Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_D.pdf: 34867811 bytes, checksum: 839d8dbb3d76170bebebbc5e8619b847 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K / Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_M.pdf: 14587191 bytes, checksum: b8bac41b29ca5081a5bcb225f83e4773 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Arrazoado. A Quinase de Adesão Focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação da sinalização que determina as alterações fenotípicas de cardiomiócitos estimulados mecanicamente. A regulação da atividade da FAK é complexa e depende de mecanismos intramoleculares e da cooperação com a tirosino-quinase Src. Há evidências de que a tirosino-fosfatase SHP-2 contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina e, portanto da atividade da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Este estudo objetivou examinar se a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs. Examinamos se em MVRNs controle (i.e. não submetido a estímulo mecânico), a atividade da SHP-2 contribui para o baixo nível de fosforilação em tirosina da FAK e se em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos a inibição da atividade da SHP-2 paralela a dissociação FAK/SHP-2 exerce papel permissivo na elevação da fosforilação da FAK. Material e Métodos. Utilizou-se modelo de sobrecarga pressora por coarctação da aorta em ratos (miocárdio-VE) e estiramento in vitro em MVRNs. As abordagens experimentais incluíram técnicas de imunoprecipitação, western blot, imunohistoquímica, atividade de tirosino fosfatase in vitro, expressão de SHP-2 recombinante e avaliação da expressão do gene da cadeia pesada de beta-miosina (ß- miosina). Resultados. A coarctação da aorta (miocárdio-VE) e o estiramento (MVRNs) aumentaram a fosforilação da FAK no resíduo tirosina 397, em miocárdio-VE (200%) e em MVRNs estirados (75%). A FAK imunoprecipitada de amostras controles, encontrou-se associada a SHP-2 e o estímulo mecânico acompanhou-se de redução dessa associação, no miocárdio (60%) e em MVRNs (84%). Experimentos com imunohistoquímica e microscopia confocal demonstraram co-localização da FAK e da SHP-2 em MVRNs controle. Ocorreu redução da atividade de tirosino-fosfatase em imunoprecipitados de anticorpo anti-FAK (25%) e anticorpo anti-SHP-2 (25%) de miocárdio-VE de animais submetidos à coarctação da aorta, e anti-FAK (20%) e anti-SHP-2 (40%) de MVRNs estirados. A SHP-2 recombinante foi capaz de reduzir (70%) in vitro a fosforilação da FAK ativada por estímulo mecânico. Ocorreu aumento (125%) da quantidade de FAK fosforilada em MVRNs controles tratados com TFMS (inibidor seletivo da atividade da SHP-2); naqueles submetidos ao estiramento, o aumento em relação aos MVRNs estirados, mas não tratados com TFMS, foi menor (40%). Ocorreu paralelamente, diminuição (40%) da associação FAK/SHP-2 e aumento da expressão do gene fetal da cadeia pesada da ß - miosina (110%) em MVRNs tratados com TFMS; Os MVRNs tratados concomitantemente com TFMS e PP2 (inibidor farmacológico da FAK), apresentaram atenuação desse aumento (25%). Conclusão. Os dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs, exercendo papel inibitório na ativação da FAK, contribuindo para o seu baixo nível de fosforilação em MVRNs e miocárdio na ausência de estímulo mecânico. A diminuição da associação FAK/SHP-2, da atividade específica da SHP-2 em MVRNs ou miocárdio submetidos a estímulos mecânicos e o aumento da fosforilação da FAK mediante tratamento dos MVRNs com TFMS, indicam que a redução da atividade da SHP-2 e da associação a FAK, é um importante mecanismo que colabora para o aumento de fosforilação da FAK em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos sustentados. O aumento da expressão da cadeia pesada da ß ¿ miosina conseqüente à inibição da atividade da SHP-2 e a atenuação desse aumento, perante a concomitante inibição da atividade da FAK, corrobora nossa hipótese de que a SHP-2 modula a ativação da FAK em cardiomiócitos, influenciando a reprogramação gênica característica da ativação da sinalização hipertrófica, por estímulo mecânico / Abstract: Mechanical forces drive changes in cardiac myocyte function and structure that occur in response to hemodynamic overload. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether the protein tyrosine-phosphatase SHP-2 plays a role in baseline and stretch induced FAK activation and signaling in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).NRVMs were subjected to cyclic stretch up to 60 min, studied by coimmunoprecipitation, immunoblotting, tyrosine-phosphatase activity assay, RT-PCR, and used in assays utilizing recombinant SHP-2 catalytic domain. Analysis was extended to NRVMs treated with Shp2 inhibitor TFMS and with FAK/Src Inhibitor PP2. FAK had a relatively low basal level of phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs. Cyclic stretch (1HZ, 10%) induced rapid and sustained (up to 60 min) increases in phosphorylation of FAK at Tyr397. The results of coimmunoprecipitation assays indicated that FAK and SHP-2 are associated in non-stretched NRVMs, but cyclic stretch markedly reduced (to 25% and 60% after 10 and 60 min, respectively) the amount of SHP-2 recovered from the anti-FAK antibody precipitates. The tyrosine phosphatase activity of the anti-SHP-2 immunocomplex taken from non-stretched cardiac myocytes was relatively high, but it was markedly reduced (to 60% after 10 and 60 min) in samples of stretched cells. The recombinant PTP domain of SHP-2 was demonstrated to be able to dephosphorylate the native FAK immunoprecipitated from NRVMs. The inhibition of SHP-2 activity by the pharmacological inhibitor TFMS markedly increased FAK phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs to levels comparable to those seen in stretched cells. Treatment with TFMS lasting for 4h was accompanied by a marked increase (to 200) the expression of beta-myosin heavy chain mRNA in non-stretched NRVMs. This effect was attenuated by 25% in NRVMs simultaneous treated with the FAK/Src inhibitor PP2.In conclusion, the present data demonstrated that the basal FAK phosphorylation at Tyr397 is modulated by SHP-2 and that inhibition of SHP-2 during cyclic stretch has a permissive role on FAK activation by mechanical stress. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by SHP-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T09:40:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_AnaPaulaDalla_M.pdf: 3504258 bytes, checksum: c5455cd7943b5dcb62c07cb63be2f681 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Mudancas dinamicas que ocorrem no intersticio do coracao contribuem diretamente para o remodelamento miocardico decorrente de doencas cardiacas tais como infarto do miocardio, cardiopatia hipertensiva e cardiomiopatias. As metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs) sao importantes no remodelamento destas doencas. Estimulos mecanicos e neuro-humoral regulam a expressao e atividade de MMPs atraves de multiplos processos. Em estudos previos verificamos que o silenciamento da FAK no VE de camundongos inibe a fibrose e reduz a atividade de MMP2. Objetivamos avaliar o papel da FAK no controle da ativacao de fibroblastos cardiacos de ratos(FCRNs), induzidos por estiramento mecanico. Os FCRNs foram cultivados em placas Bioflex e submetidos a estiramento ciclico (10%) por ate 8 horas, exceto os controles. A expressao e atividade da FAK foram avaliadas por imunoblottings com anticorpos especificos para FAK ou pFAK Tyr397, respectivamente. A expressao das MMPs 2 e 9 foi avaliada em imunoblottings e a atividade por zimografia ambas no sobrenadante da cultura. O estiramento provocou aumento de 2.4 vezes da quantidade de FAK fosforilada em Tyr397, alem da expressao e a atividade de MMP 2 e 9. Alem disto, modificou os parametros de proliferacao dos FCRNs, mostrando aumento de celulas positivas para Ki67 e BrdU. Do mesmo modo, a diferenciacao em miofibroblastos foi ativada(celulas positivas para a-actina de musculo liso (a-SMA). A inibicao genica da FAK atraves da tecnica de interferencia de RNA (siRNAFAK), nos FCRNs, inibiu a expressao de a-SMA, a atividade e a expressao das MMPs 2 e 9. Alem disso, a deplecao da FAK em FCRNs promoveu a diminuicao da fosforilacao em AKT Ser473, TSC-2 Thr1462, e S6 quinase Thr389 em resposta ao estiramento mecanico. A ativacao dos FCRNs foi impedida pelo pre-tratamento com o inibidor do complexo mTOR, rapamicina. Assim mostramos que a FAK medeia a ativacao de FCRNs invocado pelo estresse mecanico, possivelmente atraves da coordenacao da via de sinalizacao mTOR. Os resultados do presente estudo indicam a ativacao da FAK pode ter um papel critico na proliferacao e diferenciacao, e na ativacao de MMPs em FCRNs quando submetidos a estiramento, e ainda o knockdown da FAK apresenta efeitos contrarios, logo, infere-se o papel da FAK na ativacao de fibroblastos cardiacos. / Abstract: Dynamic changes that occur in the heart interstitium contribute directly to the myocardial remodeling due to heart disease such as myocardial infarction, hypertensive heart disease and cardiomyopathies. The extracellular matrixmetalloproteinases (MMPs) play an important role in remodeling in these diseases. Mechanical and neuro-humoral stimuli regulate the MMPs expression/activity through several processes which include the control of expression, activation by cascades of own MMPs and endogenous inhibitors. In recent studies from our laboratory showed that the FAK silencing in the left ventricle of mice inhibits the fibrosis development, and in parallel reduced the MMP2.activity and expression. The purpose of this study was to evaluate the role of FAK in controlling the MMP 2 and 9 expression and activity in rat cardiac fibroblasts. Cardiac fibroblasts from neonatal rat (FCRNs) were grown on silicon plates and then subjected to cyclic stretch (10%) for up to 8 hours, except the controls. The FAK expression and activity were assessed for imunoblottings through with specific antibodies to FAK or phospho -FAK Tyr397, respectively. The expression of MMP 2 and 9 was evaluated with specific antibodies in imunoblottings and activity through zimography both in the supernatant culture. Furthermore, FCRNs depleted of FAK was defective in AKT Ser473, TSC-2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 phosphorylation in response to cyclic stretch. The activation of CF-P3/80 invoked by cyclic stretch was prevented by pre-treatment with the mTOR complex inhibitor rapamycin. These findings demonstrate that FAK signaling plays a critical role in mediating the activation of cardiac fibroblasts invoked by mechanical stress possibly by coordinating the downstream mTOR signaling pathway. The results of this study indicate that the activation of FAK can have a critical role to MMPs activation in cardiac fibroblasts, as well as, the proliferation and differentiation of these cells when subjected to stretching, and the FAK knockdown presents contrary effects, therefore, to corroborate infer the FAK role in differentiation and proliferation cell, and the MMPs balance in cardiac fibroblasts. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T23:08:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_Leandro_M.pdf: 3831901 bytes, checksum: 40e5df211d7e6fd923f654bd8d3a1ec1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Nas doenças do coração ocorre hipertrofia e remodelamento do ventrículo esquerdo com impacto negativo na evolução clínica. Esses fatores influenciam independentemente o risco cardiovascular por elevarem a predisposição a infartos do miocárdio, ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca e ao aparecimento de arritmias ventriculares graves. Estruturalmente ocorrem crescimento e degeneração dos miócitos cardíacos, fibrose e alterações da microcirculação. Estas alterações comprometem irreversivelmente a histoarquitetura do miocárdio, limitando a eficácia dos tratamentos convencionais, principalmente no estágio mais avançado caracterizado pela insuficiência cardíaca. A rede de sinalização celular envolvida na resposta das células miocárdicas (miócito e não miócitos) a forças mecânicas tem papel crítico na compreensão da patogênese da hipertrofia. A quinase de adesão focal (FAK), uma enzima associada à sinalização por integrinas, é ativada precocemente e exerce influência no desenvolvimento e sustentação da resposta hipertrófica do miocárdio à sobrecarga pressórica. Nesse estudo foi avaliado o efeito de um composto inédito derivado de quinazolina (BZLO) com potencial ação inibitória da FAK no coração de camundongos submetidos à sobrecarga pressórica por coarctação da aorta. In vitro, esse composto inibiu a atividade catalítica da FAK purificada com IC50 de 1nM. In vivo, o tratamento dos camundongos submetidos à coarctação da aorta com o composto (BZLO) provocou inibição do resíduo Tyr397 da FAK. Demonstrando que o composto não só preveniu, mas também promoveu regressão da hipertrofia do ventrículo esquerdo típica do modelo, acompanhada de atenuação da hipertrofia dos cardiomiócitos e da fibrose intersticial, e preservação da função ventricular. Esses resultados indicam que o tratamento com o composto (BZLO), presumivelmente por inibir a FAK, atenua as alterações estruturais e funcionais provenientes da sobrecarga pressórica crônica no ventrículo esquerdo de camundongos, sugerindo seu potencial como alternativa na prevenção e tratamento da insuficiência cardíaca / Abstract: Cardiac remodeling and hypertrophy have negative impact in the evolution of heart disease. They raise predisposition to myocardium infarction, heart failure and fatal ventricular arrhythmias, being independent markers of cardiovascular prognosis. Cardiomyocyte growth followed by degeneration, interstitial fibrosis and alterations in the microcirculation can be detected structurally in hypertrophic hearts. These alterations jeopardize myocardium tissue architecture irreversibly limiting therapeutic efficacy especially in advanced stages of disease with heart failure. The understanding of signaling network in response to mechanical stimuli is crucial in the study of cardiac hypertrophy. Focal adhesion kinase (FAK) an enzyme linked to signaling by integrins is activated in response to pressure overload and influences the development of myocardial hypertrophic response. In the present study, a compound based on quinazoline scaffold which is a FAK inhibitor, named BZLO, is examined for its effects on cardiac hypertrophy of mice model of aortic constriction. BZLO strongly inhibits catalytic activity of purified FAK in vitro (IC50 = 1nM). Satisfactory bioavailability of BZLO was observed after oral administration. BZLO treatment decreased FAK phosphorylation at Tyr397 and attenuated cardiomyocyte growth and interstitial fibrosis preserving cardiac function in the mice model of chronic pressure overload induced by aortic constriction. These findings suggest that BZLO is effective in attenuating the deleterious structural and functional consequences of chronic pressure overload in mice heart, suggesting that it has the potential to be considered as an option for the prevention and treatment of heart failure / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestre em Ciências

Orientador: Wilson Nadruz Júnior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T15:00:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MaruskadoRocioNeufert_D.pdf: 2265410 bytes, checksum: 8aea5cb9fd86986cff8999d0e81b40fc (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O aumento do estresse circunferencial ou mecânico é um dos principais estímulos responsáveis pela aterogênese induzida por hipertensão arterial, além de ser um determinante para a localização das placas ateroscleróticas na árvore arterial. Neste contexto, moléculas mecano-sensíveis ou responsivas ao estresse mecânico podem exercer um papel fundamental no desenvolvimento do fenótipo pró-aterogênico em células vasculares. A quinase de adesão focal (FAK) tem sido considerada uma proteína central na mecanotransdução em diversos tipos celulares, por seu papel potencial na ativação de vias de sinalização envolvidas no crescimento celular, anti-apoptose e inflamação. Neste trabalho, nós inicialmente caracterizamos a ativação da FAK em linhagem de célula endotelial de aorta de coelho (RAEC) submetida a estiramento mecânico pulsátil e, em seguida, investigamos a