Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Plant Science. Title from title page of PDF (viewed 2008/01/12). Includes bibliographical references.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: Inorganic Phosphate (Pi) is one of the key nutrients required by all living organisms on earth. This nutrient is of vital importance to higher plants but it is not readily available for uptake from the soil, implying constant stress on plants. During photosynthetic dark and light reactions, phosphate is a prerequisite for all reactions to occur and to ensure plant survival. This statement implies that a careful homeostatic control of this nutrient is necessary in order to maintain a balanced carbon flow in all sub-cellular plant compartments. Phosphate limitation is a threat to plant survival and one way of addressing this nutritional hurdle is by feeding plants with fertilizer. This method of crop development and general plant maintenance by humans has a devastating effect on the environment, as phosphate causes eutrophication and various other consequences which are detrimental to animal life. Plants, however, are naturally equipped with Pi transporters which are activated conditionally depending on the external Pi availability. These transporters are present in most sub-cellular compartments and some of them have been identified and characterised, while others remain to be a prediction. If these transporters are characterised accordingly it might eventually mean that the use of fertilizers may no longer be necessary. In order to contribute to successful Pi-efficient crop development, a clearer understanding of P-dynamics in the soil and its recycling ability inside the plant itself is necessary. During this study it was attempted to characterise a putative high affinity Pi transporter, PHT1;5, from Arabidopsis thaliana via a Escherichia coli and yeast heterologous expression system and its Km value predicted in order to verify/hypothesise whether it is a high or low affinity transporter. This transporter is expressed in leaves and could be a promising tool for future carbon partitioning studies during phosphate limitation. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Anorganiese fosfaat (Pi) word beskou as een van die belangrikste nutriente benodig vir alle lewe op aarde. Dit vervul ‘n hoof rol in talle noodsaaklike prosesse in hoër plante en is veral ‘n voorvereiste vir fotosintetiese reaksies om plaas te vind. In ‘n plant se natuurlike omgewing is anorganiese fosfaat nie geredelik bekskikbaar in grond nie en dus word daar vermoed dat plante onder konstante fosfaat stres gevind word. Omdat fosfaat so ‘n belangrike rol speel tydens fotosintese is dit noodsaaklik dat daar ‘n balans op sellulêre vlak gehandhaaf word, veral wat die verspreiding van koolhidrate tussen die verskillende kompartemente van die sel betref. Plante se oorlewing word bedreig deur ‘n tekort aan fosfaat in die omgewing en die enigste onmiddelike oplossing daarvoor is deur die toediening van bemestingstowwe. Hierdie metode van landery ontwikkeling en algemene instandhouding van plante deur die mensdom het ’n baie negatiewe effek op die omgewing. ‘n Oormaat fosfaat lei tot eutrifikasie en het verkeie ander negatiewe nagevolge wat dodelik is vir die dierelewe. Plante beskik ook oor natuurlike interne fosfaat transporters om hierdie tekort te oorkom. Hierdie transporters word op grond van eksterne fosfaat beskikbaarheid ge-aktiveer of ge-deaktifeer. Die transporters is teenwoordig in meeste sub-sellulêre kompartemente en sommige is al ge-identifiseer en gekarakteriseer, terwyl ander slegs ‘n voorspelling bly. Gedurende hierdie studie was ‘n poging aangewend om ‘n anorganiese fosfaat transporter van Arabidopsis thaliana, PHT1;5, te karakteriseer met behulp van mikro-organismes soos Escherichia coli en gis. Die poging het ingesluit om ‘n Km waarde vir hierdie transporter te voorspel en sodoende ‘n hipotese daar te stel van of dit hoë of lae affiniteit het vir fosfaat. Die transporter word groot en deels aangetref in blare en kan dus dien as ‘n belowende apparaat vir toekomstige koolhidraat uitruiling studies gedurende fosfaat tekort.

