[ES] La ubiquitinación inducida por hormonas desempeña un papel crucial en la vida media de los reguladores negativos clave de la propia señalización hormonal. En la señalización por ABA, los reguladores negativos clave son las PP2Cs del clado A, como PP2CA o ABI1, y su degradación es un mecanismo complementario a la inhibición de su actividad mediada por PYR/PYL/RCAR. El ABA promueve la degradación de ABI1 a través de las E3 ligasas PUB12/13, y PP2CA a través de las E3 ligasas RGLG1/5. Sin embargo, se predice que otras E3 ligasas no identificadas también regularán la vida media de las PP2Cs del clado A. En pasos posteriores de la señalización por ABA, el ABA también induce la regulación positiva de los niveles de transcrito y proteína de las PP2Cs como un mecanismo de retroalimentación negativa. Por lo tanto, restablecer la señalización de ABA también requiere la degradación de las PP2Cs para evitar su acumulación excesiva inducida por el propio ABA. En este trabajo identificamos las proteínas BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadores del sustrato de las E3 ligasas multiméricas CULLIN3-RING E3 (CRL3), como proteínas que interactúan con las PP2Cs. BPM3 y BPM5 interactúan en el núcleo con PP2CA, así como con ABI1, ABI2 y HAB1. Además, BPM3 y BPM5 aceleran la degradación de las PP2Cs de una manera dependiente del ABA y su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad al ABA. Además, las plantas mutantes bpm3 bpm5 mostraron una mayor acumulación de PP2CA, ABI1 y HAB1, lo que conduce a una sensibilidad global disminuida al ABA. Finalmente, utilizando ensayos bioquímicos y genéticos, demostramos que las BPM aumentaban la ubiquitinación de PP2CA. Dado que la formación de los complejos ternarios receptor-ABA-fosfatasa se ve notablemente afectada por la abundancia de sus componentes proteicos y la concentración de ABA, revelamos que las BPM y las E3 ligasas multiméricas CRL3 son moduladores importantes de los niveles del correceptor PP2C para regular la señalización temprana de ABA, así como durante los consiguientes pasos de restablecimiento. Al contrario que con PUB12/13, no se sabe cómo el ABA aumenta la degradación de PP2CA a través de RGLG1/5. En el caso de RGLG1, esta proteína se encuentra predominantemente en la membrana plasmática, mientras que PP2CA se encuentra predominantemente en el núcleo. Nosotros demostramos que el ABA modifica la localización subcelular de RGLG1, promoviendo la interacción nuclear con PP2CA. En primer lugar, encontramos que RGLG1 está miristoilado in vivo, lo que facilita su unión a la membrana plasmática, sin embargo, el ABA inhibe esta miristoilación. El ABA también regula negativamente a N-myristoyltransferase 1, la enzima activa y central en la miristoilación de proteínas, esto puede ayudar a promover la translocación de RGLG1 al núcleo. Allí, RGLG1 puede interactuar con ciertos receptores monoméricos del ABA, como PYL8. El reclutamiento nuclear de la E3 ligasa también fue promovido por el aumento de los niveles de proteína PP2CA y por la formación de complejos RGLG1-PYL8-PP2CA en presencia de ABA. Además, nosotros encontramos que RGLG1Gly2Ala, mutada en el sitio de miristoilación N-terminal, muestra localización nuclear constitutiva y provoca una respuesta más sensible al ABA y al estrés salino y osmótico. En resumen, proporcionamos evidencia de que una ligasa E3 puede reubicarse dinámicamente en respuesta al ABA, el estrés salino y osmótico, y el aumento de los niveles de su sustrato, lo que revela un mecanismo para explicar cómo el ABA mejora la interacción RGLG1-PP2CA y, por lo tanto, la degradación de PP2CA. / [CAT] L' ubiquitinació induïda per hormones té un paper crucial en la vida mitjana dels reguladors negatius clau de la pròpia senyalització hormonal. En la senyalització per ABA, els reguladors negatius clau són les PP2Cs del clado A, com PP2CA o ABI1, i la seva degradació és un mecanisme complementari a la inhibició de la seva activitat mediada per PYR/PYL/RCAR. El ABA promou la degradació de ABI1 a través de les E3 lligases PUB12/13, i PP2CA per mitja de les E3 lligases RGLG1/5. No obstant això, es prediu que altres E3 lligases no identificades també regularan la vida mitjana de les PP2Cs del clado A. En passos posteriors de la senyalització per ABA, l'ABA també indueix la regulació positiva de nivells de transcrit i proteïna de les PP2Cs com un mecanisme de retroalimentació negativa. Per tant, restablir la senyalització d'ABA també requereix la degradació de les PP2Cs per evitar la seva acumulació excessiva induïda pel propi ABA. En aquest treball identifiquem les proteïnes BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadors del substrat de les E3 lligases multimèriques CULLIN3-RING E3 (CRL3), com proteïnes que interactuen amb les PP2Cs. BPM3 i BPM5 interactuen en el nucli amb PP2CA, així com amb ABI1, ABI2 i HAB1. A més, BPM3 i BPM5 acceleren la degradació de les PP2Cs d'una manera