Mismatch repair system corrects errors that occur during the replication of microsatellites. We showed that inactivation of AtPMS1 and AtMSH2 genes increased tracts instability, hence the importance of these genes in the maintenance of microsatellite stability and genome stability in general.

<p dir="ltr">Communication between the male gametophyte (the tip-growing pollen tube) and the female gametophyte (the synergid cells) is crucial for sexual reproduction in flowering plants. The reception of the pollen tube (PT) depends on its recognition and sensitivity to the signals from the synergid cells for its rupture, sperm release, and double fertilization. Mutations in genes regulating communication between the synergid cells and pollen tube lead to PT overgrowth. Despite significant advances in understanding the molecular mechanism of pollen tube reception in Arabidopsis, there remains a need for more comprehensive information on the impact of natural variations on physiological traits related to pollen tube and synergid signals in pollen tube reception. This research investigates the effects of natural variation on pollen tube sensitivity to synergid signals mediated by NORTIA. In <i>nortia</i> homozygous mutants, PT-synergid communication is disrupted due to lower levels of calcium signals in the synergid cells, resulting in PT overgrowth. Using the Aniline blue staining procedure, this study identified twelve ecotypes of Arabidopsis thaliana out of the twenty-four ecotypes that could suppress the PT overgrowth phenotype of <i>nta-1</i>. I observed that the suppressor ecotypes exhibit characteristics like the Columbia (Col-0) ecotype, while non-suppressor ecotypes resemble the Ws-2 ecotype. Comparing the impact of the Columbia (Col-0) and Wassilewskija (Ws-2) ecotypes on PT overgrowth in the <i>nta-2</i> mutant revealed that Columbia (Col-0) effectively suppressed PT overgrowth compared to Wassilewskija (Ws-2). We investigated the sensitivity of PT integrity mutants to synergid signals. Our results showed that compromised PT integrity mutant genes (<i>mlo1mlo15</i>) partially suppressed PT overgrowth in <i>nta-1</i>. I propose that suppressor ecotypes and mutants may exhibit a heightened sensitivity to synergid signals, that help them to regulate their response to synergid signals finely.</p>

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.

Apyrasen (NTPDasen) sind Nukleosidtri- und diphosphat spaltende Enzyme. Bisher konnten Apyrasen in allen untersuchten Pro- und Eukaryonten nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu tierischen Organismen, in denen Apyrasen gut untersucht sind und eine Rolle in der Nukleotid-vermittelten Signaltransduktion spielen, ist in Pflanzen weit weniger bekannt. In dem Modellorganismus A. thaliana wurden bisher zwei Apyrasen – AtAPY1 und AtAPY2 – als funktionell beschrieben. Durch Knockoutstudien konnte gezeigt werden, dass beide Apyrasen redundant sind. Der Doppelknockout der AtAPY1 und AtAPY2 ist im Gegensatz zum Einzelknockout einer Apyrase letal. Auf Grund von Vorarbeiten wurde die AtAPY1 extrazellulär im Apoplasten vermutet, wo sie eine Rolle im ATP-Signalweg spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte die Apyrase 1 (AtAPY1) biochemisch charakterisiert und subzellulär lokalisiert werden. Die Aufklärung der biochemischen Eigenschaften und der subzellullären