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Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo Aparicio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:59:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_D.pdf: 3971415 bytes, checksum: b23d47eff6b16f53235b5d581fcd3ae6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estresses bióticos e abióticos como a seca, salinidade e ataque por patógenos são responsáveis por perdas significantes em culturas de grãos ao redor do mundo. Diversos genes são regulados em resposta a esses fatores e podem ser ativados ou reprimidos para gerar uma resposta específica na planta de maneira a gerar uma resposta de defesa que atenue os efeitos do estresse e promoção de tolerância pela planta. É importante entendermos o funcionamento desses mecanismos moleculares, e dos genes e proteínas envolvidas nestas vias de sinalização para um melhor conhecimento de como estas vias de transdução operam em plantas, bem como no desenvolvimento de variedades de plantas tolerantes. No capítulo I deste trabalho nós descrevemos a análise funcional de um motivo de ligação do fator TGA localizado na região promotora do gene NIMIN-1 que é altamente induzido por ácido salicílico (SA) durante defesa de plantas (estresse biótico). Fatores TGA desempenham um papel chave na defesa de plantas através da interação com elementos presentes na região promotora de genes de defesa para induzir a sua expressão. O ácido salicílico (SA) é um fito-hormônio que induz a expressão do gene que codifica a proteína NIMIN-1. Essa proteína interage com a proteína NPR1/NIM1, reguladora da resistência sistêmica adquirida (SAR). Neste trabalho foi investigado se um motivo de ligação do fator TGA2 "TGACG", localizado na região promotora imediatamente anterior ao sítio de iniciação da transcrição de NIMIN-1, é necessário a indução de NIMIN-1 por ácido salicílico. Uma versão mutagenizada do promotor do gene NIMIN-1 foi gerada por mutação sítio-dirigida. Nós geramos construções T-DNA nas quais tanto a região promotora nativa quanto a mutagenizada foram fusionadas aos repórteres proteína verde fluorescente (GFP) e beta-glucuronidase (GUS). Foram geradas plantas transgênicas e a expressão de GFP sob o controle da região promotora de NIMIN-1 foi observada em raízes, no pecíolo e folhas de Arabidopsis. A atividade dirigida pelo promotor mutagenizado e o selvagem foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Tanto a construção contendo o promotor de NIMIN-1 como a cópia endógena de NIMIN-1 foram induzidas por SA. Em contraste, a construção promotora mutagenizada foi bem menos sensível a SA que o promotor nativo de NIMIN-1. Esse dado indica que o motivo de ligação do fator TGA2 analisado está diretamente envolvido na modulação da expressão de NIMIN-1 induzida por SA em Arabidopsis. No capítulo II nós descrevemos a caracterização da proteína ScCBL1 de cana-de-çúcar que apresenta elevada identidade com membros da família de proteínas sensoras de cálcio do tipo calcineurina B (CBL) em plantas. Experimentos de duplo-híbrido realizados em nosso grupo mostram que a proteína ScCBL1 interage com uma proteína quinase (ScCIPK8). Trabalhos prévios também desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que ScCIPK8 está envolvida no metabolismo do carboidrato e é diferencialmente expressa em resposta a ABA. O gene ScCBL1 foi clonado e a proteína codificada expressa e purificada a partir do extrato solúvel por cromatografia de afinidade usando resina Ni-NTA e a proteína eluída foi usada para estudos estruturais. Análises por espectrometria por dicroísmo circular (CD) mostraram que a proteína ScCBL1 é composta predominantemente por ?-hélices, em concordância com programas de predição da sequência de aminoácido desta proteína. Experimentos de espalhamento de raio-x a baixos ângulos (SAXS) indicaram que as amostras obtidas da ScCBL1 estavam homogêneas e monodispersas em solução e que ocorre uma mudança em seu estado oligomérico quando adicionado o agente redutor DTT, ocorrendo uma diminuição na intensidade de espalhamento (I(0)) a uma ordem de 1,56 para a mesma concentração, acompanhado de uma diminuição de 10 Å em seu raio de giro. As analises por SAXS indicaram que a proteína ScCBL1 é pentamérica em seu estado nativo e um trímero quando adicionado DTT. Análises por SAXS também indicaram que a proteína ScCBL1 está enovelada em solução, apresentando estrutura terciária estável. A modelagem de baixa resolução ab initio, juntamente com a função de distribuição das distâncias P(r) indicaram que a proteína possui um formato alongado (prolato). Ensaios iniciais de cristalização a partir de amostras monodispersas da proteína ScCBL1, confirmadas por DLS, foram feitas e um monocristal simétrico de aproximadamente 0.05 mm de diâmetro obtido além de outros sinais promissores para um refinamento das condições de cristalização de ScCBL1 para determinação de sua estrutura tridimensional a uma alta resolução. Esses dados contribuem para uma caracterização inicial da estrutura da proteína ScCBL1 / Abstract: Many biotic and abiotic stresses such as drought, salinity and pathogen attack are responsible for major crop losses around the world. Several genes are regulated in response to these factors to counteract the stress effects and promote plant tolerance. Understanding the molecular mechanisms as well as the roles of genes and proteins involved in stress signaling pathways is key to a better understanding of plant tolerance. We report in chapter I the functional analysis of a TGA biding factor located in the promoter region of NIMIN-1 that is highly induced by SA during plant defense against pathogen attack (biotic stress). TGA factors play a key role in plant defense by binding to the promoter region of defense genes, inducing their expression. Salicylic acid (SA) induces the expression of the gene encoding NIMIN-1, which interacts with NPR1/NIM1, a key regulator of systemic acquired resistance. In this work we investigated whether the TGA2-binding motif TGACG located upstream of the NIMIN-1 gene is necessary for SA induction of NIMIN-1 expression. A mutated version of the NIMIN-1 promoter was created by site-directed mutagenesis. We generated T-DNA constructs in which native NIMIN-1 and mutated promoters were fused to green fluorescent protein and ?