dependent del ABA i la seva sobreexpressió porta a una major sensibilitat al ABA. A més, les plantes mutants bpm3 bpm5 van mostrar una major acumulació de PP2CA, ABI1 i HAB1, el que porta a una sensibilitat global disminuïda a ABA. Finalment, utilitzant assajos bioquímics i genètics, aconseguint que les BPM augmentaven l' ubiquitinació de PP2CA. Atès que la formació dels complexos ternaris receptor-ABA-fosfatasa es veu notablement afectada per l'abundància dels seus components proteics i la concentració d'ABA, revelem que les BPM i les E3 lligases multimèriques CRL3 són moduladors importants dels nivells del coreceptor PP2C per regular la senyalització primerenca de ABA, així com durant els consegüents passos de restabliment. Al contrari que amb PUB12/13, no se sap com el ABA augmenta la degradació de PP2CA a través d'RGLG1/5. En el cas de RGLG1, aquesta proteïna es troba predominantment en la membrana plasmàtica, mentre que PP2CA es troba predominantment en el nucli. Nosaltres vam demostrar que l'ABA modifica la localització subcelular de RGLG1, promovent la interacció nuclear amb PP2CA. En primer lloc, trobem que RGLG1 està miristoilado in vivo, el que facilita la seva unió a la membrana plasmàtica, però, el ABA inhibeix aquesta miristoilación. El ABA també regula negativament N-myristoyltransferase 1, l' enzim actiu i central en la miristoilación de proteïnes, això pot ajudar a promoure la translocació de RGLG1 al nucli. Allà, RGLG1 pot interactuar amb certs receptors monomèrics de l'ABA, com PYL8. El reclutament nuclear de l'E3 lligasa també va ser promogut per l'augment dels nivells de proteïna PP2CA i per la formació de complexos RGLG1-PYL8-PP2CA en presència d'ABA. A més, nosaltres trobem que RGLG1Gly2Ala, mutada en el lloc de miristoilació N-terminal, mostra localització nuclear constitutiva i provoca una resposta més sensible al ABA i l'estrès salí i osmòtic. En resum, proporcionem evidència que una ligasa E3 pot reubicar dinàmicament en resposta al ABA, l'estrès salí i osmòtic, i l'augment dels nivells de la seva substrat, el que revela un mecanisme per explicar com el ABA millora la interacció RGLG1-PP2CA i, per tant, la degradació de PP2CA. / [EN] Hormone-induced ubiquitination plays a crucial role to determine the half-life of key negative regulators of hormone signaling. In case of ABA signaling, the key negative regulators are the clade-A PP2Cs, such as PP2CA or ABI1, and their degradation is a complementary mechanism to PYR/PYL/RCAR-mediated inhibition of their activity. ABA promotes the degradation of ABI1 through the PUB12/13 E3 ligases, and PP2CA through the RGLG1/5 E3 ligases. However, other unidentified E3 ligases are predicted to regulate clade A PP2Cs half-life as well. At later steps of ABA signaling, ABA also induces upregulation of PP2C transcripts and protein levels as a negative feedback mechanism. Therefore, resetting of ABA signaling also requires PP2C degradation to avoid excessive ABA-induced accumulation of PP2Cs. In this work we identified BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins (BPMs), substrate adaptors of the multimeric CULLIN3-RING E3 ligases (CRL3s), as PP2C-interacting proteins. BPM3 and BPM5 interact in the nucleus with PP2CA as well as with ABI1, ABI2 and HAB1. Additionally, BPM3 and BPM5 accelerate the turnover of PP2Cs in an ABA-dependent manner and their overexpression leads to enhanced ABA sensitivity. Moreover, bpm3 bpm5 mutant plants showed increased accumulation of PP2CA, ABI1 and HAB1, which leads to global diminished ABA sensitivity. Finally, using biochemical and genetic assays we demonstrated that BPMs enhance the ubiquitination of PP2CA. Given the formation of receptor-ABA-phosphatase ternary complexes is markedly affected by the abundance of protein components and ABA concentration, we reveal that BPMs and multimeric CRL3 E3 ligases are important modulators of PP2C co-receptor levels to regulate early ABA signaling as well as the subsequent resetting steps. In contrast to PUB12/13, it was not known how ABA enhances the degradation of PP2CA by RGLG1/5. RGLG1 is predominantly found in the plasma membrane whereas PP2CA is predominant in the nucleus. We demonstrate that ABA modifies the subcellular localization of RGLG1, promoting nuclear interaction with PP2CA. Firstly, we found that RGLG1 is myristoylated in vivo, which facilitates its attachment to the plasma membrane, nevertheless, ABA inhibits its myristoylation. ABA also downregulates N-myristoyltransferase 1, the central active enzyme of protein myristoylation, which may help to promote RGLG1 translocation to the nucleus. There, RGLG1 can interact with certain monomeric ABA receptors, as PYL8. Enhanced nuclear recruitment of the E3 ligase was also promoted by increasing PP2CA protein levels and the formation of RGLG1-PYL8-PP2CA complexes in the presence of ABA. Additionally, we found that RGLG1Gly2Ala protein, mutated at the N-terminal myristoylation site, shows constitutive nuclear localization and causes an enhanced response to ABA and salt and osmotic stresses. In summary, we provided evidence that an E3 ligase can dynamically relocalize in response to ABA, salt and osmotic stress, and increased levels of its target, which reveals a mechanism to explain how ABA enhances RGLG1-PP2CA interaction and hence PP2CA degradation. / Julián Valenzuela, J. (2020). Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137777 / TESIS

