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Growing evidence suggests that obesity and associated metabolic dysregulation occurs in concert with chronic low-grade inflammation. Toll-like receptors (TLR) are transmembrane receptors that play an important role in innate immunity and the induction of inflammatory responses. Our laboratory has observed that TLR4 expression is elevated in the skeletal muscle of obese humans and is associated with reduced fatty acid (FA) oxidation and increased lipid synthesis. Additionally, activation of this pathway by lipopolysaccharide (LPS), ex vivo, results in a shift in substrate metabolism favoring glucose as an energy substrate and preferential storage of FA in intracellular lipid depots. The purpose of this study was to examine the effects of saturated vs. monounsaturated FA on TLR4 transcription and signaling using ex vivo and in vivo models. C2C12 myotubes were incubated in FA-enriched growth medium with varying ratios of palmitate and oleate for 12 hours. Following FA treatment, cells were either collected for measures of mRNA and protein levels of TLR4 or challenged with LPS (500 ng/mL) for 2 hours to assess TLR4 mediated changes in interleukin-6 (IL-6) and glucose and fatty acid metabolism. TLR4 mRNA and protein content were increased in stepwise fashion with higher palmitate concentration (p<0.05). This was associated with an exacerbated LPS effect on IL-6 mRNA and protein levels, and glucose and fatty acid metabolism. To determine if these effects are translated to an in-vivo model, C57BL/6 mice were fed high saturated fat (HSF), high monounsaturated fat (HMF), and control diets for 10 weeks. Following the dietary intervention, animals were challenged with I.P. injections of either saline or LPS (~25μg/mouse), sacrificed 4 hours post-injection, and red and white gastrocnemius muscle were harvested for measures of expression and protein levels of TLR4 and IL-6, and glucose and fatty acid metabolism. TLR4 mRNA and protein levels were not altered with either the HSF or HMF diets. However, there was a heightened LPS response with regards to increases in IL-6 and TNF-α, and enhanced shifts in substrate metabolism following the HSF diet (p<0.05). These effects were not observed in response to the HMF diet. In conclusion, these data demonstrate that a milieu of high saturated fatty acids results in elevated sensitization of the TLR4 pathway in skeletal muscle. These results provide insight into how a westernized diet, one enriched in saturated fat, may link chronic inflammation with obesity-associated metabolic abnormalities. / Ph. D.

The innate immune response to lipopolysaccharide (LPS) mediated by toll-like receptor 4 (TLR4) contributes substantially to the morbidity of equine gastrointestinal disease, neonatal sepsis and other diseases. MicroRNAs (miRNAs), small non-coding RNA molecules acting as post-transcriptional regulators of gene expression, have key roles in TLR4 signaling regulation in other species. The central hypothesis of this study was that LPS induces differential expression of miRNAs in equine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). PBMCs were isolated from healthy adult horses and cultured with LPS or medium only for 2, 4 and 8 hours. Concentrations of inflammatory cytokines were measured in supernatants by immunoassay. Illumina Next-Generation Sequencing of the miRNA transcriptome was performed in PBMCs at 0, 2 and 4 hours. Selected expression changes were verified by qRT-PCR. 327 mature miRNAs were detected in equine PBMCs. Only miR-155 was significantly upregulated by LPS. 9 miRNAs showed statistically significant expression changes with time. Tumor necrosis factor-α concentration was significantly higher in supernatants from LPS-treated cells than controls from 2 hours, while interleukin-10 and interferon-γ were increased at 8 hours. miR-155 expression was correlated to all three cytokines. These data provide a foundation for future research into miRNA involvement in equine inflammatory responses. miR-155 is the principal LPS-induced miRNA in horses. Bioinformatic target predictions support roles in regulation of innate and adaptive immune responses including TLR4 signaling, as in humans. It is thus likely to influence the acute inflammatory response to LPS. Further research will be necessary to establish its role in naturally occurring disease. / Master of Science