influência da inibição desta proteína, por meio de oligodeoxinucletídeo-antisense e pelo inibidor farmacológico PP2, sobre a expressão de moléculas pró-aterogênicas e a adesividade leucocitária neste modelo experimental. Nossos resultados mostraram que a FAK é ativada precocemente por estiramento mecânico e é fundamental para a expressão de TLR2, TLR4, VCAM-1 e E-selectina induzida por sobrecarga mecânica em células endoteliais. A inibição da FAK endotelial com PP2 e oligodeoxinucletídeo-antisense bloqueou a adesão de células monocitóides THP1 às células endoteliais induzida por estiramento in vitro. O próximo passo foi avaliar o impacto da FAK sobre expressão de moléculas pró-aterogênicas induzida por sobrecarga hemodinâmica in vivo, utilizando o modelo de coarctação da aorta em ratos Wistar. Os resultados dos estudos in vivo demonstraram que a FAK é ativada nas primeiras horas após instituição da sobrecarga pressora em segmentos de aorta. Após 7 dias de coarctação, os segmentos aórticos proximais à estenose apresentaram aumento na expressão de TLR2, TLR4, VCAM-1, E-selectina, metaloproteinases de matriz 2 e 9, além de maior adesividade às células THP1. Estes fenômenos foram inibidos por meio de tratamento prévio dos animais com small interference RNA direcionado especificamente contra a FAK. Em conjunto, estes dados indicam que a FAK exerce um papel fundamental na resposta pró-aterogênica de células vasculares ao estresse mecânico in vitro e in vivo / Abstract: The increase in circumferential or mechanical stress is a major stimulus by which hypertension stimulates atherogenesis and a main determinant for the location of atherosclerotic plaques in the arterial tree. Mechano-sensitive molecules can play a key role in the development of pro-atherogenic vascular cell phenotype. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been considered a central protein in mechanotransduction, because of its potential role in the activation of cell signaling pathways involved in cell growth, anti-apoptosis, and inflammation. In this work, we initially evaluated the activation of FAK in rabbit aortic endothelial cell (RAEC) lineage subjected to cyclic mechanical stretch and then investigated the impact of FAK inhibition, by transfection with specific oligodeoxynucleotide antisense and pre-treatment with the pharmacological inhibitor PP2, on the expression of pro-atherogenic molecules and leukocyte adhesion in this experimental model. Our results showed that FAK was rapidly activated by mechanical stretch and was critical to stretch-induced expression of TLR2, TLR4, VCAM and E-selectin in endothelial cells. FAK endothelial inhibition also blocked the adhesion of THP1 monocytoid cells to endothelial cells induced by stretch in vitro. The next step was to investigate the role of FAK in load-induced expression of pro-atherogenic molecules in vivo, by subjecting Wistar rats to aortic constriction. The results of in vivo assays revealed an early activation of FAK in aortic segments subjected to pressure overload. After 7 days of aortic constriction, vascular segments subjected to high pressure exhibited increased expression of TLR2, TLR4, VCAM-1, E-selectin, matrix metalloproteinases 2 e 9, and higher adhesion to THP-1 monocytoid cells. These events were inhibited by pre-treatment of rats with small interference RNA designed to silence FAK expression. In general these findings indicate that FAK is critical do stretch-induced expression of pro-atherogenic molecules in vascular cells in vitro and in vivo / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Consonni_SilvioRoberto_D.pdf: 7954683 bytes, checksum: 766ce32e5bbb5a5c0b8cc78fd2735dc0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Há um crescente avanço no desenvolvimento das tecnologias que permitam a localização de proteínas em células por microscopias de luz e eletrônica combinadas, com o uso das sondas moleculares miniSOG e Apex2, por exemplo. Adicionalmente busca-se compreender como proteínas são responsáveis pelas funções celulares e teciduais. A Quinase de Adesão Focal (FAK), proteína da cascata de sinalização das integrinas é considerada uma mediadora em potencial do estresse mecânico nos cardiomiócitos. Sabe-se que em cardiomiócitos submetidos a estímulos hipertróficos, ocorre rápida ativação da FAK e sua redistribuição subcelular, contudo são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos nesses processos. Outra proteína de grande importância no coração é a Calsarcina-1 (CS1), regulador negativo da via de Calcineurina, crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Entretanto os mecanismos envolvidos nessa regulação negativa, assim como a distribuição subcelular de CS1 são pouco conhecidos. Visando à interação entre essas áreas para estudo da distribuição espaço-temporal dos componentes celulares e de proteínas, bem como a importância da FAK e CS1 no sarcômero e seu papel na sinalização hipertrófica sob estímulo mecânico, o objetivo geral desse trabalho foi explorar a capacidade das proteínas FAK e CS1 para incorporar geneticamente sondas moleculares que permitissem monitorar por meio de imagens o comportamento dessas moléculas-chave na biologia do disco Z em MVRNs submetida ao estiramento mecânico. Para isso, foram realizados ensaios de localização subcelular com uso de sondas moleculares aplicadas à microscopia correlativa, bem como ensaios bioquímicos, moleculares e de atividade enzimática. Os dados confirmaram a FAK