Résumé : Aux soins intensifs (SI), une diminution du décompte plaquettaire peut avoir un impact important. Des études ont démontré une association entre la thrombopénie et la durée de séjour, les saignements, les transfusions et la mortalité. Les facteurs qui prédisent une thrombopénie varient selon les populations étudiées. Les médicaments sont souvent suspectés, mais peu ont été indépendamment associés à la thrombopénie aux SI. Les études publiées à ce jour souffrent de plusieurs limites. Les objectifs de cette thèse étaient de décrire l’épidémiologie, identifier les facteurs de risque associés, d’évaluer l’impact sur la morbidité et la mortalité et d’évaluer les causes indépendantes médicamenteuses de thrombopénie aux SI. Une cohorte rétrospective a été créée à partir de données administratives et cliniques afin de décrire l’épidémiologie, et d’évaluer les facteurs prédictifs et les conséquences de la thrombopénie aux SI. Par la suite, une étude cas-témoin a été entreprise en sélectionnant les patients qui ont souffert d’une thrombopénie de cause indéterminée afin de déterminer les associations entre les médicaments fréquemment utilisés aux SI et la thrombopénie. Un total de 20 711 patients a été inclus dans l’analyse. La prévalence et l’incidence de thrombopénie ont été de 13,3% et 7,8%, respectivement. La thrombopénie a été indépendamment associée à une augmentation des saignements majeurs (aRC 1,32 95% CI 1,20-1,46). Après des ajustements statistiques, la thrombopénie était associée à une augmentation de mortalité (aRC 1,25 IC95% 1,20-1,31). L’impact sur la mortalité a été le plus important dans les catégories d’admission suivantes: cancer, respiratoire, digestif, génito-urinaire et infectieuses. Les facteurs de risque indépendants suivants ont été identifiés: l’âge, le genre masculin, la ventilation mécanique, l’alcoolisme, la cirrhose hépatique, le décompte plaquettaire à l’admission, l’hypersplénisme, le ballon intra-aortique, le choc septique, l’hépatite aiguë, la chirurgie de pontage coronarien et les maladies thromboemboliques. Dans l’étude cas-témoin, 200 cas de thrombopénie ont été identifiés après l’exclusion des maladies fortement associées. Ces cas ont été appariés à 200 témoins admis dans la même année. Parmi les 15 classes de médicaments évalués, seules les quinolones 1,67 (IC95% 1,00-2,87) ont été indépendamment associées à la thrombopénie dans le modèle final. En conclusion, la thrombopénie est indépendamment associée à une hausse de la mortalité qui varie grandement selon la catégorie d’admission. Les facteurs de risque sont nombreux et incluent des facteurs modifiables. Bien que les médicaments soient fréquemment soupçonnés, seules les quinolones semblent être associées à la thrombopénie aux SI. // Abstract : In the intensive care unit, a reduction in platelet counts can have a major impact on patient outcomes. Studies have showed an association between thrombocytopenia and length of stay, bleeding, blood product administration and mortality. Predictors of thrombocytopenia in the intensive care setting vary according to studies. Although medications are often suspected as potential causes, few have been independently associated with thrombocytopenia. In addition, published studies have many limits including small sample sizes, probable residual confounding, and inclusion of invasive interventions. The objectives of the thesis are to describe the epidemiology of thrombocytopenia, identify its risk factors, evaluate its impact on morbidity and mortality, and evaluate the drug-induced causes of thrombocytopenia. A retrospective cohort was created using administrative and clinical data. In the first study, multivariate analysis was used to identify risk factors. In the second study, a case control strategy was used to determine the association between thrombocytopenia and drugs commonly used in the intensive care unit previously associated with thrombocytopenia. A total of 20 711 patients were included in the analysis. The prevalence and incidence of thrombocytopenia defined as a platelet count below 100 x 10[superscript 9]/L were 13.3% and 7.8%, respectively. Thrombocytopenia was independently associated with an increase in the risk of major bleeding (aOR 1.32 95% CI 1.20-1.46). After adjusting for confounders, thrombocytopenia was associated with an increased risk of hospital mortality (aOR 1.25 IC95% 1.20-1.31). The impact of thrombocytopenia on mortality was the most important in the following diagnostic categories: cancer, respiratory, digestive, genitourinary, and infectious. The following independent risk factors were identified: age, male gender, admission platelet counts, mechanical ventilation, alcoholism, liver cirrhosis, hypersplenism, intra aortic balloon pumps, septic shock, acute hepatitis, coronary bypass surgery and venous thromboembolism. In the case control study, 200 cases were identified after exclusion of patients with diseases strongly associated with thrombocytopenia and paired with 200 controls admitted in the same year. Among the 15 medication classes evaluated, only quinolones 1.67 (IC95% 1.00-2.87) were independently associated with thrombocytopenia. In conclusion, thrombocytopenia is independently associated with an increased risk of mortality, which varies according to diagnostic admission categories. Risk factors are numerous and some are modifiable. Although medications are often suspected, only quinolones were statistically associated with thrombocytopenia.

