The design and development of a versatile time resolved fluorescence spectroscopy (TRFS) system capable of near real time data acquisition and processing for potential clinical diagnostic applications is reported. The TRFS apparatus is portable, versatile and compatible with the clinical environment. The main excitation source is a UV nitrogen laser with a nanosecond pulse width and the detection part consists of a dual grating spectrograph coupled with an MCP-PMT. The nitrogen laser also has a dye module attached to it, which enables broadband excitation of the sample. This setup allows rapid acquisition (250 ms for fluorescence decay at a wavelength) of time resolved fluorescence data with a high spectral (as low as 0.5 nm) and temporal (as low as 25 picoseconds) resolution. Alternatively, a state diode pumped pulsed laser can be used for excitation to improve data collection speed. The TRFS system is capable of measuring a broad range of fluorescence emission spectra (visible to near infra-red) and resolving a broad range of lifetimes (ranging from a few hundred picoseconds to several microseconds). The optical setup of the system is flexible permitting the connection of different light sources as well as optical fiber based probes for light delivery/collection depending on the need of the application. This permits the use of the TRFS apparatus in in vitro, ex vivo and in vivo applications. The system is fully automated for real-time data acquisition and processing, facilitating near-real time clinical diagnostic applications.

Time-resolved fluorescence spectroscopy (TRFS) is a powerful analytical tool for quantifying the biochemical composition of organic and inorganic materials. The potentials of TRFS as nondestructive clinical tool for tissue diagnosis have been recently demonstrated. To facilitate the translation of TRFS technology to the clinical arena, algorithms for online TRFS data analysis are of great need. A fast model-free TRFS deconvolution algorithm based on the Laguerre expansion method has been previously introduced, demonstrating faster performance than standard multiexponential methods, and the ability to estimate complex fluorescence decay without any a-priori assumption of its functional form. One limitation of this method, however, was the need to select, a priori, the Laguerre parameter a and the expansion order, which are crucial for accurate estimation of the fluorescence decay. In this thesis, a new implementation of the Laguerre deconvolution method is introduced, in which a nonlinear least-square optimization of the Laguerre parameter is performed, and the selection of optimal expansion order is attained based on a Minimum Description Length (MDL) criterion. In addition, estimation of the zero-time delay between the recorded instrument response and fluorescence decay is also performed based on a normalized means square error criterion. The method was fully validated on fluorescence lifetime, endogenous tissue fluorophores, and human tissue. The automated Laguerre deconvolution method is expected to facilitate online applications of TRFS, such as clinical real-time tissue diagnosis.

Στην παρούσα μεταπτυχιακή αυτή εργασία μελετήσαμε την συμπεριφορά για πρώτη φορά ενώσεων που είχαν σαν βάση την βενζοδισθιαζόλη. Συγκεκριμένα οι ενώσεις αυτές μελετήθηκαν με την χρήση των τεχνικών της φασματοσκοπίας διφωτονικής απορρόφησης της φασματοσκοπίας σταθερής κατάστασης και της φασματοσκοπίας φθορισμού χρονικής ανάλυσης. Αρχικά όσον αφορά την φασματοσκοπία διφωτονικής απορρόφησης, μπορέσαμε να οδηγηθούμε στα εξής συμπεράσματα: οι καλύτερες ενώσεις που παρουσιάζουν αρκετά μεγάλη διφωτονική απορρόφηση είναι τα γραμμικά μόρια (PK-439 και PK-452) σε σχέση με τα U-shaped μόρια με μέγιστη ενεργό διατομή ΔΦΑ ~2000GM. Επιπλέον παρατηρήσαμε ότι η χρήση της βενζοδισθιαζόλης σαν κεντρικός πυρήνας προκαλεί σημαντική αύξηση της διφωτονικής απορρόφησης, σε σχέση με την βενζοθιαζόλη. Τέλος, με την τεχνική της φασματοσκοπίας φθορισμού χρονικής ανάλυσης μπορέσαμε να οδηγηθούμε σε κάποιες διαπιστώσεις: συγκεκριμένα παρατηρήσαμε ότι όσο το μήκος κύματος καταγραφής μεγαλώνει, τόσο οι καμπύλες αποδιέγερσης γίνονται πιο αργές. Ακόμα διαπιστώσαμε ότι από την σύγκριση μορίων στο μήκος κύματος του μεγίστου, σε εκείνα τα μόρια που αποδιεγείρονται γρήγορα, ευνοούνται οι μη-ακτινοβολητικές διεργασίες και ταυτόχρονα παρουσιάζουν μικρή ενεργό διατομή ΔΦΑ. / --