-glucuronidase reporters. We produced transgenic Arabidopsis plants and observed NIMIN-1 promoter-driven green fluorescent protein expression in the roots, petiole and leaves. Constructs were also agroinfiltrated into the leaves to evaluate gene expression of mutagenized and native promoters driving expression of GUS using quantitative real-time RT-PCR. We characterized the normal gene response to SA and compared it to the response of the mutant version of the NIMIN-1 promoter. Both the native NIMIN-1 construct and an endogenous copy of NIMIN-1 were induced by SA. However, the mutated promoter construct was much less sensitive to SA than the native NIMIN-1 promoter, indicating that this TGA2-binding motif is directly involved in the modulation of SA-induced NIMIN-1 expression in Arabidopsis. In chapter II we describe the characterization of a sugarcane ScCBL1 protein which displays high sequence identity to the calcium binding protein family calcineurin B-like (CBL) from plants. Using the two-hybrid system our group has shown that ScCBL1 binds to a protein kinase (ScCIPK8). Previous work done in our laboratory also showed that ScCIPK8 is involved in carbohydrate metabolism and that it is differentially expressed in response to ABA. ScCBL1 was cloned, expressed and purified by one round of affinity chromatography using a Ni-NTA resin and the purified eluted protein was used for structural analysis. Spectroscopic analysis by circular dichroism (CD) showed that ScCBL1 is mainly composed of ?-helices agreeing with secondary structure prediction by PredictProtein server. Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) analysis showed that ScCBL1 sample is homogeneous and monodisperse in solution and that the protein undergoes an oligomeric change when DTT is added, with a decrease in scattering intensity (I(0)) by a factor of 1,56 for samples with the same concentration, together with a decrease in the radius of gyration of 10 Å. SAXS experiments also showed that ScCBL1 is pentameric in its native state and the protein undergoes a change in its oligomeric state to a trimer when DTT is added. SAXS experiments also showed the protein is folded in solution and ab initio modeling of ScCBL1 protein envelope together with the pair-distribution function P(r) indicates that the protein has a rod-like, elongated shape. An initial crystallization screening with ScCBL1 monodisperse samples (confirmed by DLS experiments) was carried out and some crystallization signals were obtained, including a single crystal of around 0.05 mm in length. These data shed light on the structural features of ScCBL1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_D.pdf: 11219627 bytes, checksum: b885f7a08525b694c5783c91f122c6c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As plantas, sendo organismos sésseis, desenvolveram um conjunto de mecanismos que possibilitam a adaptação a condições ambientais adversas visando à manutenção da homeostase energética para o desenvolvimento e propagação. Tais respostas valem-se da integração entre a biossíntese de hormônios, ativação de vias gênicas de resposta a estresse e um balanço adequado do uso da energia disponível. Os açúcares, além de serem fontes de carbono e energia, também atuam como moléculas sinalizadoras podendo agir conjuntamente com sinais hormonais na adaptação a estresses bióticos e abióticos e no controle do desenvolvimento. Nesse contexto, diversos estudos apontam para uma importante relação entre o ácido abscísico (ABA), um dos principais hormônios relacionados à resposta a estresses, e a glicose. A sinalização por ABA, além de atuar sobre a regulação da transcrição, é conhecida por envolver fatores de controle de estabilidade do RNAm. Contudo, a participação destes mecanismos em respostas mediadas por glicose ainda é pouco explorada. Num primeiro momento, o presente trabalho visou avaliar o potencial das participações de regulações pós-transcricionais em resposta a ABA e glicose em Arabidopsis thaliana, através da determinação do perfil de expressão de RNAm após a inibição da transcrição. Um modelo experimental com condições de inibição de transcrição otimizadas foi estabelecido e utilizado para análise de transcriptoma por microarranjos CATMA em resposta à glicose e ABA. Um total de 962 genes foi identificado como diferencialmente expresso após os tratamentos, sugerindo uma possível regulação pós-transcricional por glicose sobre 204 transcritos, por ABA sobre 245 e pela combinação dos dois sinais sobre 513 transcritos. Esses genes foram classificados de acordo com o Gene Ontology, sugerindo uma relação importante com respostas adaptativas a condições de estresse. Aparentemente, as respostas mediadas por glicose e ABA seguem estratégias opostas, sendo que as respostas pós-transcricionais por ABA podem também atuar como um mecanismo rápido de retro-regulação negativa sobre a via central de sinalização desse hormônio, uma forma de dessensibilizar e reiniciar as respostas da via. Na segunda parte deste trabalho, levando em consideração as evidências do envolvimento do controle de estabilidade de RNAm na sinalização por glicose, foi avaliada a participação da via de regulação por microRNAs (miRNAs) em respostas mediadas por esses sinal durante os estágios iniciais de desenvolvimento da planta. Os mutantes ago1-25 e hyl1-2, deficientes em atividade e biossíntese de miRNAs, respectivamente, apresentaram hipossensibilidade à glicosedurante um determinado período do desenvolvimento da planta, entre a germinação e o estabelecimento. Tal resultado levanta a possibilidade de que a via dos miRNAs participa do atraso do desenvolvimento mediado por glicose. Visando compreender quais miRNAs poderiam estar envolvidos, análise de expressão em larga escala por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) de 200 precursores de miRNAs (pri-miRs) em resposta a glicose foi conduzida, apontando para uma potencial regulação sobre 38 deles, vários dos quais já são conhecidos por participarem direta ou indiretamente do controle de desenvolvimento da planta. Aparentemente, a deficiência na maquinaria de miRNAs leva a um desbalanço nas regulações de genes responsivos à glicose durante os primeiros estágios de desenvolvimento / Abstract: Plants, as sessile organisms, have developed a set of mechanisms that allow efficient adaptation to adverse environmental conditions. These processes rely on the integration of hormone biosynthesis, activation of stress-responsive pathways and on a balanced use of the available energy. Sugars, besides their role as carbon and energy sources, may also function as signaling molecules that may act together with hormonal signals to trigger adaptive responses to biotic and abiotic stresses. In this context, several studies have indicated an important relation between abscisic acid (ABA), one of the major hormones related to abiotic stresses responses, and glucose. ABA signaling, besides its function over transcription control, is known to involve factors regulating the stability of mRNAs. However, the