A la suite d'une lésion nerveuse périphérique, de multiples altérations cellulaires et moléculaires participent à la régénération physiologique du nerf, mais induisent dans certains cas le développement d'une cicatrisation dysfonctionnelle et l'apparition d'une douleur neuropathique chronique. La régulation de la perméabilité vasculaire endoneurale du nerf lésé joue un rôle essentiel dans ces phénomènes de cicatrisation nerveuse, via notamment l'infiltration locale d'immunocytes. L'objectif de ce travail était d'étudier le rôle spécifique de l'altération de la barrière hémato-nerveuse (BHN) au niveau du site lésé dans le développement des douleurs neuropathiques périphériques post-traumatiques. Nous avons montré à l'aide de modèles de constriction chronique du nerf sciatique et/ou infra-orbitaire que la disruption précoce de la BHN est un évènement clé de la neuropathie, favorisant l'infiltration locale de substances algogènes et d'immunocytes induisant une neuroinflammation, une sensibilisation périphérique et la neuropathie. L'altération des voies de signalisation Sonic Hedgehog, Wnt/?-caténine et TLR4 au niveau des cellules endothéliales endoneurales, favorise cette disruption en diminuant la synthèse des protéines de jonctions serrées, molécules clés de l'intégrité de la BHN. De plus, l'implication différentielle de ces voies dans des modèles de neurite et de neuropathie apporte un éclairage nouveau à la transition phénotypique entre neurite et neuropathie : alors que la neurite s'accompagne d'une perméabilité vasculaire endoneurale réversible, la neuropathie pourrait être considérée comme une pathologie de la perméabilité vasculaire chronique irréversible. / Following peripheral nerve injury, multiple cellular and molecular alterations occur within the nerve’s parenchyma, participating in physiological healing of the nerve, but can also lead to the development of dysfunctional nerve healing, translating as chronic neuropathic pain. The regulation of endoneurial microvascular permeability within the injured nerve plays a pivotal rôle in physiological and pathological nerve healing, notably via the local infiltration of pro-regenerative immunocytes. The main goal of this work was to study the specific role of local blood-nerve barrier disruption in the development of painful post-traumatic peripheral neuropathy. In sciatic nerve and/or infra-orbital nerve chronic constriction injury models, we showed that early disruption of the blood-nerve barrier is a key event in the development of neuropathy, allowing local infiltration of algogenic substances and immunocytes within the nerve’s parenchyma, responsible for local neuroinflammation, peripheral sensitization and peripheral neuropathic pain development. Among the homeostatic regulatory mecanisms of this barrier, the alteration of Sonic Hedgehog, Wnt/β-catenin and TLR4 signaling pathways in endoneurial endothelial cells, mediates the disruption of the blood-nerve barrier by downregulating key tight-junction proteins. Furthermore, the differential implication of these signaling pathways in models of neuritis and neuropathy shed light on the phenotypical transition between neuritis and neuropathy : As neuritis is associated with reversible endoneurial vascular permeability, neuropathy could be considered a disease of irreversible chronic vascular permeability.

Toll-like receptors (TLRs) are important receptor family of innate immunity. They enable fast recognition of infection through so called pathogen associated molecular patterns (PAMPs). In this thesis, we studied interaction of mouse polyomavirus (MPyV) with TLRs of mouse embryonic fibroblasts (MEF cells). We observed that inhibition of TLR4 signaling abolished response of MEF cells to MPyV. This suggested that TLR4 plays a role in MEF cells recognition of MPyV. To detect response of MEF cell to MPyV, we measured IL-6 production by ELISA. Next, we investigated effect of TLR4 signalization on MPyV infection. Inhibition of TLR4 signaling with CLI-095 inhibitor did not affect number of infected cells. Presence of TLR4 antagonist, LPS-RS, led to significant decrease in quantity of infected cells 20 hours post infection. Decrease in number of infected cells was also observed in presence of LPS. Viral infection was also inhibited by TLR9 antagonist ODN 2088. We also investigated role of MAP kinases in MPyV infection. We tested, whether inhibition of selected MAP kinases would affect number of infected cells. Inhibition of kinase p38 did not affect infection. On the other hand, inhibition of MEK kinase or JNK resulted in decrease of number of cells infected by MPyV.