Fluctuations in protein structure are vital to function. This contrasts the dominating structure-function paradigm, which connects the well-defined three-dimensional protein structure to its function. However, catalysis is observed in disordered enzymes, which lack a defined structure. Disordered proteins are involved in molecular recognition events as well. The aim of this Thesis is to describe the structural changes occuring in protein structure and to investigate the mechanism of molecular recognition. Protein architecture is classified in a hierarchical manner, that is, it is categorized into primary, secondary, and tertiary levels. One of the major questions in biology today is how proteins fold into a defined three-dimensional structure. Some protein folding models, like the framework model, suggest that the secondary structure, like α-helices, is formed before the tertiary structure. This Thesis raises two questions: First, are structural fluctuations that occur in the protein related to the folding of the protein structure? Second, is the hierarchic classification of the protein architecture useful to describe said structural fluctuations? Kinetic studies of protein folding show that important dynamical processes of the folding occur on the microsecond timescale, which is why time-resolved fluorescence spectroscopy was chosen as the principal method for studying structural fluctuations in the peptides. Time-resolved fluorescence spectroscopy offers a number of experimental advantages and is useful for characterizing typical structural elements of the peptides on the sub-microsecond timescale. By observing the fluorescence lifetime distribution of the fluorescent probe, which is a part of the hydrophobic core of a four-helix bundle, it is shown that the hydrophobic core changes hydration state, from a completely dehydrated to a partly hydrated hydrophobic core. These fluctuations are related to the tertiary structure of the four-helix bundle and constitute structural transitions between the completely folded four-helix bundle and the molten globule version. Equilibrium unfolding of the four-helix bundle, using chemical denaturants or increased temperature, shows that the tertiary structure unfolds before the secondary structure, via the molten globule state, which suggests a hierarchic folding mechanism of the four-helix bundle. Fluctuations of a 12 amino acid long helical segment, without tertiary structure, involve a conformational search of different helical organizations of the backbone. Binding and recognition of a helix-loop-helix to carbonic anhydrase occurs through a partly folded intermediate before the final tertiary and bimolecular structure is formed between the two biomolecules. This confirms the latest established theory of recognition that the binding and the folding processes are coupled for the binding molecules.

Τα φωτοβολταϊκά στοιχεία με ευαισθητοποίηση χρωστικής (Dye Sensitized Solar Cells, DSSCs) κίνησαν το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας ύστερα από την πρωτότυπη δημοσίευση του 1991 των Grätzel και O' Regan. Προτάθηκαν ως μία φθηνή εναλλακτική λύση σε σύγκριση με τα συμβατικά ηλιακά στοιχεία από άμορφο πυρίτιο (amorphous silicon). Οι κύριοι παράγοντες που οδήγησαν την επιστημονική κοινότητα να στραφεί προς αυτή την κατεύθυνση ήταν η ευκολία σύνθεσης των χρωστικών με σχετικά απλές χημικές διαδικασίες και η λειτουργία των νέων αυτών φωτοβολταϊκών στοιχείων υπό συνθήκες διάχυτου φωτός. Γενικά, ένα τέτοιο φωτοβολταϊκό στοιχείο αποτελείται από μία φωτοάνοδο (photoanode), ένα πορώδες υπόστρωμα από ημιαγώγιμο οξείδιο μετάλλου (metal oxide semiconducting film), μία