Estudos recentes têm demonstrado uma participação importante do receptor toll-like 4 (TLR4) na evolução de doenças envolvendo desordens metabólicas, como a doença do fígado gorduroso não-alcoólico (NAFLD). No entanto, as alterações do metabolismo lipídico que poderiam ser influenciadas pela ativação do TLR4 são desconhecidas. Neste estudo propomos caracterizar o papel do receptor TLR4 no metabolismo de lipídios no fígado de camundongos deficientes para o receptor de LDL, um modelo que desenvolve NAFLD quando submetido a uma dieta rica em gordura saturada e colesterol. Camundongos controle (C57 black6), deficientes para o receptor de LDL (LDLrKO), deficientes para o receptor TLR4 (TLR4KO) ou deficientes para ambos (duplo KO) receberam dieta controle ou hiperlipídica por quatro, oito ou doze semanas. Após o tratamento e sacrifício dos animais, avaliamos o perfil de lipídios plasmáticos, o conteúdo de lipídios do fígado e a expressão gênica de enzimas relacionadas à síntese e degradação de triglicerídeos (TG) e colesterol no fígado. O perfil inflamatório no fígado também foi avaliado. A dieta hiperlipídica induziu uma hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia nos animais LDLr KO e duplo KO, sendo que o grupo duplo KO apresentou níveis séricos inferiores de triglicérides (TG) e ácidos graxos livres a partir de oito semanas de tratamento em comparação aos animais LDLrKO. A dieta hiperlipídica também induziu um aumento significativo no conteúdo de TG e de colesterol no fígado de todos os grupos. Na análise da expressão gênica não foram encontradas diferenças na expressão de proteínas relacionadas à síntese de triglicérides e colesterol (ApoB100, MTTP, GPAT1 e GPAT4) entre os grupos. Porém houve aumento significativo na expressão de proteínas relacionadas à oxidação de ácidos graxos (CPT1, MTP, ACOX, PBE, tiolase) e à síntese de ácidos biliares (CYP7a1) no grupo duplo KO em comparação ao grupo LDLr KO. No perfil inflamatório, a expressão de F4/80 demonstrou infiltração de macrófagos significativamente elevada no grupo LDLrKO tratado com a dieta hiperlipídica comparada a todos os outros grupos. No entanto, houve maior expressão de IL-6, IL-1beta e TNF-alfa no grupo duplo KO em comparação ao grupo LDLr KO. Nossos dados sugerem que a ativação do TLR4 no fígado de animais alimentados com uma dieta hiperlipídica pode contribuir para o acúmulo de lipídios e início da esteatose hepática. Estratégias para a inativação hepática do TLR4 podem diminuir a NAFLD não somente devido a diminuição da inflamação, mas por aumentar a oxidação de ácidos graxos no fígado / Recent studies have shown an important role of toll-like receptor 4 (TLR4) in the evolution of diseases involving metabolic disorders, such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). However, changes in lipid metabolism regulated by TLR4 activation are still unknown. In this study, we characterized the role of TLR4 receptor in hepatic lipid metabolism of mice deficient for the LDL receptor, a model that develops NAFLD when exposed to a diet rich in saturated fat and cholesterol. We investigated the role of TLR4 activation in the pathogenesis of diet-induced NAFLD by crossing LDLr KO mice with the TLR4 knockout mice (double KO). Animals were fed for 4, 8 or 12 weeks with high-fat diet (HFD) containing 18% saturated fat and 1.25% cholesterol. We evaluated plasma lipid profile, hepatic lipid content and gene expression of enzymes related to the synthesis and degradation of triglycerides and cholesterol in the liver. Liver inflammatory status was also investigated. We observed that HFD induced hypertriglyceri-demia and hypercholesterolemia in LDLr KO and double KO mice, but double KO animals presented lower serum levels of triglycerides and free fatty acids after eight weeks of treatment. HFD also induced a significant increase in liver contents of triglycerides (TG) and of cholesterol in all groups. We did not find differences in the expression of proteins related to triglycerides and cholesterol synthesis (ApoB100, MTTP, GPAT1, GPAT4) between the groups. However, we observed a significant increase in the expression of proteins related to fatty acid oxidation (CPT1, MTP, ACOX, PBE, tiolase ) and bile acid synthesis (CYP7a1) in double KO group in comparison to LDLr KO. Regarding the inflammatory process, F4/80 expression was elevated in LDLr KO mice fed HFD when compared to all groups. On the other hand, IL-6, IL-1beta e TNF-alfa expression was induced by HFD only in double KO mice. Taken together, our results show that TLR4 activation in liver from mice fed on a high-fat diet may contribute to lipid accumulation and steatosis onset. Strategies regarding localized TLR4 inactivation may increase the oxidation of fatty acids and improve NAFLD not only due to decreased inflammation