My thesis introduces the topic of nociceptive signalisation and processes involved in the formation and spreading of neuropathic pain. This study focuses on the mechanisms of nociceptive synaptic transmission mechanisms in the level of spinal dorsal horn and its modulation by paclitaxel, a chemotherapeutic drug inducing neuropathic changes. The attention is put especially on the possibility of glial activity participation in paclitaxel side effects. This idea stems from the existing hypothesis of the functional connection between TLR4 and TRPV1 receptor activity. TRPV1 is well known for its participation in chemical, thermal and nociceptive sensory transmission. Minocycline antibiotic is considered as an inhibitor of microglial activation therefore it was used for blocking neuroinflammation. The experimental part is comparing an impact of substances applied to the model of tachyphylaxis used for monitoring of nociceptive transmission changes according to decreasing activity of TRPV1 receptors. Electrophysiological recording of miniature excitatory postsynaptic currents from neurons in the Rexed laminae I. and II. of spinal dorsal horn was used. The results of my measurements show that minocycline is able to suppress acute effects of paclitaxel application in vitro if the spinal slice is incubated...

Adaptation of host receptor system to optimal detection of infection-related structures is one of the key evolutionary challenges of immunity in host-pathogen interactions. Toll-like receptors (TLRs) are genetically variable molecules of vertebrate innate immunity that recognise danger signals, e.g. pathogenic molecules. Examination of genetic variation in TLRs may reveal mechanisms of host immunity adaptation to pathogenic pressure at molecular level. Trans-species polymorphism (TSP) is a phenomenon which assumes that several identical alleles or allelic lineages are inherited from ascendant to descendant species and these may be subsequently maintained over a long period of time in a polymorphic state. Whereas in adaptive immune genes the concept of TSP is well understood, little is presently known about TSP in innate immune genes such as TLRs. In this thesis I describe genetic polymorphism in functionally-relevant regions of TLR4 and TLR5 in 192 individuals representing 20 species Paridae family (tits, chickadees and titmice). These two receptors bind mainly bacterial ligands (TLR4 detects lipopolysaccharide and TLR5 detects flagellin), being among the first ones to trigger immune response to bacterial pathogens. To differentiate presumed TSP from gene flow among species, intron sequences of six...

Pain is a common symptom of many clinical syndromes and diseases. In particular, the treatment of neuropathic pain represents a serious public health issue because currently available analgesia is ineffective in many cases or it has adverse effects. Treatment of pain-related suffering requires knowledge of how pain signals are initially generated and subsequently transmitted by the nervous system. A nociceptive system plays a key role in this process of encoding and transmission of pain signals. Modulation of the nociceptive synaptic transmission in the spinal cord dorsal horn represents an important mechanism in the development and maintenance of different pathological pain states. This doctoral thesis has aimed to investigate and clarify some of the mechanisms involved in the modulation of the spinal nociceptive processing in different pain states. The main attention was paid to study the following issues: (I.) Which is the role of Transient Receptor Potential Vanilloid type 1 channels (TRPV1), Toll-Like Receptors 4 (TLR4), and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in the development of neuropathic pain induced by paclitaxel (PAC) chemotherapy in acute in vitro, and subchronic in vivo murine model of PAC-induced peripheral neuropathy (PIPN)? (II.) How is affected spinal inhibitory synaptic control...