Lokalisation der AtAPY1 würde entscheidend mithelfen, die Funktion der Apyrasen in Pflanzen aufzuklären. Für die biochemische Charakterisierung wie der Bestimmung des pH-Optimums und des Substratspektrums der AtAPY1 war die Reinigung einer aktiven AtAPY1 notwendig. Da eine Überexpression einer aktiven AtAPY1 in E. coli nicht möglich war, wurde zur biochemischen Charakterisierung die AtAPY1 mit verschiedenen Systemen in vitro translatiert. Bei Verwendung von Retikulozytenextrakten konnte die AtAPY1 in vitro translatiert werden, zeigte aber in den Aktivitätstests keine Aktivität. Auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität und Struktur scheint die AtAPY1 inhibierend auf verschiedene Expressionssysteme zu wirken, was die Gewinnung von aktiver AtAPY1 stark limitiert. In einem weiteren Ansatz wurde die AtAPY1-GFP nativ aus transgenen A. thaliana mittels anti-GFP markierter Matrix gereinigen. Die Reinigung der AtAPY1-GFP aus dem Gesamtproteinextrakt war erfolgreich und die immobilisierte AtAPY1-GFP zeigte eine Apyraseaktivität. Eine anschließende Elution des Proteins von der Matrix war allerdings zu stringent und führte zum vollständigen Aktivitätsverlust. Für die subzelluläre Lokalisation wurden Apyraseeinzelknockouts in Vorarbeiten mit zwei unabhängigen Konstrukten transformiert: zum einen wurde die Atapy1 C-terminal mit dem SNAP-Tag fusioniert und unter ihrem nativen Promotorbereich exprimiert, zum anderen erfolgte eine Überexpression der AtAPY1-GFP unter dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor. Die komplementierten Pflanzen zeigten keine phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp. Durch Immunfluoreszenz und in vivo Mikroskopie konnte die AtAPY1 in vesikelartigen Strukturen, jedoch nicht in der Plasmamembran oder extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Um die detektierten Strukturen einem Organell zuzuordnen, wurden Co-Lokalisationsstudien durchgeführt. Für Co-Lokalisation wurden die AtAPY1-GFP Pflanzen mit Markerproteinen transformiert oder mit den entsprechenden transgenen Pflanzen gekreuzt. Zum Nachweis der AtAPY1-GFP im sekretorischen Weg oder endozytotischen Vesikeln wurden transgene AtAPY1-GFP Pflanzen mit RabE1d-YFP transformiert, was jedoch keine Co-Lokalisation zeigte. Anschließend erfolgten Kreuzungen mit transgenen Pflanzen, die die Golgi-Markerproteine Membrin 12, Syntaxin of plants 32 oder Golgi transport protein 1-Homolog exprimierten. Mit allen drei Kreuzungen konnte eine Co-Lokalisation der AtAPY1-GFP mit dem entsprechenden Markerprotein im Golgi gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Behandlung der AtAPY1-GFP Pflanzen mit dem Membranfarbstoff FM4-64, welcher das trans-Golgi-Netzwerk aber nicht den Golgi-Apparat anfärbt und dem fungiziden Toxin Brefeldin A, welches zur Bildung von BFA-Kompartimenten durch die Fusion des trans-Golgi-Netzwerks mit Endosomen und Teilen des trans-Golgi-Apparates führt, konnte die AtAPY1-GFP dem Golgi-Apparat zugewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, ob die AtAPY1 löslich oder membrangebunden im Golgi-Apparat vorliegt. Um zwischen löslichen, peripheren und integralen Membranproteinen zu unterscheiden, wurde das mikrosomale Pellet mit verschiedenen Detergenzien und Salzen behandelt. Hohe Salz- (2 M NaCl) und alkalische Bedingungen (0,2 M Na2CO3) führten zur Ablösung peripherer Proteine von