importance of glucose-mediated mRNA decay control is essentially unknown. Our work intended to evaluate the potential of the participation of post-transcriptional regulations in response to ABA and glucose in Arabidopsis thaliana, by determining mRNA profile alteration in response to these signals after transcription inhibition. An experimental model which optimizes the conditions for transcription inhibition was established and used for transcriptome profiling with CATMA microarrays. A total of 962 genes were found to be differentially expressed after the treatments, suggesting a possible post-transcriptional control acting upon 204, 245 and 513 transcripts in response to glucose, ABA and the combination glucose + ABA, respectively. The genes were classified by their functions according to Gene Ontology, suggesting a close relation with adaptive response to stress conditions. Apparently, ABA- and glucose-mediated control of mRNA stability follows two opposite strategies, while ABA post-transcriptional responses may also act as a fast negative feedback mechanism over its own core signaling pathway, as a way to desensitize and reset the pathway responses. The second part of this work focused on the participation of microRNAs (miRNAs) pathway in responses mediated by glucose during plant early developmental stages. The mutants ago1-25 and hyl1-2, which are deficient in miRNA activity and biogenesis, respectively, showed hyposensitivity to glucose during a narrow time window of early plant development, between germination and seedling establishment. Such result raises the possibility that miRNA pathway may be involved in the glucose-mediated delay of early seedling development. To obtain further evidences about which miRNAs could be involved, the expression profile of 200 pri-miRs was evaluated by large-scale quantitative real-timepolymerase chain reaction (qRT-PCR) profiling, indicating that 38 pri-miRNA are potentially regulated by glucose, several of which are known to participate directly or indirectly in plant development. The data indicate that deficiency in miRNA machinery leads to an imbalance on glucose control over gene expression during early seedling development / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Lipids are stored in a cell for providing energy. The main advantages of storing lipids over carbohydrates like glycogen is that, lipids yield more energy after oxidation because they represent the highly reduced form of carbon, needs less space and water for storage. Conservation of chemical energy in the form of biologically inert form is by storing molecules like triacylglycerol (TAG) and Steryl esters (SE). Triacylglycerol is the major storage form of energy in all eukaryotic cells. During the periods of nutritional excess and nutritional stress, all organisms like bacteria, yeast, animals, and plants can able to do the critical function of synthesizing the triacylglycerol. TAG is an energy store and a repository of essential and non-essential fatty acids and precursors for phospholipid biosynthesis. TAG synthesis mainly takes place in endoplasmic reticulum in mammals and in plants, it takes place in plastid and mitochondria. Triacylglycerol synthesis discovered by Kennedy starts with glycerol 3- phosphate. Glycerol 3-phosphate gets acylate to form lysophosphatic acid (LPA), which in turn acylate to form phosphatic acid (PA) and the reactions are catalyzed by glycerol 3-phosphate acyltransferase (GPAT) and LPA acyltransferase (LPAT) respectively. PA undergoes phosphorylation by PA phosphatase enzyme to give diacylglycerol (DAG). Further acylation of DAG gives rise to TAG and the reaction is catalyzed by diacylglycerol acyltransferase (DGAT). There are several DGAT classes were identified they are DGAT1, DGAT2, PDAT and bifunctional TAG/wax ester synthase. However all the enzymes involved in Kennedy TAG biosynthetic pathway as well as the enzymes of all different DGAT classes are membrane bound enzymes. Through our studies an another DGAT class that is soluble and cytosolic DGAT was first identified in peanut and also in yeast, Rhodotorula glutinis in which a soluble cytosolic complex itself has been identified. The biosynthesis of triacylglycerol (TAG) occurs in the microsomal membranes of eukaryotes. Here, we report the identification and functional characterization of diacylglycerol acyltransferase (DGAT), a member of the 10 S cytosolic TAG biosynthetic complex (TBC) in R. glutinis. Both a full-length and an N-terminally truncated cDNA clone of a single gene were isolated from R. glutinis. The DGAT activity of the protein encoded by RgDGAT was confirmed in vivo by the heterologous expression of cDNA in a Saccharomyces cerevisiae quadruple mutant (H1246) that is defective in TAG synthesis. RgDGAT overexpression in yeast was found to be capable of acylating diacylglycerol (DAG) in an acyl-CoA-dependent manner. Quadruple mutant yeast cells exhibit growth defects in the presence of oleic acid, but wild-type yeast cells do not. In an in vivo fatty acid supplementation experiment, RgDGAT expression rescued quadruple mutant growth in an oleate-containing medium. We describe a soluble acyl-CoA-dependent DAG acyltransferase from R. glutinis that belongs to the DGAT3 class of enzymes. The study highlights the importance of alternate TAG biosynthetic pathway in oleaginous yeasts. A key step in the triacylglycerol (TAG) biosynthetic pathway is the final acylation of diacylglycerol (DAG) by DAG acyltransferase. In silico analysis has revealed that the DCR (defective in cuticular ridges) (At5g23940) gene has a typical HX4D acyltransferase motif at the N-terminal end and a lipid binding motif VX2GF at the middle of the sequence. To understand the biochemical function, the gene was overexpressed in Escherichia coli, and the purified recombinant protein was found to acylate DAG specifically in an acyl-CoA-dependent manner. Overexpression of At5g23940 in a Saccharomyces cerevisiae quadruple mutant deficient in DAG acyltransferases resulted in TAG accumulation. At5g23940 rescued the growth of this quadruple mutant in the oleate-containing medium, whereas empty vector control did not. Lipid particles were localized in the cytosol of At5g23940-transformed quadruple mutant cells, as observed by oil red O staining. There was an incorporation of 16-hydroxyhexadecanoic acid into TAG in At5g23940-transformed cells of quadruple mutant. Here we report a soluble acyl-CoA-dependent DAG acyltransferase from Arabidopsis thaliana. Taken together, these data suggest that a broad specific DAG acyltransferase may be involved in the cutin as well as in the TAG biosynthesis by supplying hydroxy fatty acid.