La thrombopénie immunologique (TI) est une maladie auto-immune rare. Son épidémiologie est mal connue. Le traitement de la TI aiguë repose sur les corticoïdes et les immunoglobulines. Passée la phase aiguë, plusieurs traitements sont possibles, dont la splénectomie, le rituximab et les agonistes du récepteur à la thrombopoiétine. L'exposition aux traitements de la TI en vie réelle n'a jamais été évaluée, et leur risque infectieux jamais comparé. Des vaccinations sont recommandées avant le rituximab et la splénectomie, mais la couverture vaccinale n'est pas connue. Nous avons constitué deux matériels complémentaires : 1) la cohorte French Adult Immune Thrombocytopenia : a pHarmacoepidemiological study (FAITH) est la cohorte des patients adultes incidents ayant une TI primaire traités de façon persistante (plus de 3 mois), bâtie dans le Système National d'Information Inter-régimes de l'Assurance Maladie (SNIIRAM) au niveau national ; 2) le registre Cytopénie Auto-immune : Registre Midi-PyrénéEN (CARMEN) est une étude observationnelle en vie réelle suivant les patients incidents de TI dans la région Midi-Pyrénées. Grâce à ces deux cohortes, nous avons décrit l'épidémiologie de la TI incidente en France, l'exposition aux traitements et la couverture vaccinale chez l'adulte, et évalué le risque infectieux des traitements et l'effet protecteur des vaccins. / Immune thrombocytopenia (ITP) is a rare autoimmune bleeding disorder. ITP epidemiology is not well known. ITP treatment is based on glucocorticoids, and intravenous polyvalent immunoglobulin in case of severe bleeding. ITP becomes persistent (lasting more than 3 months) or chronic (more than 12 months) in about 70% of adults. In that case, non-corticosteroid treatments are suggested, mostly splenectomy, rituximab and thrombopoietin receptor agonists. The use of these treatments have never been assessed in the real life practice as well as their effectiveness and safety, particularly as regards the risk of infection. Vaccinations are recommended before splenectomy or rituximab. However, the vaccination rates and their effectiveness has not been assessed. We build two complementary materials: 1) the French Adult Immune Thrombocytopenia: a pHarmacoepidemiological study (FAITH) is the cohort of all incident primary ITP adults persistently treated (more than 3 months), built in the French health Insurance system database (Système national d'information inter-régimes de l'Assurance Maladie, SNIIRAM) at the national level; 2) the Cytopénie Auto-immune : Registre Midi-PyrénéEN (CARMEN) registry that includes and follows all incident ITP adults in the French Midi-Pyrénées region. Thanks to these two cohorts, we could assess the epidemiology of incident ITP in France; describe the exposure ITP treatments; assess the vaccination coverage in rituximab treated and splenectomized patients in France; and assess the risk of infection according to ITP treatments and the protective effect of the vaccines in this population.