associada às fibras de actina e adesões focais em células H9c2 e foi demonstrado à microscopia de luz que FAK wild-type (wt) translocou-se parcialmente para o compartimento nuclear após estimulação do agonista fenilefrina, enquanto que FAK Y397F (forma mutante inativa) não apresentou mesmo fenótipo. Por outro lado, apesar da padronização e expressão das construções com FAK e miniSOG ou Apex2 em células HEK 293T e H9c2, não foi conclusiva a localização subcelular da FAK, por meio do uso de microscopia eletrônica em MVRN. Provavelmente devido à distribuição difusa da maior parte das moléculas de FAK, não foi identificada uma região elétron-densa conclusiva à microscopia eletrônica de transmissão. No tocante à importância da CS1, observou-se que o estiramento cíclico não induziu o aumento na expressão proteica ou gênica relativa de CS1 e CnA, assim como não houve alteração na atividade fosfatase de CnA. No entanto houve redução da interação de CS1 e CnA, bem como alteração na localização de CS1 em MVRN sob estímulo mecânico. Dados de superexpressão e silenciamento de CS1 corroboram a regulação negativa de CS1 à CnA em MVRN sob estímulo mecânico. Baseando-se em dados estruturais, especulou-se que como o sítio de ligação de NFAT e CS1 à CnA são muito próximos e ao mesmo tempo distante do sítio ativo da fosfatase, é possível que o papel de CS1 na regulação negativa de CnA ocorra por impedimento espacial ao fator de transcrição NFAT. Portanto, esses resultados podem contribuir para uma possível inferência farmacológica, visto que a via de Calcineurina-NFAT é uma das principais mediadoras de hipertrofia em cardiomiócitos, mediante estímulos patológicos / Abstract: There is an increasing move towards the development of technologies that allow the localization of proteins in cells by combined electron and light microscopy, with the use of molecular probes such as miniSOG and APEX2. Additionally we seek to understand how proteins are responsible for the cellular and tissue functions. The Focal Adhesion Kinase (FAK) is protein of integrin signaling cascade considered as a potential mediator of mechanical stress in cardiomyocytes. It is known that in cardiomyocytes subjected to hypertrophic stimuli by rapid activation of FAK and its subcellular redistribution, however the mechanisms involved in these processes are poorly understood. Another very important protein in the heart is Calsarcin-1 (CS1), a negative regulator of the Calcineurin pathway which is crucial in the development of cardiac hypertrophy. However the mechanisms involved in the negative regulation as well as the subcellular distribution CS1 are poorly understood. Aiming at the interaction between these areas to study the spatial-temporal distribution of cellular and protein components, and the importance of FAK and CS1 in the sarcomere and its role in hypertrophic signaling under mechanical stimulation, the aim of this study was to explore the ability of FAK and CS1 to incorporate genetically molecular probes that allow monitoring through images the behavior of these key molecules in the Z disc biology in MVRNs subjected to mechanical stretch. To this end, we performed subcellular localization assays using molecular probes applied to the correlative microscopy, biochemical and molecular assays and enzymatic activity. These data confirm the FAK associated with actin and focal adhesions fibers in H9c2 cells and has been shown by light microscopy that FAK wild-type (wt) is partially translocated to the nuclear compartment after stimulation of the agonist phenylephrine, while FAK Y397F (inactive mutant form) did not show the same phenotype. Moreover, despite standardization and expression of FAK and miniSOG or APEX2 in HEK 293T cells and H9c2, it was inconclusive subcellular localization of FAK, through the use of electron microscopy, in MVRN. Probably due to the diffuse distribution of most FAK molecules, it has no conclusive electron-dense region in transmission electron microscopy. Regarding the importance of CS1, it was observed that the cyclic stretch did not induce an increase in protein expression or gene relative CS1 and CnA, as there was no change in the phosphatase activity of CnA. However there was less interaction CS1 and CnA and change in CS1 location in MVRN under mechanical stimulation. CS1 overexpression and silencing corroborate the negative regulation of the CS1 over CnA in MVRN under mechanical stimulation. Based on structural data, it has been speculated that as the NFAT and CS1 binding sites are very close in CnA and at the same time distant from the active site of the phosphatase, it is possible that the role of CS1 in the negative regulation of CnA occur by steric hindrance to the NFAT transcription factor. Therefore, these results may contribute to a possible pharmacological inference, whereas Calcineurin-NFAT pathway is a major mediator of hypertrophy in cardiac myocytes by pathologic stimuli / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Dentre os vários tipos de leucemia, destaca-se a Leucemia Mielóide Crônica (LMC), um distúrbio mieloproliferativo em que ocorre a translocação entre o gene BCR no cromossomo 22 e o gene ABL1 no cromossomo 9. Essa translocação cria um cromossomo conhecido como Philadelphia (t 9,22)(q34;q11), ou Ph+, e a consequente formação de um produto único de proteínas BCR-ABL1. Essa proteína tem atividade de quinase constitutiva e impulsiona a proliferação descontrolada de células tronco