Orientador: Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vitor_SimoneCespedes_M.pdf: 2469178 bytes, checksum: 5b012d0f044b319a6fb8e2dc382c8242 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O NO é uma molécula sinalizadora versátil muito importante em diversos processos em plantas. Uma de suas principais atuações é na sinalização celular durante o processo de defesa contra o ataque de patógenos. Plantas de Arabidopsis thaliana do genótipo mutante nia1 nia2, deficientes para os dois genes estruturais que codificam para a enzima nitrato redutase (NR), são susceptíveis à bactéria Pseudomonas syringae. Foi sugerido que a resposta de defesa prejudicada no mutante NR-deficiente seria resultante de seus reduzidos níveis de NO, quando comparados àqueles do genótipo selvagem. Em um trabalho recente de nosso grupo, empregando microarranjo de DNA, foi observado que a fumigação com gás NO no mutante nia1 nia2 foi capaz de modular diversos genes relacionados à defesa, alguns dos quais não previamente documentados como responsivos a esse radical. Neste trabalho se analisou por PCR em tempo real o efeito do gás NO na expressão de genes relacionados à defesa em plantas selvagem e no mutante nia1 nia2 infectados com uma linhagem avirulenta da bactéria P. syringae. Genes de defesa, como PR1, foram induzidos pela bactéria e a expressão destes foi maior no genótipo selvagem quando comparado ao nia1 nia2, o que é consistente com a susceptibilidade do mutante. A fumigação com NO também modulou genes relacionados à biossíntese de lignina (CAD1) e à sinalização de auxina (TIR1, ILL1, GH3) e etileno (ACCS7). Análises de quantificação de lignina mostraram uma pequena redução desse composto no genótipo mutante em relação ao selvagem, além de uma diferença em sua composição. Ademais, a fumigação com NO atenuou a expressão de PR1 e outros genes relacionados à via do ácido salicílico em plantas inoculadas e preveniu o crescimento bacteriano em folhas nia1 nia2. Já foi demonstrado que a inoculação do patógeno no mutante induz uma baixa produção de NO e no presente trabalho observou-se uma alta produção de H2O2 comparado ao selvagem. O H2O2 potencializou o efeito microbicida do NO fumigado na suspensão de bactéria. Os resultados sugerem que um efeito microbicida direto do NO, em conjunto com H2O2, pode resultar na atenuação da resposta de defesa na planta, reduzindo o gasto de energia associado à transcrição de genes relacionados à defesa / Abstract: NO is an important signaling and versatile molecule which plays important roles in many processes in plants. One of its main actions is in cell signaling during defense response against pathogen attack. Arabidopsis thaliana plants of the nia1 nia2 mutant genotype, deficient in the two structural genes encoding for the enzyme nitrate reductase (NR), are susceptible to the avirulent bacteria Pseudomonas syringae. It has been suggested that the impaired defense response in the NR-deficient mutant would result from their low NO levels when compared to those of the wild type. Indeed, in a recent study from our group, it was observed through a DNA microarray that fumigation of nia1 nia2 mutant with NO gas was able to modulate many genes related to defense, some of which not previously documented as responsive to this radical. In this work we analyzed by real-time PCR the effect of NO gas on the expression of genes related to defense in the wild type and nia1 nia2 mutant infected with an avirulent strain of Pseudomonas syringae. Defense genes such as PR1 were induced by the bacteria and its expression was higher in wild type when compared to nia1 nia2, which is consistent with the susceptibility of the mutant. NO fumigation also modulated genes related to the biosynthesis of lignin (CAD1) and the auxin (Tir1, ILL1, GH3) and ethylene pathways (ACCS7). Analysis of lignin showed a reduction of this compound in the mutant genotype compared to wild type, and a difference in its composition. In addition, fumigation with NO attenuated the expression of PR1 and other genes related to salicylic acid signaling in infected plants and prevented bacterial growth in nia1 nia2 leaves. Furthermore, pathogen infection is known to induce a low production of NO in nia1 nia2 and here we also observed that there is a higher production of H2O2 in the mutant compared to the wild type. H2O2 potentiated the microbicidal effect of NO fumigated in bacterial suspensions. The results suggest that a direct microbicidal effect of NO, together with H2O2, may result in attenuation of the defense response in the plant, reducing energy expenditure associated with the transcription of genes related to defense / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

[EN] The hormones Gibberellins (GAs) are growing regulators that control fruit set and fruit growth. GAs are perceived by its nuclear receptors GID1 (GA INSENSITIVE DWARF1) (GID1A, GID1B y GID1C), which then trigger degradation of downstream repressors DELLA which are negative regulators of GA response. Our general goal is to know the molecular mechanisms by which GA-mediated fruit set. To understand which of the three GA receptor genes and four DELLA proteins are involved during fruit initiation in Arabidopsis, we have examined their temporal and spatial localization and expression, respectively and identify tissue-specific interactions between GID1 and DELLA. Our data suggest that GID1A can interact with RGA and GAI in all tissues, whereas GID1C-RGL1 and GID1B-RGL2 interactions only occur in valves and ovules, respectively. Functional study of gid1 mutant combinations confirms that GID1A plays