Lipopolissacarídeos (LPS), pode tanto proteger quanto exacerbar o desenvolvimento da asma. LPS inicia a ativação da resposta imune via ligação da molécula Toll-like receptor 4 (TLR4) que sinaliza por duas vias distintas, as moléculas adaptadoras MyD88 e TRIF. LPS é um adjuvante que induz resposta do tipo Th1, enquanto que o hidróxido de alumínio (Alum) desperta respostas Th2, porém, a mistura de ambos adjuvantes na indução da resposta alérgica pulmonar ainda não foi investigada. No presente estudo, nós determinamos o efeito de dois agonistas de TLR4, um natural (LPS) e outro sintético (ER-803022) adsorvidos ao Alum sobre o desenvolvimento de doença alérgica pulmonar. Os animais foram sensibilizados pela via subcutânea com os antígenos, Ovoalbumina (OVA) ou Toxóide Tetânico (TT) na presença ou ausência de agonistas de TLR4 co-adsorvidos ao Alum e desafiados com os respectivos antígenos pela via intranasal. Nossos resultados mostraram que a sensibilização com OVA ou TT e LPS coadsorvidos ao Alum, impede o estabelecimento da resposta alérgica mediada por linfócitos Th2, tais como, influxo de eosinófilos, produção de citocinas do tipo 2, hiperreatividade brônquica, secreção de muco, e produção de IgE ou IgG1 anafilática. Apesar dos níveis de IgG2a, isotipo associado com as respostas Th1 estarem aumentados, análise da histopatologia pulmonar não revelou um desvio para o padrão Th1 de inflamação. Verificamos que a presença das moléculas TLR4, MyD88, IL-12/IFN-g mas não TRIF foram necessários para LPS exercer seu efeito inibitório. O agonista sintético de TLR4, menos tóxico que LPS, também protegeu contra o desenvolvimento de inflamação alérgica pulmonar. Em conclusão, nosso trabalho esclarece o efeito da sinalização do TLR4 na sensibilização alérgica e indica que agonista sintético de TLR4 com baixa toxicidade, pode ser utilizado para modular a capacidade adjuvante do Alum e conseqüentemente diminuir a indução de alergias. / Epidemiological and experimental data suggest that bacterial lipopolysaccharides (LPS) can either protect from or exacerbate allergic asthma. LPS triggers immune responses through Toll-like receptor (TLR) 4 that in turn activates two major signaling pathways via either MyD88 or TRIF adaptor proteins. LPS is a pro-Th1 adjuvant while aluminum hydroxide (Alum) is a strong Th2 adjuvant, but the effect of mixing both adjuvants on development of lung allergy has not been investigated. We determined whether natural (LPS) or synthetic (ER-803022) TLR4 agonists adsorbed onto alum adjuvant affect allergen sensitization and development of airway allergic disease. To dissect LPS-induced molecular pathways we used TLR4, MyD88, TRIF, or IL-12/IFN-g deficient mice. Mice were sensitized subcutaneously to allergens such as ovalbumin (OVA) or tetanus toxoid (TT) with or without TLR4 agonists coadsorbed onto Alum and challenged twice via intranasal route with the same allergens. The development of type 2 immunity was evaluated 24 h after last allergen challenge. We found that sensitization with OVA or TT plus LPS co-adsorbed onto Alum impaired allergeninduced Th2-mediated responses such as airway eosinophilia, type 2 cytokines secretion, airway hyperreactivity, mucus hyper production and serum levels of IgE or IgG1 anaphylactic antibodies. Although the levels of IgG2a, a Th1 affiliated isotype increased, investigation into the lung-specific effects revealed that LPS did not induce a Th1 pattern of inflammation. LPS impaired the development of Th2 immunity, signaling via TLR4 and MyD88 molecules via the IL-12/IFN-g axis, but not through TRIF pathway. Moreover, the synthetic TLR4 agonists that proved to have a less systemic inflammatory response than LPS also protected against allergic asthma development. TLR4 agonists co-adsorbed with allergen onto Alum down modulate Th2 immunity and prevent the development of polarized T cell-mediated airway inflammation. Thus, our work clarifies the effect of TLR4 signaling in allergic sensitization and indicates that TLR4 agonists with low toxicity might be useful for down regulating the pro-Th2 adjuvant activity of alum and consequently decrease the induction of allergy.