hematopoiéticas. O surgimento de uma nova classe farmacológica no início dos anos 2000 - os inibidores de tirosina quinases, revolucionou o tratamento e o prognóstico da LMC, permitindo que esse câncer fosse tratado praticamente como uma doença crônica, com farmacoterapia oral. A droga de estréia dessa classe, o Mesilato de Imatinib, foi desenvolvida através de modelagem molecular para ser alvo-específica, mas apesar do desenvolvimento exitoso, após o início da comercialização, foram observadas falhas na ação em determinados pacientes. Há evidências de que a avaliação da relação entre a dose de imatinibe (e seus níveis sanguíneos) e a eficácia do tratamento medida através das respostas Hematológica, Citogenética e Molecular, seja uma forma de realizar o ajuste da dose reduzindo efeitos colaterais e custo do tratamento. No presente estudo foram avaliadas as concentrações séricas de imatinib, Cmin e Cmax, em 51 pacientes com Leucemia Mielóide Crônica, dos quais 33 atingiram Resposta Molecular Maior em até 12 meses de tratamento, 11 levaram mais que 12 meses para antingir, e 7 não atingiram. As concentrações séricas obtidas desses pacientes indicaram que no grupo que atingiu RMM em até 12 meses, os valores de vale (Cmin) se apresentaram com mediana de 889.2 ng/mL (721.9 e 1202.4 para primeiro e terceiro quartis respectivamente), sendo que o grupo que levou mais de 12 meses para atingir RMM, a concentração mediana observada foi de 611.0 ng/mL (493.0 e 816.0 para primeiro e terceiro quartis respectivamente), sendo essa diferença estatisticamente significativa (p < 0.05). Dessa forma demonstrou-se a importância do monitoramento das concentrações séricas de imatinib para o ajuste da dose e para a gestão do tratamento na mudança para segunda geração de inibidores de tirosina quinase. Através da análise comparativa dos dados populacionais estudados, observou-se não haver correlação significativa entre as concentrações séricas e índice de massa corpórea (IMC), peso, idade ou sexo / Among the various types of leukemia, Chronic Myeloid Leukemia (CML) stands out as a myeloproliferative disorder in which translocation occurs between the BCR gene on chromosome 22 and the ABL1 gene on chromosome 9. This translocation creates a chromosome known as Philadelphia (t 9,22) (q34; q11), or Ph +, and the consequent formation of a unique BCR-ABL1 protein product. This protein has constitutive kinase activity and drives the uncontrolled proliferation of hematopoietic stem cells. The launch of a new pharmacological class in the early 2000s - the tyrosine kinases inhibitors, revolutionized the treatment and prognosis of CML, allowing that cancer to be treated virtually as a chronic disease with oral pharmacotherapy. The newbie drug of this class, Imatinib Mesylate, was developed through molecular modeling to be target-specific, but despite the successful development, after the beginning of marketing, certain patients presented some failures in the response. There is an evidence that an assessment of the relationship between a dose of Imatinib (and its blood levels) and the efficacy of treatment from its Hematologic, Cytogenetic and Molecular Responses, is a really effective way to perform dose adjustment reducing side effects and cost of treatment. In the present study, the serum concentrations of Imatinib, Cmin and Cmax were evaluated in 51 patients with chronic myeloid leukemia, of which 33 reached major molecular response in up to 12 months of treatment, 10 took more than 12 months to achieve it, and 7 did not reach that. The serum concentrations obtained from those patients indicated that in the group that reached Major Molecular Response (MMR) within 12 months, the trough level (Cmin) presented a median of 889.2 ng / mL (721.9 and 1202.4 for first and third quartiles, respectively), and the group which took more than 12 months to reach MMR, the median concentration observed was 611.0 ng / mL (493.0 and 816.0 for the first and third quartiles respectively), and this difference was statistically significant (p < 0.05). Thus, the importance of monitoring serum imatinib concentrations for dose adjustment and treatment management in switching to second-generation tyrosine kinase inhibitors has been demonstrated. Through the comparative analysis of the population data, there was no significant correlation between serum concentrations and body mass index (BMI), weight, age or gender

Dentre os vários tipos de leucemia, destaca-se a Leucemia Mielóide Crônica (LMC), um distúrbio mieloproliferativo em que ocorre a translocação entre o gene BCR no cromossomo 22 e o gene ABL1 no cromossomo 9. Essa translocação cria um cromossomo conhecido como Philadelphia (t 9,22)(q34;q11), ou Ph+, e a consequente formação de um produto único de proteínas BCR-ABL1. Essa proteína tem atividade de quinase constitutiva e impulsiona a proliferação descontrolada de células tronco hematopoiéticas. O surgimento de uma nova classe farmacológica no início dos anos 2000 - os inibidores de tirosina quinases, revolucionou o tratamento e o prognóstico da LMC, permitindo que esse câncer fosse tratado praticamente como uma doença crônica, com farmacoterapia oral. A droga de estréia dessa classe, o Mesilato de Imatinib, foi desenvolvida através de modelagem molecular para ser alvo-específica, mas apesar do desenvolvimento exitoso, após o início da comercialização, foram observadas falhas na ação em determinados pacientes. Há evidências de que a avaliação