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Exocyst is a protein complex composed of eight subunits, evolutionarily conserved in yeasts, animals, and plants. The main function of exocyst is to mediate the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. However, the involvement of exocyst in some other processes, especially in autophagy, has been recently discovered. Plant exocyst is specific because most of its subunits have multiple paralogs. The most diversified subunit is EXO70, which is encoded by 23 paralogous genes in Arabidopsis thaliana. In this thesis, I dealt with subunit AtEXO70E2 (AT5G61010), which has been localized to double-membrane compartments considerably reminiscent of autophagosomes. These compartments were named EXPOs (for exocyst-positive organelles) and described as a component of unconventional protein secretion pathways. There are also hints that EXO70E2 could play a role in autophagic processes. However, details of this relationship remained unexplored. For my experiments, I used stably transformed lines of A. thaliana and transiently transformed leaves of Nicotiana benthamiana. I performed numerous colocalization experiments, applied various pharmacological treatments to the studied lines, and analyzed a mutant line in the EXO70E2 gene. According to my observations, protein EXO70E2 is expressed especially...

ALBA proteins were discovered in Archaea more than 30 years ago. They were gradually identified to be well conserved in Eucaryotes as well. A functional dimeric form of these proteins with DNA and RNA-binding capability was claimed in both mentioned domains of organisms. However, their roles diversified during evolution and vary in between organisms. In Archaea, ALBAs are involved in the genome organization and RNA-protein interactions. In Eukaryotes, there are presented two different subfamilies of ALBA proteins - Rpp20 and Rpp25 subfamily. A sole protein from each subfamily was identified in some organisms though they were multiplied in plants, respectively. These proteins can interact with each other and participate in ontogenetic development and stress responses. According to several studies, ALBA proteins were found to be involved in DNA stability maintenance or pre-rRNA splicing in the nucleus of Arabidopsis thaliana. However, they have been shown to play a role in the cellular metabolism and stress responses in cytoplasm. Six ALBA proteins were identified in the genome of A. thaliana, three from each subfamily. In this study, all heterodimeric protein- protein interactions were investigated by the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay which revealed positive results in...

Fertilization, both in plants and animals, is at its core, a study of cell to cell communication. With respect to plants, the male gametophyte, the pollen tube, elongates within the female organ called the pistil, transporting in its cytoplasm two sperm cells. The pollen tube is attracted by signals secreted from the synergid cells that are located at the entrance to the female gametophyte that resides in the ovule. Secondary pollen tube visitors to the ovules are unwanted and repelled presumably by signals emitted by the fertilized female. The final communication between the pollen tube and female gametophyte is the induction of pollen tube rupture upon penetration of the synergid cell, an event that leads to the release of the two sperm cells, which go on to fertilize the central cell and egg cell within the female gametophyte, completing a double fertilization process that is unique to plants. My thesis research is centered on elucidating the mechanism behind the synergid cell-induced pollen tube rupture process. Studies in our laboratory have established that the synergid cell-expressed receptor like kinase, called FERONIA, mediates a highly oxidative environment in the female gematophyte that is necessary for the pollen tube rupture process. Using an in vitro pollen tube culture system, my research showed that reactive oxygen species (ROS) induces pollen tube rupture in a Ca2+-dependent manner. My results suggests a careful and truly fascinating, though still hypothetical, design of a two molecule, FERONIA and ROS, two step activation system that uses ROS to prime the pollen tube outside the synergid cell, then expose it to calcium within the synergid cell to ensure that pollen tube rupture happens in the synergid cell, enabling fertilization.