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

A doença de Behçet tem sua fisiopatologia caracterizada por hiperatividade neutrofílica, particularmente em relação à quimiotaxia, e períodos de atividade da doença podem ser desencadeados por exposição a estreptococos. Uma vez que células do sistema imune inato são ativadas pelo ácido lipoteicoico (LTA) de bactérias gram-positivas via receptor toll-like (TLR) 2 e CD14, cujas expressões são reguladas pelos fatores estimulantes de colônias de granulócitos (G-CSF) e granulócitos-macrófagos (GM-CSF), o objetivo principal deste estudo foi determinar se há hiperexpressão de TLR2 em neutrófilos de DB ativa e se a quimiotaxia de polimorfonucleares (PMN) neutrófilos na DB poderia ser hiperestimulada pelo LTA. Além do TLR2, foram medidas as expressões de TLR4, CD14, CD114 (receptor de G-CSF) e CD116 (receptor de GM-CSF) nos neutrófilos e nos monócitos de pacientes com doença de Behçet (DB), as concentrações séricas de CD14 solúvel (CD14s) e as respostas quimiotáxicas dos PMNs de DB sob diferentes estímulos. A expressão dos receptores foi medida pela citometria de fluxo, as concentrações séricas por ELISA e as respostas quimiotáxicas foram avaliadas em câmara de Boyden. Nos PMNs, os receptores foram igualmente expressos nos dois grupos e, estimulados com LTA, suas respostas quimiotáxicas também foram similares. Somente à incubação com plasma os PMNs de DB desenvolveram hiperquimiotaxia em relação aos PMNs controles. A expressão do TLR2 foi maior em monócitos de DB em relação aos controles, e a concentração de CD14s sérica, de origem monocitária, foi maior nos pacientes com DB ativa. Em conjunto, os resultados demonstram que PMNs de DB, isoladamente, não reagem exacerbadamente ao LTA, e suas respostas migratórias são estritamente dependentes de fatores estimulantes solúveis. / Expressions of toll-like receptor (TLR) 2, TLR4, CD14, CD114 and CD116 were assessed on polymorphonuclear (PMN) neutrophils and monocytes of patients with Behçets disease (BD). PMN chemotactic responses under different stimulations were also measured. The objective was to determine if BD PMN chemotaxis may be overstimulated by lipoteichoic acid (LTA) from gram-positive bacteria. Receptor expressions were measured by flow cytometry and PMN chemotaxis was assessed in a Boyden chamber. Only TLR2 expression was higher on monocytes of the BD group than in control group. On PMNs, however, TLR2 expression was similar in both groups and, when stimulated with LTA, BD PMN cells showed chemotactic responses similar to the controls. These cells only exhibited increased chemotaxis when incubated with plasma. In conclusion, isolated BD PMN did not overreact to LTA, and its hyperchemotaxis is strictly dependent on soluble stimulating factors