[ES] El alcohol es una de las drogas más aceptadas y consumidas a nivel mundial, y su ingesta crónica causa alteraciones en el sistema nervioso central, desde desmielinización hasta muerte neural. Se ha demostrado que gran parte de estos efectos estarían mediados por la activación del sistema inmune innato, principalmente a través del receptor TLR4, que desemboca en un estado inflamatorio. Para ahondar en estos mecanismos, en esta tesis se pretende analizar si el consumo crónico de etanol puede causar modificaciones en los miARNs de la corteza cerebral, regulando la expresión de genes proinflamatorios asociados a la ruta de señalización del TLR4 y si el uso de la curcumina como terapia es capaz de disminuir estos efectos. Además, analizaremos si el consumo de alcohol a largo plazo es capaz de alterar la microbiota intestinal, y la implicación del TLR4 en estos procesos. Nuestros resultados demuestran que el etanol es capaz de alterar la expresión de diferentes microARNs que regulan la expresión de genes proinflamatorios y asociados a la vía del TLR4. La ausencia del receptor causa un perfil de expresión distinto tanto en los controles como en los animales alcohólicos crónicos. Puesto que en los últimos años nos hemos interesado en la búsqueda de una posible terapia para paliar la neuroinflamación producida por el etanol, hemos usado el BDMC, un curcuminoide con capacidad antiinflamatoria y antioxidante, para revertir los daños causados por el abuso del alcohol. Para su administración proponemos su conjugación con un polipéptido que elimina los tradicionales problemas asociados al uso de estos compuestos naturales como son su vida media corta y su baja biodisponibilidad, sin que hayamos registrado toxicidad. El uso de este polímero en animales con un consumo crónico de etanol produce una disminución de la inflamación, tanto a nivel proteico como de expresión génica. Considerando que otra de las regiones del organismo más afectadas por el alcohol es el tracto gastrointestinal, y que la población bacteriana puede ser modificada en determinadas enfermedades o por el uso de sustancias nocivas, produciendo una disbiosis, hemos comparado el efecto del alcohol sobre la población bacteriana y la participación del receptor TLR4 en estos efectos. Mediante análisis de expresión génica, confirmamos que el tejido intestinal ausente del receptor TLR4 es menos susceptible de sufrir cambios debidos al consumo de alcohol. Sin embargo, no hemos encontrado en estos animales la expresión aumentada de genes proinflamatorios característica de los tratamientos alcohólicos. Además, los ratones carentes de este receptor presentan una microbiota intestinal única y diferente a la encontrada en animales de genotipo normal, con sus propios cambios en el equilibrio bacteriano en respuesta a la ingesta de alcohol. Esta microbiota presenta menor cantidad de especies Gram - y mayor resistencia al desequilibrio ocasionado por el alcohol, que su contraparte en los ratones WT. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel del TLR4 en las alteraciones causadas por el consumo crónico de alcohol. Mostramos como cambios causados por el etanol a niveles tan distintos como la regulación mediante miARNs o la microbiota intestinal dependen en gran medida de la respuesta inicial que causa el alcohol en el TLR4. Dado que es un receptor necesario para el correcto funcionamiento de muchos órganos, planteamos un posible tratamiento mediante la inhibición de esta cascada inflamatoria. / [CA] L'alcohol és una de les drogues més acceptades i consumides a nivell mundial, i la seva ingesta crònica causa alteracions al sistema nerviós central, des de desmielinització fins a mort neural. S'ha demostrat que gran part d'aquests efectes estarien intervinguts per l'activació del sistema immune innat, principalment a través del receptor TLR4, que desemboca en un estat inflamatori. Per aprofundir en aquests mecanismes, en aquesta tesi es pretén analitzar si el consum crònic d'etanol pot causar modificacions als miARNs de l'escorça cerebral, regulant l'expressió de gens proinflamatoris associats a la ruta de senyalització del TLR4 i si l'ús de la curcumina com a teràpia és capaç de disminuir aquests efectes. A més, analitzarem si el consum d'alcohol a llarg termini és capaç d'alterar la microbiota intestinal i la implicació del TLR4 en aquests processos. Els nostres resultats demostren que l'etanol pot alterar l'expressió de diferents microARNs que regulen l'expressió de gens proinflamatoris i associats a la via del TLR4. L'absència del receptor causa un perfil d'expressió diferent tant als controls com als animals alcohòlics crònics. Com que els darrers anys ens hem interessat en trobar una possible teràpia per pal·liar la neuroinflamació produïda per l'etanol, hem utilizat el BDMC, un curcuminoide amb capacitat antiinflamatòria i antioxidant, per revertir els danys causats per l'abús de l'alcohol. Per a la seva administració proposem la seva conjugació amb un polipèptid que elimina els problemes tradicionals associats a l'ús d'aquests compostos naturals com són la seva vida