da relação entre a dose de imatinibe (e seus níveis sanguíneos) e a eficácia do tratamento medida através das respostas Hematológica, Citogenética e Molecular, seja uma forma de realizar o ajuste da dose reduzindo efeitos colaterais e custo do tratamento. No presente estudo foram avaliadas as concentrações séricas de imatinib, Cmin e Cmax, em 51 pacientes com Leucemia Mielóide Crônica, dos quais 33 atingiram Resposta Molecular Maior em até 12 meses de tratamento, 11 levaram mais que 12 meses para antingir, e 7 não atingiram. As concentrações séricas obtidas desses pacientes indicaram que no grupo que atingiu RMM em até 12 meses, os valores de vale (Cmin) se apresentaram com mediana de 889.2 ng/mL (721.9 e 1202.4 para primeiro e terceiro quartis respectivamente), sendo que o grupo que levou mais de 12 meses para atingir RMM, a concentração mediana observada foi de 611.0 ng/mL (493.0 e 816.0 para primeiro e terceiro quartis respectivamente), sendo essa diferença estatisticamente significativa (p < 0.05). Dessa forma demonstrou-se a importância do monitoramento das concentrações séricas de imatinib para o ajuste da dose e para a gestão do tratamento na mudança para segunda geração de inibidores de tirosina quinase. Através da análise comparativa dos dados populacionais estudados, observou-se não haver correlação significativa entre as concentrações séricas e índice de massa corpórea (IMC), peso, idade ou sexo / Among the various types of leukemia, Chronic Myeloid Leukemia (CML) stands out as a myeloproliferative disorder in which translocation occurs between the BCR gene on chromosome 22 and the ABL1 gene on chromosome 9. This translocation creates a chromosome known as Philadelphia (t 9,22) (q34; q11), or Ph +, and the consequent formation of a unique BCR-ABL1 protein product. This protein has constitutive kinase activity and drives the uncontrolled proliferation of hematopoietic stem cells. The launch of a new pharmacological class in the early 2000s - the tyrosine kinases inhibitors, revolutionized the treatment and prognosis of CML, allowing that cancer to be treated virtually as a chronic disease with oral pharmacotherapy. The newbie drug of this class, Imatinib Mesylate, was developed through molecular modeling to be target-specific, but despite the successful development, after the beginning of marketing, certain patients presented some failures in the response. There is an evidence that an assessment of the relationship between a dose of Imatinib (and its blood levels) and the efficacy of treatment from its Hematologic, Cytogenetic and Molecular Responses, is a really effective way to perform dose adjustment reducing side effects and cost of treatment. In the present study, the serum concentrations of Imatinib, Cmin and Cmax were evaluated in 51 patients with chronic myeloid leukemia, of which 33 reached major molecular response in up to 12 months of treatment, 10 took more than 12 months to achieve it, and 7 did not reach that. The serum concentrations obtained from those patients indicated that in the group that reached Major Molecular Response (MMR) within 12 months, the trough level (Cmin) presented a median of 889.2 ng / mL (721.9 and 1202.4 for first and third quartiles, respectively), and the group which took more than 12 months to reach MMR, the median concentration observed was 611.0 ng / mL (493.0 and 816.0 for the first and third quartiles respectively), and this difference was statistically significant (p < 0.05). Thus, the importance of monitoring serum imatinib concentrations for dose adjustment and treatment management in switching to second-generation tyrosine kinase inhibitors has been demonstrated. Through the comparative analysis of the population data, there was no significant correlation between serum concentrations and body mass index (BMI), weight, age or gender

Orientador: William Dias Belangero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T23:43:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_LidiaDornelasde_M.pdf: 3066212 bytes, checksum: 6cb5506682740e2fcb2de4b1694998a3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico. Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase) induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo. O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt (akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo bioquímico induzindo a osteogênese. Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a 0,12mJ/mm²na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência, os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de 7, 14 e 21 dias A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após 7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle / Abstract: Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in vascularization which activate proteins such as BMP and Erk inducing osteogenic differentiation after its use in the bone tissue. The present study aimed at evaluating the levels of Erk and AKT proteins involved in the protein cascade responsive to cell deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis. The animals selected for the study were under anesthesia and divided in two different groups where on day 1 the first group was submitted to ESWT in one 500 pulse-session generated by an electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each segment times of 7, 14 and 21 days. Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept elevated until the 21st day when compared to the control group / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestra em Ciências