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[ES] Las especies reactivas de oxígeno (ROS), el oxígeno molecular (O2) y el óxido nítrico (NO) son factores comunes en las respuestas a diferentes tipos de estrés en las plantas. En los últimos años, las condiciones ambientales adversas han aumentado debido al cambio climático y, entre ellas, las fuertes lluvias que provocan anegaciones o inundaciones en los campos suponen un grave problema para el desarrollo y el futuro de la agricultura. Estas inundaciones provocan que la planta se enfrente a condiciones de hipoxia severas y a la re-oxigenación que ocurre cuando se retira el agua. Es importante, por tanto, conocer los factores genéticos y moleculares que modulan las respuestas de las plantas a la hipoxia u otros tipos de estrés abiótico para hacer frente a estas situaciones. La familia de proteínas VQ de Arabidopsis thaliana incluye cinco miembros codificados por genes que se inducen en respuesta a la hipoxia, al NO y al estrés oxidativo. Dos de ellos, VQ1 y VQ10, codifican dos proteínas con una gran homología de secuencia y estructura, que no poseen actividad transcripcional. En este trabajo, se describe que VQ1 y VQ10 interaccionan entre sí y con ellas mismas, y con las otras tres proteínas VQ y cuatro factores de transcripción WRKY cuyos genes también se inducen en respuesta a hipoxia, NO y estrés oxidativo. Un rastreo de doble híbrido de levadura de una genoteca de Arabidopsis utilizando VQ1 como cebo permitió identificar alrededor de 300 proteínas interactoras de VQ1 y probablemente también de VQ10, sugiriendo que ambas proteínas tienen patrones similares de interacción proteína-proteína. VQ1 y VQ10 son proteínas citoplásmicas y nucleares, por lo que la identificación de casi 50 proteínas cloroplásticas que interaccionan con VQ1 en el cloroplasto sugiere que estas interacciones deben ocurrir en el citoplasma. En el rastreo se identificó la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), una enzima clave para la biosíntesis de isoprenoides, la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas. Al co-inmunoprecipitar DXS y VQ1 o VQ10 se observó que VQ1 y sobre todo VQ10 favorecieron la monomerización de DXS en un ambiente reductor. A partir de la identificación de un mutante hipermórfico vq10-H se ha procedido a caracterizar algunas de las funciones reguladoras ejercidas por VQ10. El análisis transcriptómico comparado de vq10-H y plantas silvestres Col-0 permitió identificar la regulación ejercida por VQ10 en el desarrollo de las raíces, en las respuestas a NO y estrés oxidativo, así como una potencial función reguladora del procesamiento alternativo de ARNs. La sobreexpresión de VQ10 provocó el aumento de la elongación de la raíz primaria, y de la división y elongación celular en la raíz. También provocó una mayor tolerancia al estrés oxidativo, una menor sensibilidad al NO, y una mayor eficiencia fotosintética en comparación con las plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis sugiere que algunas funciones reguladoras de VQ1 y VQ10 en el desarrollo y las respuestas a estrés de las plantas podría estar basado en mecanismos de regulación redox. / [CA] Les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'oxigen molecular (O2) i l'òxid nítric (NO) són factors comuns en les respostes a diferents tipus d'estrés en les plantes. En els últims anys, les condicions ambientals adverses han augmentat a causa del canvi climàtic i, entre elles, les fortes pluges que provoquen inundacions als camps suposen un greu problema per al desenvolupament i el futur de l'agricultura. Aquestes inundacions provoquen que la planta s'enfronte a condicions d'hipòxia severes i a la re-oxigenació que ocorre quan es retira l'aigua. És important, per tant, conéixer els factors genètics i moleculars que modulen les respostes de les plantes a l'hipòxia o altres tipus d'estrés abiòtic per a fer front a aquestes situacions. La família de proteïnes VQ d'Arabidopsis thaliana inclou cinc membres codificats per gens que s'indueixen com a resposta a l'hipòxia, al NO i a l'estrés oxidatiu. Dos d'ells, VQ1 i VQ10, codifiquen dues proteïnes amb una gran homologia de seqüència i estructura, que no posseeixen activitat transcripcional. En aquest treball, es descriu que VQ1 i VQ10 interaccionen entre si i amb elles mateixes, i amb les altres tres proteïnes VQ i quatre factors de transcripció WRKY, els gens dels quals també s'indueixen com a resposta a hipòxia, NO i estrés oxidatiu. Un rastreig amb la técnica del doble híbrid en llevat d'una genoteca d'Arabidopsis utilitzant VQ1 com a esquer va permetre identificar al voltant de 300 proteïnes interactores de VQ1 i probablement també de VQ10, suggerint