χρωστική που χρησιμοποιείται ως φωτοευαισθητοποιητής (sensitizer), έναν ηλεκτρολύτη (electrolyte) και ένα αντιηλεκτρόδιο (counter electrode), το οποίο, συνήθως, επικαλύπτεται με ένα λεπτό στρώμα από πλατίνα (Pt). Η κύρια διεργασία που λαμβάνει μέρος σε ένα DSSC, μετά από την απορρόφηση φωτός, είναι μία διεπιφανειακή μεταφορά φορτίου (interfacial electron transfer IET) από την ηλεκτρονιακά διεγερμένη στάθμη της χρωστικής προς τη ζώνη αγωγιμότητας του ημιαγωγού. Η χρονική της διάρκεια είναι της τάξεως των μερικών εκατοντάδων fs και κατατάσσεται στα υπερταχέα φαινόμενα. Ο όρος που έχει επικρατήσει, για τη διεργασία αυτή στα DSSCs, είναι έκχυση ηλεκτρονίων (electron injection) και χρησιμοποιείται στην παρούσα διπλωματική εργασία. Η τεχνική της φασματοσκοπίας φθορισμού χρονικής ανάλυσης με παλμούς διάρκειας μερικών δεκάδων fs, αποτελεί μία από τις πιο αξιόπιστες και άμεσες τεχνικές για την καλύτερη δυνατή καταγραφή υπερταχέων φαινομένων, όπως η έκχυση ηλεκτρονίων. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της έκχυσης ηλεκτρονίων με τη χρήση δύο νέων οργανικών χρωστικών, της μορφής D-π-A, ως φωτοευαισθητοποιητές σε DSSCs με την τεχνική αυτή.Στο πρώτο κεφάλαιο πραγματοποιείται μία γενική επισκόπηση των βασικών αρχών που διέπουν τα φωτοβολταϊκά στοιχεία με ευαισθητοποίηση χρωστικής. Αρχικά, γίνεται αναφορά στα μέρη που αποτελούν ένα τέτοιο φωτοβολταϊκό στοιχείο και ακολούθως στα υλικά και στις διεργασίες οι οποίες συμμετέχουν σε ένα ολοκληρωμένο DSSC.Στο δεύτερο κεφάλαιο επιχειρείται, στο πρώτο σκέλος, μία γενική ανασκόπηση της θεωρίας του Markus για τη μεταφορά των ηλεκτρονίων (Markus Theory). Έπειτα, πραγματοποιείται μία αναλυτική επισκόπηση της δυναμικής και κινηματικής των διεργασιών που συντελούνται στα DSSCs. Συνεχίζοντας στο τρίτο κεφάλαιο, παρουσιάζονται πληροφορίες σχετικές με τα υποστρώματα και τις χρωστικές που χρησιμοποιούνται στα DSSCs. Το κεφάλαιο επικεντρώνεται στην περιγραφή των υποστρωμάτων TiO2 και ΖnO, τα οποία αποτελούν τα κύρια υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στα DSSCs. Στο δεύτερο σκέλος του κεφαλαίου, πραγματοποιείται αναφορά στις ιδιότητες που οφείλουν να πληρούν οι χρωστικές, για τη χρήση τους στα DSSCs, καθώς και εκτενής ανασκόπηση των χρωστικών, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί, μέχρι σήμερα, ως φωτοευαισθητοποιητές. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζονται οι μηχανισμοί που συμμετέχουν κατά την αποδιέγερση ενός οργανικού μορίου και οι χρονικές κλίμακες, που αυτοί εμφανίζονται (διάγραμμα Jablonski). Επίσης, γίνεται αναφορά στις πληροφορίες που εξάγονται από τα φάσματα σταθερής κατάστασης (steady state spectra) και χρονικής ανάλυσης (time-resolved spectra), καθώς και η μεταξύ τους σύγκριση. Στο πέμπτο κεφάλαιο πραγματοποιείται μία αναλυτική περιγραφή της πειραματικής διάταξης, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή των πειραματικών δεδομένων. Τέλος, στα τελευταία δύο κεφάλαια (πέμπτο και έκτο) περιγράφεται, στο πρώτο, ο φωτοφυσικός χαρακτηρισμός των δύο νέων οργανικών χρωστικών, ΜΖ-173 και ΜΖ-175, της δομής D-π-Α, σε διάλυμα THF και σε στερεό υπόστρωμα TiO2 αντίστοιχα, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως το υπόστρωμα προσρόφησης των χρωστικών. Ακολούθως, μελετήθηκε η δυναμική και η απόδοση της έκχυσης των ηλεκτρονίων από τις χρωστικές αυτές προς το ημιαγώγιμο υπόστρωμα TiO2, με χρήση της τεχνικής της φασματοσκοπίας χρονικής ανάλυσης φθορισμού με παλμούς διάρκειας μερικών δεκάδων fs (femtosecond time resolved fluorescence spectroscopy). Ως δείγμα αναφοράς, για την εύρεση της απόδοσης της έκχυσης των ηλεκτρονίων στη ζώνη αγωγιμότητας του ημιαγωγού, χρησιμοποιήθηκε νανοκρυσταλλικό υπόστρωμα Al2O3. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η μελέτη της δυναμικής της έκχυσης των ηλεκτρονίων με τη χρήση του μορίου CDCA, ως συνπροσροφητή στην επιφάνεια των υποστρωμάτων TiO2 και Al2O3, μαζί με χρωστική ΜΖ-173, σε διάφορες συγκεντρώσεις. Αυτή η μελέτη έγινε με σκοπό τη μείωση της συσσωμάτωσης των μορίων της χρωστικής, αφού το μόριο CDCA έχει την ιδιότητα, λόγω της δομής του, να κρατά σε απόσταση τα μόρια της χρωστικής. / Dye-sensitized solar cells (DSSCs) have attracted great scientific interest after the first demonstration of Grätzel and O’Regan in 1991. They were proposed as low cost alternatives to the conventional amorphous silicon solar cells. The key factors which led the scientific community to this direction are the simplicity of their fabrication procedures with mild chemical processes and their operation under ambient conditions of diffused light. Generally, a DSSC consists of a photoanode, a nanostructured metal oxide semiconducting film, a dye sensitizer, an electrolyte and a counter electrode which is usually coated with Pt. The fundamental process that takes place in a DSSC, after the absorption of a photon by the dye, is an interfacial electron transfer (IET) from the dye’s electronically excited state to the semiconductor’s conduction band (CB), taking place within a few hundred femtoseconds. The term which is generally used for this process in DSSCs is electron injection. Ultrafast fluorescence upconversion spectroscopy is one of the most precise and direct techniques for the study and interpretation of such phenomena. The main subject of this master thesis is the presentation of two novel synthesized organic dyes with D-π-A structure and their study as photosensitizers for DSSCs. It is focused on the photophycical properties of these two dyes in solution and on titanium dioxide (TiO2) substrate, which is used as the metal oxide semiconducting film, and especially on the dynamics of electron injection process from the dye’s excited state to the conduction band of the TiO2 with the aforementioned technique. Finally, the electron injection dynamics of one of dyes with coadsorption of co-adsorbers also investigated. This type of molecules can decrease the amount of aggregates penetrating among the dye molecules but on the same time they cause a decrease of the total amount of the adsorbed dye molecules.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von Biosensoren mit dem Ziel, mit Hilfe der Kopplung molekular geprägter Polymere (MIPs) als neuartiges Rezeptormaterial und dem sensitiven Nachweisprinzip der Fluoreszenz eine neue Qualität des Analytnachweises zu erreichen. Es wurde eine neue Strategie zur Optimierung der Bindungseigenschaften von molekular geprägten Polymeren in wässrigen Lösungsmitteln entwickelt, die die Kopplung aus Design of Experiments und der Optimierung multipler Zielgrößen umfasst. Damit konnten die Polymerbindungseigenschaften für alle vier betrachteten Parameter wesentlich verbessert werden. Mit Hilfe stationärer und zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken wurde die Aufklärung der Wechselwirkung zwischen MIP und Analyt auf molekularer Ebene sowie die Charakterisierung einer neuen Nachweisstrategie basierend auf einen Förster-Resonanzenergietransfer-Mechanismus realisiert. Es wurde ferner ein MIP-Sensor für biologische Proben mit mikrofluidischer Probenzuführung aufgebaut und mittels Fluoreszenzspektrometer als konventionelles Nachweisverfahren etabliert. Darauf aufbauend wurde der optische Nachweis miniaturisiert und somit miniaturisierte Lichtquellen und Detektoren sowie eine faser-optische Lichtleitung eingesetzt. Davon ausgehend erfolgte die Optimierung des Messaufbaus hinsichtlich der Sensitivität und Nachweisgrenze des fluoreszierenden Analyten. Schließlich wurden erstmalig fluoreszenzmarkierte MIP-Partikel zur Lokalisation und Quantifizierung auf Zelloberflächen eingesetzt, d.h. diese dienten als Antikörperersatz der Immunfärbung. / This thesis deals with the development of biosensors with the aim to couple molecularly imprinted polymers (MIPs) as new receptor material with the sensitive detection principle of fluorescence in order to improve analyte detection. A new strategy for optimization of binding parameters of molecularly imprinted polymers in aqueous media was developed which is based on the coupling of design of experiments and the optimization