a major role during fruit-set and growth, whereas GID1B and GID1C have specific roles in seed development and pod elongation, respectively. Therefore, in ovules, GA perception is mediated by GID1A and GID1B, while GID1A and GID1C are involved in GA perception in valves. On the other hand, to identify which are the genes that may participate in fruit set mediated by GAs, we have used transcriptomic analysis to detect genes regulated in the 4xdella mutant, fruits induced by GAs and pollinated fruits. As many as 10,000 genes appear to be differentially regulated, which suggest the complexity of this process. Among the differential genes, many of them encode for transcription factors that may regulated the GA response in fruit and some of them were tested as early targets of DELLA. The implication in the GA pathway of early target genes, RBE and PIL2, was studied by mutant phenotype analysis and in vitro assays for protein-protein interaction. / [ES] Las giberelinas (GAs) son reguladores del crecimiento que controlan la formación y desarrollo del fruto. Las GAs son percibidas por los receptores nucleares GID1 (GA INSENSITIVE DWARF1) (GID1A, GID1B y GID1C), mediando así la degradación de las proteínas DELLA que actúan como reguladores negativos de la respuesta a GAs. Nuestro objetivo es conocer cuáles son los mecanismos moleculares por los cuales las GAs median la formación y desarrollo del fruto. Para comprender qué receptores GID1 y qué proteínas DELLA (GAI, RGA, RGL1 y RGL2) participan en la formación del fruto hemos analizado su expresión espacial y temporal, identificando las posibles interacciones específicas de tejido entre los GID1 y DELLA. GID1A puede interactuar con RGA y GAI en todos los tejidos del pistilo, mientras que las interacciones entre GID1C-RGL1 y GID1B-RGL2 solamente ocurren en valvas y óvulos, respectivamente. El análisis de alelos mutantes gid1 indica que GID1A tiene una función principal en el crecimiento del fruto, mientras que GID1B y GID1C tienen funciones específicas en desarrollo de la semilla y elongación de la vaina, respectivamente. Por tanto la percepción de GAs en óvulos es mediada por GID1A y GID1B, mientras que en la valva lo es por GID1A y GID1C. Por otro lado, para identificar cuáles son los genes regulados por GAs que participan en la formación del fruto, hemos realizado un análisis transcriptómico en el mutante 4xdella y en frutos partenocárpicos inducidos por GAs y polinizados, identificando más de 10,000 genes diferenciales, lo que sugiere la complejidad del proceso. De éstos se han reconocido varios factores transcripcionales que potencialmente pueden mediar la respuesta a GAs en el fruto, y hemos determinado cuáles de ellos son dianas directas de DELLA. Hemos analizado con más detalle la función de dos de ellos, RBE y PIL2, mediante el análisis de los fenotipos mutantes e interacciones in vitro proteína-proteína. / [CAT] Les gibberel·lines (GAs) són reguladors del creixement que controlen la formació i desenvolupament del fruit. Les GAs són percebudes pels receptors nuclears GID1 (GA INSENSITIVE DWARF1) (GID1A, GID1B y GID1C), intervenint així la degradació de les proteïnes DELLA que actuen com reguladors negatius de la resposta a GAs. El nostre objectiu és conéixer quins són els mecanismes moleculars pels quals les GAs mitjancen la formació i desenvolupament del fruit. Per a comprendre que receptors GID1 i que proteïnes DELLA participen en la formació del fruit hem analitzat la seua expressió espacial i temporal, identificant les possibles interaccions específiques de teixit entre els GID1s i DELLAs. GID1A pot interactuar amb RGA i GAI en tots els teixits, mentre que les interaccions entre GID1C-RGL1 i GID1B-RGL2 solament ocorren en valves i òvuls, respectivament. L'anàlisi d'al·lels mutants gid1 indica que GID1A té una funció principal en el creixement del fruit, mentre que GID1B i GID1C té funcions específiques en desenvolupament de la llavor i elongació de la beina, respectivament. Per tant la percepció de GAs en òvuls és mitjançada per GID1A i GID1B, mentre que en la valva ho és per GID1A i GID1C. Per altra banda, per a identificar quins són els gens regulats per GAs que participen en la formació del fruit, hem realitzat una anàlisi transcriptòmatic en el mutant 4xdella i en fruits induïts per GAs i pol·linitzats, identificant més de 10,000 gens diferencials, la qual cosa sugereix la complexitat del procés. D' aquests s'han identificat diversos factors transcripcionals que potencialment poden intervenir en la resposta a GAs en el fruit, i hem determinat quins d'ells són dianes directes de DELLAs. Hem analitzat amb més detall la funció de dos d'ells, RBE i PIL2, mitjançant l'anàlisi dels fenotips mutants i interaccions in vitro proteïna-proteïna. / Gallego Giraldo, C. (2015). PERCEPCIÓN Y SEÑALIZACIÓN DE LAS GIBERELINAS DURANTE LA FRUCTIFICACIÓN EN ARABIDOPSIS THALIANA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/50429 / TESIS