que ambdues proteïnes tenen patrons similars d'interacció proteïna-proteïna. VQ1 i VQ10 són proteïnes citoplasmàtiques i nuclears, de manera que la identificació de gairebé 50 proteïnes cloroplàstiques que interaccionen amb VQ1 en el cloroplast suggereix que aquestes interaccions han d'ocorrer al citoplasma. En el rastreig es va identificar la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfat sintasa (DXS), un enzim clau per a la biosíntesi d'isoprenoides, la fotosíntesi i el creixement de les plantes. En co-immunoprecipitar DXS i VQ1 o VQ10 es va observar que VQ1 i sobretot VQ10 van afavorir la monomerització de DXS en un ambient reductor. A partir de la identificación d'un mutant hipermòrfic vq10-H s'ha procedit a caracteritzar algunes de les funcions reguladores exercides per VQ10. L'anàlisi transcriptòmic comparat de vq10-H i plantes silvestres Col-0 va permetre identificar la regulació exercida per VQ10 en el desenvolupament de les arrels, en les respostes a NO i estrès oxidatiu, així com una potencial funció reguladora del processament alternatiu d'ARNs. La sobreexpressió de VQ10 va provocar l'augment de l'elongació de l'arrel primària, i de la divisió i elongació cel·lular a l'arrel. També va provocar una major tolerància a l'estrès oxidatiu, una menor sensibilitat al NO, i una major eficiencia fotosintètica en comparació amb les plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi suggereix que algunes funcions reguladores de VQ1 i VQ10 en el desenvolupament i les respostes a estrés de les plantes podria estar basat en mecanismes de regulació redox. / [EN] Reactive oxygen species (ROS), molecular oxygen (O2), and nitric oxide (NO) are common factors in diverse plant stress responses. In the past few years, adverse environmental conditions have increased due to climate change, including heavy rains leading to waterlogging or flooding in fields, posing a serious problem for agriculture's development and future. Floods impose severe hypoxia conditions to plants to be later re-oxygenated when water recedes. Therefore, it is essential to understand the genetic and molecular factors that modulate plant responses to hypoxia and other abiotic stresses to address these situations. The VQ-motif containing protein family in Arabidopsis thaliana includes five members encoded by genes induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. Two of them, VQ1 and VQ10, encode two proteins with significant sequence and structural homology, lacking transcriptional activity. In this study, it is described that VQ1 and VQ10 interact with each other and themselves, as well as with the other three VQ proteins and four WRKY transcription factors whose genes are also induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. A yeast two-hybrid screening of an Arabidopsis library using VQ1 as bait allowed us identifying almost 300 VQ1-interacting proteins, that likely also interact with VQ10, suggesting that their homology can be extended to protein-protein interaction patterns. VQ1 and VQ10 are cytoplasmic and nuclear proteins, so the identification of nearly 50 chloroplast proteins interacting with VQ1 in the chloroplast suggests that these interactions may be occurring in the cytoplasm. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), a key enzyme in isoprenoid biosynthesis, photosynthesis, and plant growth, was identified in the screening. Co-immunoprecipitation of DXS with VQ1 or VQ10 showed that VQ1 and, particularly, VQ10 promoted the monomerization of DXS under reducing conditions. Based on the identification of a hypermorphic vq10-H mutant, some of the regulatory functions exerted by VQ10 have been characterized. Comparative transcriptomic analysis of the hypermorphic vq10-H mutant and Col-0 wild type plants allowed us identifying the regulation exerted by VQ10 in root development, in responses to NO and oxidative stress, as well as in the alternative splicing of RNAs. Overexpression of VQ10 led to increased primary root elongation, and increased root cell division and elongation. It also triggered an enhanced oxidative stress tolerance, reduced sensitivity to NO, and enhanced photosynthetic efficiency compared to wild type plants. Altogether, the work carried out in this thesis suggest that some of the regulatory functions exerted by VQ1 and VQ10 on development and stress responses in plants, could be based on redox mechanisms. / Gayubas Balaguer, B. (2023). Función de las proteínas VQ1 y VQ10 codificadas por genes inducibles por hipoxia, óxido nítrico, y estrés oxidativo en la regulación del desarrollo y las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202571

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