A leucemia mielóide crônica (LMC) é caracterizada pela translocação (9;22) que dá origem ao gene quimérico BCR-ABL. Este gene codifica uma proteína com atividade tirosina quinase, p210, constitutivamente ativa. O três mecanismos envolvidos na patogênese da LMC são o aumento da proliferação celular, alteração da adesão celular ao estroma e matriz medular e inibição da apoptose. A introdução do mesilato de imatinibe (MI), um inibidor de tirosina quinase, revolucionou o tratamento da LMC levando pacientes em fase crônica a remissões duráveis, porém uma parcela destes não responde ou perde a resposta ao longo do tratamento. Os mecanismos de resistência ao MI podem ser classificados como independentes de BCR-ABL (a1- glicoproteína ácida e genes de resistência a múltiplas drogas) ou dependentes de BCR-ABL (superexpressão de BCR-ABL e mutações do domínio quinase do gene ABL). Objetivo: avaliar a presença de mutações no domínio quinase do gene ABL e a expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas MDR1 e BCRP em amostras pré-tratamento com MI, acompanhar estes pacientes mensalmente através da quantificação de transcritos BCR-ABL e quando ocorrer resistência reavaliar a presença de mutações do domínio quinase do ABL e a expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas. Material e Métodos: Foram avaliados 61 pacientes com LMC em fase crônica. A pesquisa de mutações do domínio quinase foi realizada pela técnica de seqüenciamento direto e a expressão relativa dos genes de resistência a múltiplas drogas foi avaliada por PCR em tempo real. A quantificação absoluta do número de transcritos BCR-ABL foi realizada pela técnica de PCR em tempo real utilizando-se o sistema Taqman de sondas de hibridização. Resultados: Nas amostras pré-tratamento dos 61 pacientes estudados não foram detectadas mutações. Quando relacionamos o aumento da expressão dos genes MDR1 e BCRP à resposta citogenética completa aos 12 meses de tratamento não houve diferença estatística significativa (p>0,05). Quanto ao número de transcritos BCR-ABL, observamos que os pacientes que apresentaram menos de 1% pela escala internacional aos 3 meses de tratamento atingiram a RMM em período menor (7 meses) do que os que apresentaram mais de 1% (12 meses) com diferença estatística significativa (p = 0,03). Conclusões: As mutações do domínio quinase do gene BCR-ABL nas amostras pré-tratamento não foram detectadas ou pela sensibilidade da técnica de seqüenciamento direto (10%) ou porque tais mutações são mais freqüentes nas fases acelerada e blástica. A expressão dos genes de resistência a múltiplas drogas (MDR1) e BCRP) em pacientes com LMC-FC ao diagnóstico não apresentou correlação com o aparecimento de resistência secundária ao MI. Além disso a quantificação mensal dos transcritos BCR-ABL aos 3 meses pode ser considerada um marcador com valor prognóstico. / Chronic myeloid leukemia is characterized by t(9;22) translocation. The chimeric gene BCR-ABL encodes a p210BCRABL protein with constitutive tyrosine kinase activity which is directly related to CML pathogenesis. The imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, is the first-choice treatment for patients in chronic phase but some patients show primary resistance or relapse after initial response. The mechanisms of resistance to the imatinib mesylate treatment are BCR-ABL dependent (amplification of BCR-ABL and mutation of kinase domain of BCR-ABL) or independent of BCR-ABL (1-acid glycoprotein and expression of multidrug resistance genes). Objective: The objective of this work was to evaluate the mechanisms of resistance (kinase domain mutation and MDR1 and BCRP genes expression) to imatinib mesylate in pretreatment samples, quantify of BCR-ABL transcript on a monthly follow up plan, and to re-evaluate the mechanisms of resistance in the absence or loss of treatment response. Patients and Methods: We have evaluated 61 pretreatment samples derived from chronic phase CML patients. The number of BCR-ABL transcripts was quantified by RTQ-PCR with taqman probes and MDR1 and BCRP expression were evaluated by RTQ-PCR with Syber Green. Mutations within the BCR-ABL kinase domain were screened by direct sequencing and we also have screened the T315I mutation in pretreatment samples by allele-specific PCR. Results:We detected no mutations in the 61 pretreatment samples. The correlation analysis between the expression of MDR1/BCRP genes and the cytogenetic response at 12 months of treatment revealed no significant statistical difference (p = > 0.05). The results of BCR-ABL quantification in the follow up of our cohort indicated that patients who had transcripts <1% by the international scale at 3 months of therapy are more likely to achieve rapid MMR (median of 7 months) than those who had >1% (median of 12 months) (p = 0,03). Conclusions: As expected, the kinase domain mutations of BCR-ABL in pretreatment samples of CML chronic phase patients are not detectable by direct sequencing because of the sensitivity of the assay (10%) and also because these mutations are more common in accelerated phase and blast crisis. About the expression of multidrug resistance genes MDR1 and BCRP, they showed no correlation with secondary resistance to imatinib mesylate. And finally the number of BCR-ABL transcripts at 3 months of treatment can be considered a marker with prognostic value.