El ácido abscísico (ABA) es una hormonal vegetal que tiene un papel crucial en las respuestas adaptativas de las plantas al estrés por sequía, salinidad o frío, además de regular importantes procesos del desarrollo de las plantas. Existen múltiples evidencias de que las proteínas fosfatasas 2C (PP2Cs) son claves para comprender los procesos en los que media esta hormona. Nuestro trabajo se centra en la PP2C HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA) cuyo secuencia genómica fue clonada por homología con ABI1 y ABI2. Realizamos un abordaje de genética reversa, novedoso en el campo de la señalización por ABA, con el aislamiento y caracterización de un alelo de pérdida de función hab1-1 y, con la generación y el estudio de líneas que sobre expresan HAB1. La hipersensibilidad del mutante hab1-1 y la insensibilidad de las plantas 35S:HAB1 proporcionan una nueva evidencia genética del papel de la PP2C HAB1 como regulador negativo de la señalización por ABA. Para profundizar más en los detalles moleculares de la función de HAB1 en la ruta de señalización por ABA, realizamos una búsqueda por doble híbrido de las posibles dianas de interacción de HAB1 en una librería de cDNA de Arabidopsis. HAB1 interacciona con la proteína SWI3B, un homólogo de la subunidad SWI3B del complejo remodelador de cromatina SWI/SNF de levaduras. Estudios previos a esta tesis no habían analizado mutantes de pérdida de función sencillos, dobles y triples en PP2Cs de plantas. El objetivo es determinar su contribución a la ruta de señalización por ABA y desentrañar posibles interacciones génicas y una posible redundancia funcional entre ellas. En esta tesis hemos generado mutantes hipersensibles a ABA tolerantes a la sequía por inactivación combinada de las PP2Cs HAB1 y ABI1. En experimentos de pérdida de agua por transpiración en condiciones de sequía hab1-1abi1-2 y hab1-1abi1-3 muestran una reducción notable en la pérdida de agua respecto a los mutantes parentales sencillos. Estos resultados muestran que la inactivación combinada de PP2Cs específicas involucradas en la señalización por ABA puede ser una herramienta biotecnológica en la mejora de cultivos tolerantes a la sequía. / Saez Somolinos, AE. (2010). Ruta de transducción de señal del ácido abscísico: Regulación por HAB1 y dianas de interacción. La inactivación combinada de PP2Cs como herramienta biotecnológica para incrementar la tolerancia a sequía en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8658 / Palancia

El óxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa altamente reactiva que regula el crecimiento y el desarrollo de las plantas así como sus respuestas de defensa. El NO se produce principalmente a partir de nitrito por las nitrato reductasas (NRs) en balance con las nitrito reductasas (NiRs), y es percibido a través de un mecanismo en el que está involucrada la proteólisis dirigida por la secuencia aminoterminal del grupo VII de los factores de transcripción ERF (ERFVIIs). El NO ejerce especialmente su función señalizadora al causar modificaciones postraduccionales en las proteínas y alterar su función, estructura y/o estabilidad. Por estos medios y en colaboración con distintas rutas de señalización fitohormonales, el NO es capaz de regular un amplio abanico de procesos celulares en plantas, incluyendo aquellos relacionados con la adquisición de tolerancia a la congelación. Utilizando Arabidopsis thaliana como planta modelo, en este trabajo se descubrió que el NO puede regular su propia biosíntesis, puesto que las enzimas NRs y NiRs fueron reguladas por tres factores principales: señalización inducida por nitrato y controlada por la función del factor de transcripción NIN-like protein 7 (NLP7), la proteólisis dirigida por la secuencia aminoterminal, y la degradación mediada por el proteasoma, probablemente ocasionada por modificaciones postraduccionales relacionadas con el NO. Adicionalmente, se descubrió que el factor de transcripción ERFVII RAP2.3 regula negativamente tanto la biosíntesis de NO como las respuestas que desencadena a través de un mecanismo similar a un reóstato en el que están involucradas ramas específicas relacionadas con el NO de las rutas de señalización de jasmonato y ácido abscísico. Por otro lado, una caracterización metabolómica y transcriptómica combinada de plantas mutantes nia1,2noa1-2 deficientes en NO y plantas fumigadas con NO permitió desentrañar una serie de mecanismos que están controlados por NO. En primer lugar, la percepción de NO en los hipocotilos requeriría varias hormonas para ser completada, como fue confirmado por los rastreos de acortamiento de hipocotilo por NO con mutantes relacionados con hormonas y la colección TRANSPLANTA de líneas transgénicas que expresan condicionalmente factores de transcripción de Arabidopsis. En segundo lugar, dosis elevadas de NO causan una reprogramación masiva aunque transitoria de los metabolismos primario y secundario, incluyendo la alteración del estado redox celular, la alteración de la permeabilidad de estructuras lipídicas y el recambio de proteínas y ácidos nucleicos. Por último, se descubrió que el NO previene el desarrollo de la tolerancia a congelación bajo condiciones no estresantes de temperatura, mientras que resulta esencial para la aclimatación a frío desencadenada por bajas temperaturas que conduce a una tolerancia mejorada a congelación. El NO conseguiría esta modulación afinada de la activación de respuestas relacionadas con frío al coordinar la acumulación de diferentes metabolitos y hormonas. En conjunto, este trabajo arroja luz sobre los mecanismos mediante los cuales, al interactuar con varias rutas señalizadoras y metabólicas, el NO puede regular distintos procesos clave de la fisiología vegetal. / L'òxid nítric (NO) és una molècula gasosa altament reactiva que regula el creixement i desenvolupament de les plantes així com les seves respostes de defensa. El NO es produeix principalment a partir de nitrit per les nitrat reductases (NRs) en balanç amb les nitrit reductases (NiRs), i és percebut a traves d'un mecanisme que inclou la proteòlisi dirigida per la seqüència aminoterminal del grup VII dels factors de transcripció ERF (ERFVII). El NO exerceix la seva funció senyalitzadora majoritàriament al provocar modificacions postraduccionals en