of multiple objective parameters. Due to that the polymer binding properties for all four considered parameters could be optimized considerably. With the help of steady state and time-resolved fluorescence techniques the interaction between MIP and analyte could be clarified on a molecular basis. Furthermore the characterization of a new detection strategy based on a Förster resonance energy transfer mechanism was realized. Moreover a MIP sensor with microfluidic sample handling for biological samples was built-up and established with fluorescence spectroscopy as conventional detection method. Based on that, the optical detection was miniaturized with respect to light sources, detectors as well as optical fibers for light guidance. This set-up was optimized concerning sensitivity and limit of detection of the fluorescent analyte. Finally, for the first time fluorescently marked MIP particles were applied for imaging on cell surfaces – meaning that they were used for immunostaining as antibody mimics.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von Biosensoren mit dem Ziel, mit Hilfe der Kopplung molekular geprägter Polymere (MIPs) als neuartiges Rezeptormaterial und dem sensitiven Nachweisprinzip der Fluoreszenz eine neue Qualität des Analytnachweises zu erreichen. Es wurde eine neue Strategie zur Optimierung der Bindungseigenschaften von molekular geprägten Polymeren in wässrigen Lösungsmitteln entwickelt, die die Kopplung aus Design of Experiments und der Optimierung multipler Zielgrößen umfasst. Damit konnten die Polymerbindungseigenschaften für alle vier betrachteten Parameter wesentlich verbessert werden. Mit Hilfe stationärer und zeitaufgelöster Fluoreszenztechniken wurde die Aufklärung der Wechselwirkung zwischen MIP und Analyt auf molekularer Ebene sowie die Charakterisierung einer neuen Nachweisstrategie basierend auf einen Förster-Resonanzenergietransfer-Mechanismus realisiert. Es wurde ferner ein MIP-Sensor für biologische Proben mit mikrofluidischer Probenzuführung aufgebaut und mittels Fluoreszenzspektrometer als konventionelles Nachweisverfahren etabliert. Darauf aufbauend wurde der optische Nachweis miniaturisiert und somit miniaturisierte Lichtquellen und Detektoren sowie eine faser-optische Lichtleitung eingesetzt. Davon ausgehend erfolgte die Optimierung des Messaufbaus hinsichtlich der Sensitivität und Nachweisgrenze des fluoreszierenden Analyten. Schließlich wurden erstmalig fluoreszenzmarkierte MIP-Partikel zur Lokalisation und Quantifizierung auf Zelloberflächen eingesetzt, d.h. diese dienten als Antikörperersatz der Immunfärbung. / This thesis deals with the development of biosensors with the aim to couple molecularly imprinted polymers (MIPs) as new receptor material with the sensitive detection principle of fluorescence in order to improve analyte detection. A new strategy for optimization of binding parameters of molecularly imprinted polymers in aqueous media was developed which is based on the coupling of design of experiments and the optimization of multiple objective parameters. Due to that the polymer binding properties for all four considered parameters could be optimized considerably. With the help of steady state and time-resolved fluorescence techniques the interaction between MIP and analyte could be clarified on a molecular basis. Furthermore the characterization of a new detection strategy based on a Förster resonance energy transfer mechanism was realized. Moreover a MIP sensor with microfluidic sample handling for biological samples was built-up and established with fluorescence spectroscopy as conventional detection method. Based on that, the optical detection was miniaturized with respect to light sources, detectors as well as optical fibers for light guidance. This set-up was optimized concerning sensitivity and limit of detection of the fluorescent analyte. Finally, for the first time fluorescently marked MIP particles were applied for imaging on cell surfaces – meaning that they were used for immunostaining as antibody mimics.