mitjana curta i la seva baixa biodisponibilitat, sense que haguem registrat toxicitat. L¿ús d¿aquest polímer en animals amb un consum crònic d¿etanol produeix una disminució de la inflamació, tant a nivell proteic com d¿expressió gènica. Considerant que una altra de les regions de l'organisme més afectades per l'alcohol és el tracte gastrointestinal, i que la població bacteriana pot ser modificada en determinades malalties o per l'ús de substàncies nocives, produint una disbiosi, hem comparat l'efecte de l'alcohol sobre la població bacteriana i la participació del receptor TLR4 en aquests efectes. Mitjançant una anàlisi d'expressió gènica, confirmem que el teixit intestinal absent del receptor TLR4 és menys susceptible de patir canvis deguts al consum d'alcohol. Tot i això, no hem trobat en aquests animals l'expressió augmentada de gens proinflamatoris característica dels tractaments alcohòlics. A més, els ratolins sense aquest receptor presenten una microbiota intestinal única i diferent de la trobada en animals de genotip normal, amb els seus propis canvis en l'equilibri bacterià en resposta a la ingesta d'alcohol. Aquesta microbiota presenta menor quantitat d'espècies Gram - i més resistència al desequilibri ocasionat per l'alcohol, que la contrapart en els ratolins WT. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper del TLR4 a les alteracions causades pel consum crònic d'alcohol. Mostrem com a canvis causats per l'etanol a nivells tan diferents com la regulació mitjançant miARNs o la microbiota intestinal depenen en gran mesura de la resposta inicial que causa l'alcohol al TLR4. Atès que és un receptor necessari per al funcionament correcte de molts òrgans, plantegem un possible tractament mitjançant la inhibició d'aquesta cascada inflamatòria. / [EN] Alcohol is one of the most accepted and consumed drugs worldwide, and its chronic consumption causes alterations in the central nervous system, such as demyelination and neural death. It has been shown that these effects would be mediated by the activation of the innate immune system, mainly through the TLR4 receptor, which leads to an inflammatory response. To inquire into these mechanisms, this thesis aims to analyse whether chronic ethanol consumption can cause changes in miRNAs in the cerebral cortex, regulating the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 signalling pathway, and whether the use of curcumin as a therapy it is able to reduce these effects. In addition, we will analyse if long-term alcohol consumption can alter the intestinal microbiota, and the involvement of TLR4 in these processes. Our results show that ethanol can alter the expression of different microRNAs that regulate the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 pathway. The absence of this receptor causes a different expression profile in both controls and chronic alcoholic animals. Taking into account our interest in seeking a possible therapy to alleviate the neuroinflammation caused by ethanol, we have used BDMC, a curcuminoid with anti-inflammatory and antioxidant activity, to ameliorate the damage caused by alcohol abuse. For its administration, we propose its conjugation with a polypeptide that eliminates the traditional problems associated with the use of these natural compounds, such as their short half-life and low bioavailability, with no toxicity recorded. The use of this polymer in animals with chronic ethanol consumption produces a decrease in inflammation, at both protein level and gene expression. Considering that another of the regions of the body most affected by alcohol is the gastrointestinal tract, and that bacterial population can be modified in certain diseases or due to harmful substances, producing dysbiosis, we have compared the effect of alcohol on the bacterial population and the participation of the TLR4 receptor in these effects. Using gene expression analysis, we confirm that intestinal tissue without TLR4 receptor show less changes induced by the alcohol consumption. However, we have not found in these animals an increased expression of proinflammatory genes which are observed in alcoholic treatments. In addition, mice lacking this receptor have a unique intestinal microbiota, which is different from the normal genotype animals, with their own changes in bacterial balance in response to alcohol intake. This microbiota has less Gram - species and greater resistance to imbalance caused by alcohol than its counterpart in WT mice. In general, the results of this thesis highlight the role of TLR4 in the alterations caused by chronic alcohol consumption. We show that ethanol can cause changes at different levels, such as regulation of miRNAs or intestinal microbiota, which largely depend on the TLR4 activation induced by ethanol. Therefore, herein we demonstrate the importance of the TLR4 to the correct activity of several body organs, and we propose a possible treatment by inhibiting its inflammatory cascade. / Cuesta Díaz, CM. (2022). Papel de los receptores TLR4 y de la microbiota intestinal en los procesos inflamatorios y neuroinflamatorios causados por el consumo crónico de alcohol, y posibles terapias con curcuminoides [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183832