der Membran. Harnstoff (4 M) und das anionische Detergenz SDS (0,2 %) führten zur Denaturierung von Proteinen und zum Nachweis integraler Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die AtAPY1-GFP ein integrales Membranprotein ist, da sie ausschließlich in den mit SDS und Harnstoff behandelten Fraktionen im Überstand mittels Western Blot nachgewiesen werden konnte. Die genaue Funktion der AtAPY1 im Golgi-Apparat ist noch ungeklärt, da der Fokus der bisherigen Apyraseforschung von einer Lokalisation der AtAPY1 in der Plasmamembran ausging und frühere Ergebnisse in neuem Kontext diskutiert werden müssen.:ABKÜRZUNGEN 7 1. EINLEITUNG 9 1.1. APYRASEN 9 1.2. APYRASEN IN TIEREN 11 1.2.1. ROLLE DER NTPDASEN BEI DER THROMBOZYTENAGGREGATION 11 1.3. APYRASEN IN PFLANZEN 12 1.3.1. ROLLE EXTRAZELLULÄRER APYRASEN 13 1.3.2. GOLGI LOKALISIERTE APYRASEN 15 1.3.3. KENNTNISSTAND ÜBER APYRASEN IN A. THALIANA 16 1.4. VORARBEITEN 20 1.5. ZIELSTELLUNG 21 2. MATERIAL 22 2.1. GERÄTE 22 2.2. CHEMIKALIEN 23 2.3. HÄUFIG GENUTZTE PUFFER 24 2.4. BESONDERE VERBRAUCHSMATERIALIEN 24 2.5. KITS/STANDARDS 25 2.6. ENZYME 25 2.7. VEKTOREN 26 2.8. ZELLLINIEN 26 2.9. OLIGONUKLEOTIDE 27 2.10. ANTIKÖRPER (AK) 28 2.11. ANTIBIOTIKA/HERBIZIDE 28 2.12. VERWENDETE PFLANZENLINIEN 29 2.13. SCHLÜSSELNUMMERN (ACCESSION CODES) 29 2.14. SPEZIELLE SOFTWARE 30 3. METHODEN 31 3.1. ALLGEMEINE METHODEN 31 3.1.1. PFLANZENKULTIVIERUNG 31 3.1.1.1. Arabidopsis thaliana 31 3.1.1.2. Nicotiana benthamiana 31 3.1.2. KREUZEN VON A. THALIANA 31 3.1.3. TRANSFORMATION 31 3.1.3.1. Bakterien 31 3.1.3.2. Arabidopsis thaliana 32 3.2. MOLEKULARBIOLGISCHE METHODEN 33 3.2.1. PLASMIDPRÄPARATION 33 3.2.2. RNA-EXTRAKTION 33 3.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION 33 3.2.4. NACHWEIS DER INTEGRITÄT VON RNA UND CDNA 34 3.2.5. DNA-EXTRAKTION AUS PFLANZEN 34 3.2.6. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 35 3.2.7. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 35 3.2.8. REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 36 3.2.9. DNA-FÄLLUNG 36 3.2.10. KLONIERUNG DER ATAPY1-HIS UND SNAP-HIS IN E. COLI 36 3.3.1. KOMPLEMENTATION VON APYRASE DOPPELKNOCKOUT MUTANTEN 37 3.3.2. IMMUNFLUORESZENZ 38 3.3.2.1. Probenpräparation 38 3.3.2.2. Konfokale Mikroskopie 39 3.3.3. IN VIVO MIKROSKOPIE VON ATAPY1-GFP EXPRIMIERENDEN KEIMLINGEN 39 3.3.3.1. FM4-64 und Brefeldin A – Behandlung 39 3.3.3.2. Co-Lokalisation mit RabE1d, MEMB12, GOT1P-Homolog, SYP32 40 3.3.4. PROTOPLASTENISOLATION 40 3.3.5. PH-WECHSEL IM APOPLASTEN VON ATAPY1-GFP-KEIMLINGEN 41 3.4. PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 41 3.4.1. PROTEINISOLATION 41 3.4.2. SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 41 3.4.3. PROTEINBESTIMMUNG 42 3.4.4. SDS-PAGE 42 3.4.5. WESTERN BLOT 43 3.4.6. COOMASSIE-FÄRBUNG 43 3.4.7. KOLLOIDALE COOMASSIE-FÄRBUNG 44 3.4.8. PONCEAU-S-FÄRBUNG 44 3.4.9. IMMUNDETEKTION 44 3.4.10. PROTEINREINIGUNG MITTELS NI-NTA-SÄULENCHROMATOGRAPHIE 45 3.4.11. ISOLATION UND REINIGUNG DER ATAPY1-GFP AUS A. THALIANA 46 3.4.12. IN-VITRO TRANSLATION (IVT) ATAPY1-GFP UND ATAPY1-SNAP 46 3.4.13. QUANTIFIZIERUNG DES ATAPY1-SNAP-PROTEINS (IVT) 47 3.4.14. AKTIVITÄTSMESSUNG DER ATAPY1 48 3.4.14.1. Eisensulfat-Test 48 3.4.14.2. Malachitgrün-Test 49 4. ERGEBNISSE 50 4.1. SUBZELLULÄRE LOKALISATION DER ATAPY1 50 4.1.1. KOMPLEMENTATION DES LETALEN ATAPY1 UND ATAPY2 DOPPELKNOCKOUTS 50 4.1.2. DIE