les proteïnes i alterar la seva funció, estructura i/o estabilitat. Mitjançant aquestes modificacions i en col·laboració amb distintes rutes de senyalització fitohormonals, el NO es capaç de regular un ampli espectre de processos cel·lulars en plantes, inclosos aquells relacionats amb l'adquisició de tolerància a la congelació. Emprant Arabidopsis thaliana com a planta model, en aquest treball es va descobrir que el NO regula la seva pròpia biosíntesi, donat que els enzims NRs i NiRs foren regulades per tres factors principals: senyalització induïda per nitrat i controlada per la funció del factor de transcripció NIN-like protein 7 (NLP7), la proteòlisi dirigida per la seqüència aminoterminal, i la degradació mitjançant el proteasoma, probablement a causa de modificacions postraduccionals relacionades amb el NO. A més, es va descobrir que el factor de transcripció ERFVII RAP2.3 regula negativament tant la biosíntesi de NO com les respostes que desencadena aquest a través d'un mecanisme similar a un reòstat en el que estan involucrades branques específiques de les rutes de senyalització de jasmonat i àcid abscísic relacionades amb el NO. Per altre costat, una caracterització metabolòmica i transcriptòmica combinada de plantes mutants nia1,2noa1-2 deficients en NO i plantes fumigades amb NO va permetre desentranyar una sèrie de mecanismes que estan controlats per NO. En primer lloc, la percepció de NO en els hipocòtils requeriria de varies hormones, com fou confirmat pels rastrejos d'acurtament d'hipocòtil per NO amb mutants relacionats amb hormones i la col·lecció TRANSPLANTA de línies transgèniques d'expressió condicional de factors de transcripció d'Arabidopsis. En segon lloc, dosis elevades de NO causen una reprogramació massiva, encara que transitòria, dels metabolismes primari i secundari, incloent l'alteració de l'estat redox cel·lular, canvis en la permeabilitat de estructures lipídiques i el recanvi de proteïnes i àcids nucleics. Per últim, es va descobrir que el NO prevé el desenvolupament de la tolerància a congelació en condicions no estressants de temperatura, mentre que resulta essencial per a l'aclimatació a fred induïda per baixes temperatures que condueix a una tolerància millorada a congelació. El NO aconseguiria aquesta modulació minuciosa de l'activació de les respostes relacionades amb fred al coordinar l'acumulació de diferents metabòlits i hormones. En conjunt, aquest treball clarifica els mecanismes pels quals el NO pot regular distints processos clau de la fisiologia vegetal al interactuar amb varies rutes senyalitzadores i metabòliques. / Nitric oxide (NO) is a highly reactive gaseous molecule that regulates plant growth and development as well as defense responses. NO is mainly produced from nitrite by nitrate reductases (NRs) in balance with nitrite reductases (NiRs), and is sensed through a mechanism involving the N-end rule pathway-mediated proteolysis of the group VII of ERF transcription factors (ERFVIIs). NO especially exerts its signaling function by triggering post-translational modifications in proteins and altering their function, structure and/or stability. By these means and in collaboration with different phytohormone signaling pathways, NO is capable of regulating a wide array of cell processes in plants, including those related to the acquirement of freezing tolerance. By using Arabidopsis thaliana as model plant, during the development of this work it was found that NO can regulate its own biosynthesis, as NRs and NiR enzymes were regulated by three main factors: nitrate-induced signaling controlled by the function of the NIN-like protein 7 (NLP7) transcription factor, N-end rule proteolytic pathway, and proteasome-mediated degradation, likely triggered by NO-related post-translational modifications. In addition, the ERFVII transcription factor RAP2.3 was found to negatively regulate both the NO biosynthesis and their triggered responses through a rheostat-like mechanism that involves specific NO-related branches of jasmonate and abscisic acid signaling pathways. On the other hand, a combined metabolomic and transcriptomic characterization of NO-deficient nia1,2noa1-2 mutant plants and NO-fumigated plants allowed to unravel a number of mechanisms that are controlled by NO. First, NO perception in hypocotyls would require various hormones to be fulfilled as it was confirmed by NO-triggered hypocotyl shortening screenings with hormone-related mutants and the TRANSPLANTA collection of transgenic lines conditionally expressing Arabidopsis transcription factors. Second, high NO doses caused a massive but transient reprogramming of primary and secondary metabolism, including alteration of the cellular redox status, alteration of the permeability of lipidic structures or turnover of proteins and nucleic acids. Lastly, NO was found to prevent the development of freezing tolerance under non-stress temperature conditions, while being essential for the low temperature stress-triggered cold acclimation that leads to enhanced freezing tolerance. NO would achieve this fine-tuned modulation of the activation of the cold-related responses by coordinating the accumulation of different metabolites and hormones. Altogether, this work sheds light on the mechanisms by which, by interacting with various signaling and metabolic pathways, NO can regulate several key processes of plant physiology. / Costa Broseta, Á. (2018). Regulation of the nitric oxide synthesis and signaling by posttranslational modifications and N-end rule pathway-mediated proteolysis in Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/114825 / TESIS