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens. / Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and impaired insulin secretion from the pancreatic β-cell. Endoplasmic reticulum (ER) stress and innate immunity have both been reported to alter pancreatic β-cell function. However, it is not clear whether these factors can affect the transcription of the insulin gene. The aim of this thesis was to assess the role of ER stress and innate immunity in the regulation of the insulin gene. Pancreatic β-cells have a well-developed endoplasmic reticulum (ER) due to their highly specialized secretory function to produce insulin in response to glucose and nutrients. In a first study, using several approaches we showed that ATF6 (activating transcription factor 6), a protein implicated in the ER stress response, directly binds to the A5/Core of the insulin gene promoter in isolated rat islets. We also showed that overexpression of the active (cleaved) fragment of ATF6α, but not ATF6β, inhibits the activity of an insulin promoter-reporter construct. However, the inhibitory effect of ATF6α was insensitive to mutational inactivation or deletion of the A5/Core. Therefore, although ATF6 binds directly to the A5/Core of the rat insulin II gene promoter, this direct binding does not appear to contribute to its repressive activity. In recent years, the gut microbiota was proposed has an environmental factor increasing the risk of type 2 diabetes. Subjects with diabetes have higher circulating levels of lipopolysaccharides (LPS) than non-diabetic patients. Recent observations suggest that the signalling cascade activated by LPS binding to Toll-Like Receptor 4 (TLR4) exerts deleterious effects on pancreatic β-cell function; however, the molecular mechanisms of these effects are incompletely understood. We showed that exposure of isolated human, rat and mouse islets of Langerhans to LPS dose-dependently reduced insulin gene expression. This was associated in mouse and rat islets with decreased mRNA expression of two key transcription factors of the insulin gene, PDX-1 (pancreatic duodenal homeobox 1) and MafA (mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). LPS repression of insulin, PDX-1 and MafA expression was not observed in islets from TLR4-deficient mice and was completely prevented in rat islets by inhibition of the NF-kB signalling pathway. These results demonstrate that LPS inhibits β-cell gene expression in a TLR4-dependent manner and via NF-kB signaling in pancreatic islets, suggesting a novel mechanism by which the gut microbiota might affect pancreatic β-cell function. Our findings provide a better understanding of the molecular mechanisms underlying insulin gene repression in type 2 diabetes, and suggest potential therapeutic targets that might prevent or delay the decline of β-cell function in the course of type 2 diabetes, which affects more than two million Canadians.

Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren. / Inflammatory bowel diseases like Crohn´s disease and ulcerative colitis are chronic, relapsing, immunologically mediated disorders with uncertain etiology. Genetic abnormalities and environmental factors may have negative influences on the physiologic barrier function of the intestinal mucosa with inflamamtion coming up after immune response which is aggravated by commensal intestinal bacteria. The infection of H. pylori can cause gastritis and ulcus disease and contribute to the occurence of MALT lymphoma and gastric cancer. Bacterial ligands in the intestine are recognized by toll-like receptors (TLR) which are one component of the innate immune system. This study observed variations of the bacterial flora in mice with ileitis, colitis or H. pylori-infection. Performing a global survey of the intestinal flora combining culture based techniques with molecular methods, it was observed, that the concentration of gram-negative rods is elevated during ileitis or colitis. The bacterial factors, which are capable of inducing ileitis, could be confirmed using gnotobiotic TLR-deficient mice with a defined bacterial recolonization. It was clearly shown that ileitis was aggravated by LPS of accumulating E. coli through a TLR4-mediated signal transduction. The inflammation was ameliorated through antibiotic treatment or after application of the LPS-scavenger polymyxin B. H. pylori infection of mice leads to an increase of bacterial diversity in the stomach and bacterial species which are normally colonize the colon were detected after infection. Vaccination against H. pylori could prevent this diversity shift. The animal models for the T. gondii-induced ileitis and DSS-colitis used in this study offering the reproducible analysis of inflammation relevant components so that new approaches of treatment like inhibition of lipopolysaccharide, blockage of TLR4 or LPS binding protein or application of probiotics could be studied under well defined conditions.