ATAPY1 IST IM GOLGI-APPARAT LOKALISIERT 55 4.1.2.1. Indirekte Immunfluoreszenz von AtAPY1-SNAP in Vesikeln 55 4.1.2.2. AtAPY1-GFP lokalisiert in Vesikeln 56 4.1.2.3. Keine Lokalisation der AtAPY1 in Plasmamembran und Apoplast 58 4.1.3. CO-LOKALISATIONSSTUDIEN DER ATAPY1-GFP 59 4.1.3.1. Keine Co-Lokalisation in sekretorischen Vesikeln 60 4.1.3.2. AtAPY1 ist Brefeldin A-sensitiv 61 4.1.3.3. AtAPY1 co-lokalisiert nicht mit FM4-64 64 4.1.3.4. Co-Lokalisation mit den Golgimarkerproteinen MEMB12, GOT1P-Homolog und SYP32 65 4.1.4. ATAPY1 IST EIN INTEGRALES MEMBRANPROTEIN 67 4.2. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ATAPY1 69 4.2.1. EXPRESSION DER ATAPY1 IN E. COLI 69 4.2.2. IN VITRO TRANSLATION DER ATAPY1 71 4.2.3. REINIGUNG DER ATAPY1 AUS A. THALIANA 74 4.2.4. AKTIVITÄTSBESTIMMUNG DER ATAPY1 75 5. DISKUSSION 77 5.1. BEDEUTUNG DER LOKALISATION DER ATAPY1 FÜR DIE APYRASEFORSCHUNG 77 5.2. FUNKTION DER ATAPY1 IM GOLGI-APPARAT 78 5.2.1. AKKUMULATION VON STÄRKEGRANULA IN CHLOROPLASTEN 79 5.2.2. ROLLE DER APYRASEN BEI DER ZELLDIFFERENZIERUNG 81 6. AUSBLICK 86 7. ZUSAMMENFASSUNG 88 8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 90 9. LITERATURVERZEICHNIS 92 10. ANHANG 106

Plants are continuously exposed to different abiotic and biotic stresses in their natural environment. Their capacity to survive depends on the capacity to perceive external signal and quality amount a defence response for protection from the stress perceived. The purpose of this project was to study the impact of combined abiotic stress and biotic stress on the outcome of the disease inducing Arabidopsis thaliana – Pseudomonas syringae interaction. This study included a focus on the role of ABA in these interactions and also whether 3´-O-β D- ribofuranosyl adenosine (hereafter it called ‘400’ compound), a novel adenosine derived compound induced during compatible interactions, was involved. The later involved the targetted disruption of a putative 400 biosynthetic pathway involving analysis of knockout mutants of enzymes; APD-ribose diphosphatase NAD binding / hydrolases of the NUDIX class, glucosyl transferases, ribosyltransferases, a ribose-phosphate pyrophosphokinase3 and galactosyltransferases. Unfortunately, none of these targeted interventions modified the host response to Pseudomonas infection, nor altered levels of 400 in challenged leaves. The primary research investigated the interaction between abiotic and biotic stresses in Arabidopsis plants focussing on the modulation of plant defence against multiple, and possibly antagonistic, stress responses and the role plant hormones play in this process. We showed that high light caused enhanced susceptibility to the already virulent Pseudomonas syringae DC3000pvsp61. The pathways contributing to this enhanced susceptibility were largely ABA independent. Subsequent characterization of transgenic lines expressing the soluble Arabidopsis abscisic acid receptors, PYRABACTIN RESISTANCE1-LIKE4-6 provided compelling evidence for a role for these receptors in DC3000 virulence strategies, but they contribute to a lesser extent to the enhanced susceptibility under high light. This was corroborated genetically by using mutants of the immediately downstream targets of PYLs, the type two protein phosphatase, specifically the triple mutant hab1-1/abi2-1/abi1-2. A number of epitope and fluorescent constructs