La réponse immune sous héparine (H) est associée à la synthèse d’anticorps (Ac) d’isotype IgG dirigés contre le facteur plaquettaire 4 (FP4) modifié par l’héparine. Ces anticorps se fixent par leur fragment Fc aux récepteurs FcγRIIa des plaquettes et induisent une forte activation plaquettaire. Les héparines de bas poids moléculaire sont constituées d’un mélange hétérogène d’oligosaccharides (OS) dont la structure varie en fonction de leur nombre de sucres et de groupements sulfates. Nous avons montré que seuls les OS ayant dix groupements sulfates ou plus, peuvent modifier le FP4 et permettre la fixation des Ac héparine-dépendants. La chirurgie cardiaque est associée à une forte activation plaquettaire et les patients sont exposés à de fortes concentrations d’héparine qui est neutralisée en fin d’intervention par le sulfate de protamine (SP). Alors que 30 à 50 % d’entre eux développent des Ac anti H/FP4 nous avons montré que 25% développent également des Ac dirigés contre les complexes H/SP et que ces Ac sont capables in vitro d’induire une activation plaquettaire. Le rôle de ces Ac in vivo reste cependant discuté. / The immune response under heparin (H) treatment is associated with IgG antibodies (Abs) synthesis against heparin-modified Platelet Factor 4 (PF4). These Abs bind FcγRIIa receptors via their Fc fragment and promote strong platelet activation. Low Molecular Weight Heparins are complex mixtures of polysaccharide fragments. These oligosaccharides (OS) have a variable structure due to variations in the type of sugar units and the number of sulphate groups. We demonstrated that OS longer than 10 saccharides and with a large number of sulphate groups are likely able to modify PF4 and allow the binding of heparin-dependent Abs. Cardiac surgery is associated with strong platelet activation and high doses of unfractionated heparin are administered to patients during surgery, and then neutralized with protamine sulfate (SP) at the end of the intervention. 30 to 50% of patients develop anti H/PF4 Abs, but we demonstrated that 25% do synthethized anti H/SP Abs able to activate platelets in vitro. The pathogenic role of these Abs to H/SP in vivo is controversial.

Les Thrombopénies Induites par l’Héparine (TIH) sont une complication sévère des traitements par l’héparine dues à des IgG qui ciblent le facteur plaquettaire 4 modifié par l’héparine (FP4/H) et induisent une activation cellulaire via FcγRIIA, conduisant à des complications thrombotiques. Nous avons caractérisé 5B9, IgG1 monoclonale chimérique anti-FP4/H mimant parfaitement les anticorps de TIH et qui est donc un excellent outil pour étudier la physiopathologie des TIH. La pathogénicité des anticorps (Ac) de TIH implique leur fixation aux FcγR. Nous avons montré que le clivage de la région charnière des IgG de TIH par IdeS inhibe ces interactions IgG-FcγR et supprime la pathogénicité des Ac. Nous avons aussi construit un Antibody-Drug Conjugate (ADC) antithrombotique, en bioconjuguant le tirofiban (inhibiteur de l’agrégation plaquettaire) et 5B9 déglycosylé grâce à un linker clivable par la thrombine, protéase générée en excès lors d’une TIH. / Heparin Induced Thrombocytopenia (HIT) is a rare but severe complication of heparin treatments. HIT is due to IgG antibodies specific to platelet factor 4 modified by heparin (PF4/H), which activate blood cells, (especially platelets) after binding to FcγRIIA, this process explaining frequent thrombotic complications. We characterized 5B9, a chimeric IgG1 targeting PF4/H and which fully mimics human HIT antibodies. Therefore, 5B9 is a perfect tool for studying the physiopathology of HIT. IgG antibodies to PF4/H are pathogenic by interacting with FcγR. In this regard, we showed that cleavage by IdeS, a bacterial protease, of the hinge of anti-PF4/H IgG, fully suppressed their pathogenicity. Furthermore, we designed an antithrombotic Antibody-Drug Conjugate that combined tirofiban, a GPIIbIIIa inhibitor with deglycosylated 5B9 using a thrombin cleavable linker.