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens. / Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and impaired insulin secretion from the pancreatic β-cell. Endoplasmic reticulum (ER) stress and innate immunity have both been reported to alter pancreatic β-cell function. However, it is not clear whether these factors can affect the transcription of the insulin gene. The aim of this thesis was to assess the role of ER stress and innate immunity in the regulation of the insulin gene. Pancreatic β-cells have a well-developed endoplasmic reticulum (ER) due to their highly specialized secretory function to produce insulin in response to glucose and nutrients. In a first study, using several approaches we showed that ATF6 (activating transcription factor 6), a protein implicated in the ER stress response, directly binds to the A5/Core of the insulin gene promoter in isolated rat islets. We also showed that overexpression of the active (cleaved) fragment of ATF6α, but not ATF6β, inhibits the activity of an insulin promoter-reporter construct. However, the inhibitory effect of ATF6α was insensitive to mutational inactivation or deletion of the A5/Core. Therefore, although ATF6 binds directly to the A5/Core of the rat insulin II gene promoter, this direct binding does not appear to contribute to its repressive activity. In recent years, the gut microbiota was proposed has an environmental factor increasing the risk of type 2 diabetes. Subjects with diabetes have higher circulating levels of lipopolysaccharides (LPS) than non-diabetic patients. Recent observations suggest that the signalling cascade activated by LPS binding to Toll-Like Receptor 4 (TLR4) exerts deleterious effects on pancreatic β-cell function; however, the molecular mechanisms of these effects are incompletely understood. We showed that exposure of isolated human, rat and mouse islets of Langerhans to LPS dose-dependently reduced insulin gene expression. This was associated in mouse and rat islets with decreased mRNA expression of two key transcription factors of the insulin gene, PDX-1 (pancreatic duodenal homeobox 1) and MafA (mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). LPS repression of insulin, PDX-1 and MafA expression was not observed in islets from TLR4-deficient mice and was completely prevented in rat islets by inhibition of the NF-kB signalling pathway. These results demonstrate that LPS inhibits β-cell gene expression in a TLR4-dependent manner and via NF-kB signaling in pancreatic islets, suggesting a novel mechanism by which the gut microbiota might affect pancreatic β-cell function. Our findings provide a better understanding of the molecular mechanisms underlying insulin gene repression in type 2 diabetes, and suggest potential therapeutic targets that might prevent or delay the decline of β-cell function in the course of type 2 diabetes, which affects more than two million Canadians.

Le LPS est un puissant agent pro-inflammatoire bactérien, dont la partie lipide A est considérée comme le principe actif. Néanmoins, la chaîne O des LPS influence leur agrégation en solution aqueuse. Notre but a été de déterminer le rôle de la chaîne O sur les effets biologiques et physiopathologiques des LPS.Nos travaux, menés selon trois axes stratégiques complémentaires, ont donné lieu aux avancées suivantes :- développement d'un dosage innovant des LPS par LC-MS/MS et d'un ratio d'inactivation des LPS sur la base d'une utilisation combinée dudit dosage et du test LAL. Ce ratio traduit la capacité d'un organisme hôte à inactiver les LPS, notamment par leur transfert aux HDL par la PLTP. Ce ratio pourrait être utile dans l'évaluation des patients à haut risque.- la longueur de la chaîne O module l'inflammation induite par les LPS. Au-delà de leur concentration d'agrégation critique, les LPS forment des agrégats dotés d’une architecture et de propriétés physico-chimiques dépendant de leur chaîne O. Ces deux paramètres déterminent l'activité biologique des LPS et leur métabolisme ;- développement d'un double marquage innovant des LPS confirmant leur voie principale d'élimination : le transport inverse du LPS. Ce travail définit donc les effets physiopathologiques induits par les LPS comme résultant de deux composantes : leur activité biologique et leur métabolisme. Toute stratégie de recherche ou thérapeutique ciblant les LPS, devrait donc prendre en compte leur structure moléculaire, leur agrégabilité et la relation entre ces deux paramètres, déterminants majeurs de l'activité biologique des LPS et de leur métabolisme. / LPS is a potent bacterial pro-inflammatory agent, consisting of hydrophilic, polysaccharide part and of a lipid A which is considered like active moiety. Nevertheless, the O chain of LPS influences their aggregation in aqueous media. Therefore, our goal has been to determine the role of O chain on the LPS biological and physiopathological effects. Our work was organized according to three main axes, and led to the following findings :- development of a new LPS assay by LC-MS/MS. The combination of this new technique with LAL test allowed us to calculate an inactivation ratio which reflects the ability of host organism to inactivate LPS, especially through their transfer to HDL by PLTP. The ratio could be useful in predicting outcome of high risk patients.- the length of O chain modulates LPS-induced inflammation. Above their critical aggregation concentration, LPS form aggregates with an architecture and physiochemical properties dependent on their O chain. Both parameters determine LPS biological activity and their metabolism.- development of an innovative dual labelling of LPS as a new tool to explore LPS elimination pathway : the reverse LPS transport. This work brings evidence that the physiopathological effects of LPS depend on two parameters : their biological activity and their metabolism. Any strategy of research or therapeutic targeting LPS should take into account their molecular structure, their aggregability and the relation between the both parameters, which are major determinants of their biological activity and their metabolism.