were generated to facilitate future studies of the role of ABA signaling. Targetted profiling suggested that SA dynamics were altered under DC3000 challenged Arabidopsis grown under high light. Furthermore, differential accumulation of flavonoids suggested these may also play a role in attenuating host defences under high light. Finally we provide evidence based on comparative analysis of that the photoreceptors phytochrome double mutant phyA-211/phyB-9 and cry1/cry2 behave antagonistically in Arabidopsis response to DC3000. Overall our studies support the conclusion that plants abiotic stress (HL) response takes precedence over biotic stress (DC3000) responses and that abiotic stress is detrimental to plant immunity. The luciferase transgenic PYL lines showed high level of expression of ClucP::PYL5 plant tissues challenged 2hpi of DC3000 (OD600: 0.15) in comparison with C1lucP::PYL6. This result opposes to what RT-PCR reported; which was that three PYLs genes display similar expression level at 6hpi of hrpA or 18hpi of DC3000. The epitope tags of CaMV::HA transgenic plants showed HA-tagged signal with stunted phenotype in a range of PYL4, 5 and 6 plants but none of the plants displayed any differences in susceptibility to DC3000. Although, RT-PCR assay showed high levels of expression in the three PYLs, 6hpi of hrpA but no signal was detected in B8eGFP::PYL5 transgenic line either followed the DC3000 and hrpA infection or by examined plant seedlings at early stages under confocal microscopy.

Des changements de méthylation de l'ADN peuvent affecter l'expression des gènes et pour certains être transmis au travers des générations. De telles " épimutations " qui concernent des groupes de cytosines à proximité ou dans les gènes sont donc une source potentielle de variation phénotypique héritable en absence de changements de la séquence de l'ADN. Chez les plantes la méthylation de l'ADN est cependant principalement observée au niveau des séquences répétées. Il reste à déterminer dans quelle mesure les changements de méthylation au niveau de ce type de séquences peuvent être héritées et affecter les phénotypes. Afin de répondre à ces questions, plus de 500 épiRIL (epigenetic Recombinant Inbred Lines) quasi-isogéniques a été générée chez Arabidopsis thaliana. Cette population a été obtenue par le croisement d'un parent sauvage et d'un parent mutant pour le gène DDM1 présentant une très forte réduction du taux de méthylation de l'ADN. Après un rétrocroisement de la F1 avec une plante sauvage, les individus sauvages pour le gène DDM1 ont été sélectionnés et propagées sur 6 générations par autofécondation. Nous avons montré par l'analyse du méthylome de plus de 100 épiRIL que l'hypométhylation induite par ddm1 présente selon les séquences affectées différents degrés de transmission au travers des générations. La réversion de l'hypométhylation concerne des régions associées à une abondance élevée en sRNA de 24 nt. Nous avons utilisé l'hypométhylation stablement transmise dans les épiRIL induite par ddm1 afin de détecter des QTL (Quantitative Trait Loci) affectant le temps de floraison et la longueur de la racine primaire, deux caractères pour lesquels les variations observées dans les épiRIL présentent une héritabilité importante. En dernier lieu, nous avons recherché par différentes approches les variations causales de ces QTL.