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L’objectif de cette thèse est d’étudier, à l’aide de modèles mathématiques, le mécanisme de régulation qui permet au corps de maintenir une quantité optimale de plaquettes sanguines. Le premier chapitre présente le contexte biologique et mathématique. Dans un second chapitre, un modèle pour la mégacaryopoïèse est introduit qui suppose une régulation ponctuelle par le nombre de plaquettes du taux de différentiation des cellules souches vers la lignée mégacaryocytaire et du nombre de plaquettes produites par mégacaryocyte. Nous montrons que la dynamique de ce modèle est régie par une équation différentielle à retard x'(t) = -?x(t)+f(x(t))g(x(t-t)), et nous obtenons ensuite de nouvelles conditions suffisantes pour la stabilité et l’oscillation des solutions de cette équation. Dans le troisième chapitre, nous analysons un second modèle pour la mégacaryopoïèse qui considère cette fois-ci une régulation opérée en continu uniquement via la vitesse de maturation des mégacaryoblastes. L’analyse de stabilité nécessite d’adapter un cadre pré-existant aux cas où le paramètre de bifurcation n’est pas le retard, et permet de montrer que l’augmentation du taux de mort des mégacaryoblastes conduit à l’apparition de solutions périodiques, en accord avec les observations cliniques de la thrombopénie cyclique amégacaryocytaire. Le dernier chapitre est consacré l’analyse de stabilité d’une équation différentielle à deux retards qui apparait notamment dans le cadre de la mégacaryopoïèse lorsque l’on considère que les plaquettes ont une durée de vie limitée / The object of this thesis is the study, using mathematical models, of the regulation mechanism maintaining an optimal quantity of blood platelets. The first chapter presents the biological and mathematical context of the thesis. In a second chapter, we introduce a model for megakaryopoiesis assuming a regulation by the platelet quantity of both the differentiation rate of stem cells to the platelet cell line and the amount of platelets produced by each megakaryocyte. We show that the dynamic of this model corresponds to a delay differential equation x'(t) = -?x(t) + f(x(t))g(x(t - t)), and we obtain for this equation new sufficient conditions for stability and for the oscillation of solutions. In a third chapter, we analyze a second model for megakaryopoiesis in which the regulation is continuous through the maturation speed of megakaryocyte progenitors. The stability analysis requires to adapt a pre-existing framework to problems where the bifurcation parameter is not the delay, and allows to show that increasing the death rate of megakaryocyte progenitors leads to the onset of periodic solutions, in agreement with clinical observation of amegakaryocytic cyclical thrombocytopenia. The last chapter covers a differential equation with two delays that appears among others in a model of platelet production which considers that platelet death can both age-independent and age-dependent

La thrombopénie immunologique ou purpura thrombopénique immunologique (PTI) est une maladie auto-immune rare responsable d'une destruction périphérique immunologique des plaquettes associée à une production médullaire inadaptée. Dans la première partie de ce travail, nous exposons les connaissances actuelles de sa physiopathologie ainsi que certaines données concernant la réponse immunitaire T, le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg), l'implication de la rate dans la réponse immunitaire ainsi que les modes d'action d'une thérapeutique anti-lymphocytaire B, le rituximab. Dans une seconde partie, nous rapportons les résultats obtenus chez 40 patients atteints de PTI. Nous avons montré que le taux des Treg circulants CD4+CD25HighFoxp3+ est similaire chez les patients et les témoins, avec une élévation de leur taux chez les sujets répondeurs aux traitements. A l'inverse, il existe un déficit quantitatif en Treg au sein de la rate des patients. L'analyse des sous-populations lymphocytaires B spléniques a montré une augmentation du taux de lymphocytes B de la zone marginale chez les patients. Concernant les mécanismes d'action du rituximab, nous avons montré qu'une déplétion lymphocytaire B sanguine et splénique n'est pas suffisante pour obtenir une rémission, et que les plasmocytes ne sont pas sensibles à cette thérapeutique. Par ailleurs, nous proposons un mécanisme d'échappement à ce traitement. En effet, nous avons montré que les patients résistants au RTX présentent une élévation du ratio Th1/Treg spléniques. Chez ces sujets non répondeurs, nous avons également observé une élévation du ratio lymphocytes T CD8+/CD4+, au sein de la rate, suggérant une participation des lymphocytes T cytotoxiques dans la physiopathologie du PTI. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie du PTI, notamment la possible implication des lymphocytes B de la zone marginale et le défaut de contrôle de la réponse immunitaire splénique par les Treg. Concernant le rituximab, son action sur la réponse immunitaire ne semble pas se limiter à une déplétion lymphocytaire B qui n'est pas suffisante pour obtenir une rémission. Un mécanisme d'échappement ou de résistance à cette thérapeutique passe par une orientation Th1 et une probable implication des lymphocytes T CD8+.

La thrombopénie immunologique ou purpura thrombopénique immunologique (PTI) est une maladie auto-immune rare responsable d’une destruction périphérique immunologique des plaquettes associée à une production médullaire inadaptée. Dans la première partie de ce travail, nous exposons les connaissances actuelles de sa physiopathologie ainsi que certaines données concernant la réponse immunitaire T, le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg), l’implication de la rate dans la réponse immunitaire ainsi que les modes d’action d’une thérapeutique anti-lymphocytaire B, le rituximab. Dans une seconde partie, nous rapportons les résultats obtenus chez 40 patients atteints de PTI. Nous avons montré que le taux des Treg circulants CD4+CD25HighFoxp3+ est similaire chez les patients et les témoins, avec une élévation de leur taux chez les sujets répondeurs aux traitements. A l’inverse, il existe un déficit quantitatif en Treg au sein de la rate des patients. L’analyse des sous-populations lymphocytaires B spléniques a montré une augmentation du taux de lymphocytes B de la zone marginale chez les patients. Concernant les mécanismes d’action du rituximab, nous avons montré qu’une déplétion lymphocytaire B sanguine et splénique n’est pas suffisante pour obtenir une rémission, et que les plasmocytes ne sont pas sensibles à cette thérapeutique. Par ailleurs, nous proposons un mécanisme d’échappement à ce traitement. En effet, nous avons montré que les patients résistants au RTX présentent une élévation du ratio Th1/Treg spléniques. Chez ces sujets non répondeurs, nous avons également observé une élévation du ratio lymphocytes T CD8+/CD4+, au sein de la rate, suggérant une participation des lymphocytes T cytotoxiques dans la physiopathologie du PTI. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie du PTI, notamment la possible implication des lymphocytes B de la zone marginale et le défaut de contrôle de la réponse immunitaire splénique par les Treg. Concernant le rituximab, son action sur la réponse immunitaire ne semble pas se limiter à une déplétion lymphocytaire B qui n’est pas suffisante pour obtenir une rémission. Un mécanisme d’échappement ou de résistance à cette thérapeutique passe par une orientation Th1 et une probable implication des lymphocytes T CD8+. / Immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune disease responsible for a peripheral immune destruction of platelets associated with an inappropriate bone marrow production. In this work, we first review the mechanisms involved in the pathogenesis of ITP. We also focus on the T cell immune response, highlighting the key role of regulatory T cells (Treg) in peripheral tolerance. The implication of the spleen in the immune response and the effects of rituximab, a B cell depleting therapy, are discussed. Then, our results obtained from 40 ITP patients are reported. Despite the fact that CD4+CD25HighFoxp3+ circulating Treg levels are similar between patients and controls, a significant increase is observed in responder patients. In the spleen, the rate of Treg is lower in ITP patients. Analyses of the spleens also reveal an increase in the level of marginal zone B cells in ITP. Rituximab is responsible for a complete depletion of both circulating and splenic B cells, which is not sufficient to achieve a response. Moreover, plasma cells are still observed after treatment. An increase in the Th1/Treg ratio in the spleen of non responder patients after rituximab infusion could trigger an escape to this therapy. The involvement of CD8+ T cells in the pathogenesis of ITP is highlighted by the increase in the CD8+/CD4+ ratio in the spleen after rituximab. New fields in the understanding of the pathogenesis of ITP are opened with these results, particularly by showing a quantitative deficiency in splenic Treg and the possible involvement of marginal zone B cells. Regarding rituximab effect on the immune response, we demonstrate on the one hand that complete circulating and splenic B cell depletion is not sufficient to achieve remission, and on the other hand that Th1 response and increase in CD8+ T cells level may represent an escape to this treatment.