O Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) é uma espécie do gênero Tospovirus, transmitido por tripes, que infecta diversas espécies da família Cucurbitaceae. Já foi constatado em diversos estados brasileiros e sua incidência tem aumentado significativamente nos últimos anos em algumas regiões. Por se tratar de uma virose em potencial para as cucurbitáceas, pouco se conhece sobre os danos causados e a reação das diferentes espécies de cucurbitáceas à infecção em campo. Esse trabalho teve por objetivos: estudar a eficiência da RT-PCR para a detecção rápida e especifica do ZLCV em cucurbitáceas; avaliar os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita em campo e a reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção natural A detecção do ZLCV por RT-PCR foi estudada utilizando um par de oligonucleotídeos iniciadores, desenhados com base na seqüência do S-RNA do ZLCV (AF067069). Quatro espécies de tospovírus (TSWV, TCSV, GRSV e CSNV) e outros vírus que infectam cucurbitáceas (PRSV-W-1, PRSV-W-C, ZYMV-M, ZYMV-Atibaia e CMV) foram incluídos no teste. Na reação de RT-PCR foi obtido um fragmento de aproximadamente 350 pb, amplificado somente a partir de RNA total extraído de planta infectada com o ZLCV. A seqüência obtida desse fragmento apresentou 98,2 % de identidade com a seqüência de nucleotídeos do S-RNA do ZLCV depositada no GenBank. Os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita 'Caserta' foram avaliados em campo na ESALQ/USP, Piracicaba-SP, onde esse vírus é freqüente. As plantas foram monitoradas semanalmente quanto à infecção pelo ZLCV por meio dos sintomas e por PTA-ELISA. As plantas foram agrupadas em função da época de aparecimento dos sintomas do ZLCV, avaliando a produção de frutos comerciais (FC) e não comerciais (FNC) de cada grupo e comparando com a de plantas que permaneceram sem sintomas até o final do experimento. As plantas que apresentaram sintomas até os 23 dias após a emergência (DAE) não produziram qualquer tipo de frutos. FC foram colhidos de plantas que apresentaram sintomas a partir dos 42 DAE. Mesmo assim, houve redução de 78,5 % na produção de FC. Plantas que mostraram sintomas por ocasião da última colheita (55 DAE) apresentaram redução na produção de FC de 9,6 %. A infecção com o ZLCV até o início da frutificação inviabiliza a produção de FC de abobrinha de moita 'Caserta'. A reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção com o ZLCV foi avaliada em campo, por meio da infecção natural e em casa de vegetação, onde as plantas foram duplamente inoculadas mecanicamente com o ZLCV no estádio cotiledonar. A avaliação foi feita com base no monitoramento dos sintomas e por PTA-ELISA. A abobrinha de moita 'Caserta' e a abóbora híbrida 'Takaiama' apresentaram alta suscetibilidade ao ZLCV. O pepino 'Safira' apresentou baixa infecção em campo e intermediária em casa de vegetação. Enquanto que a melancia 'Crimson Sweet', o maxixe do Norte, a abóbora rasteira 'Menina Brasileira' e a moranga 'Alice' apresentaram valores menores de infecção. A moranga 'Exposição' foi altamente resistente, pois não foi infectada nos ensaios em campo e em casa de vegetação. / Zucchini lethal chlorosis virus is a specie of the Genus Tospovirus, transmitted by thrips (Frankliniella zucchini), which infects some species of the family Cucurbitaceae. The occurrence of this Tospovirus has already been reported for several Brazilian states and its incidence in cucurbit crops has increased in the last years in some regions. Considering the importance of this Tospovirus for cucurbit crops, very little is known about the damage caused by this virus and the reaction of the different species of cucurbits to infection. This work aimed: to study the efficiency of the RT-PCR for the fast and specific detection of ZLCV, to evaluate the damage caused by this virus on zucchini squash under field condition and the reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with this Tospovirus. The detection of ZLCV by RT-PCR was studied using a pair of primers designed based on the nucleotide sequence of the SRNA of ZLCV (AF067069). Four other Tospovirus species (TSWV, TCSV, GRSV and CSNV) and other virus that infect cucurbits (mild strain PRSV-W-1, wild strain PRSV-WC, mild strain ZYMV-M, wild strain ZYMV-Atibaia and CMV) were included in this test. The RT-PCR reaction generated a fragment of approximately 350 bp, only amplified from total RNA extracted from plant infected with ZLCV. The sequence of this fragment presented 98.2 % identity with the corresponding nucleotide sequence of the S-RNA of ZLCV deposited in the GenBank. The damage caused by ZLCV on zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta) was evaluated under field condition. Zucchini squash plants were weekly monitored for the presence of characteristic symptoms induced by ZLCV and PTA-ELISA for virus indexing. Plants were grouped based on the time the symptoms were first seen. Fruits harvested from each plant within each group were classified on marketable (M) and non-marketable (NM) based on the phenotype. Plants that did not show symptoms by the end of the crop were considered still healthy and their yield was used as control. Zucchini squash plants that showed symptoms of ZLCV infection up to 23 days after emergency (DAE) did not yield any fruit. Marketable fruits were first harvested only from plants that showed symptoms 42 DAE. However, the yield of marketable fruits was reduced by 78.5 %, as compared to that from asymptomatic plants. Plants that showed symptoms 55 DAE showed a reduction on the yield of marketable fruit of 9.6%. The reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with ZLCV was evaluated under field and greenhouse conditions. In the field experiment, ZLCV infection occurred naturally. In the greenhouse, plants were twice mechanically inoculated with ZLCV at the cotyledonal stage. Evaluations were based on symptoms expression and PTA-ELISA. Zucchini squash 'Caserta' and hybrid squash 'Takaiama' were highly susceptible. The cucumber 'Safira' presented low percentage of infected plants in the field and intermediate in the greenhouse. Watermelon 'Crimson Sweet', northern gherkin, long neck squash 'Menina Brasileira' and winter squash 'Alice' presented lower values of infected plants. Winter squash 'Exposição' was highly resistant to infection under field and greenhouse conditions.

[EN] Tomato spotted wilt virus is one of the most widespread and economically important viruses worldwide. It infects a large number of plant species, being the tomato and pepper the most affected. TSWV is transmitted from one plant to another by various species of thrips in a circulative and propagative manner, being Flankliniella occidentalis the main vector. The best strategy for disease control in tomato and pepper has been breeding resistant cultivars, but only tomato with the gene Sw-5 and pepper with gene Tsw have been effective against a wide spectrum of TSWV isolates, but resistance-breaking isolates often arise. To obtain a more effective and durable control is necessary: A) the genetic and biological characterization of conventional and resistance-breaking isolates of TSWV; B) the understanding the evolutionary and epidemiological factors involved in the emergence and dispersion of resistance-breaking isolates; C) the development of tools for viral detection and quantification; and D) evaluation of new sources of resistance (total or partial, estimated as the difficulty to viral infection or/and accumulation) or tolerance (total or partial, estimated as the difficulty to symptoms development and damage without affecting viral infection). In this work, TSWV isolates from Spanish tomato and pepper crops have been biologically and molecularly characterized. The complete genome of three TSWV isolates with different biotypes were sequenced: N (unable to infect Sw-5 resistant tomato and Tsw resistant pepper), T (tomato Sw-5 resistance-breaking), and P (pepper Tsw resistance-breaking). No correlation between genetic variation and the ability of overcoming resistance was found. These nucleotide sequences and others retrieved from the GenBank database were used to develop RT-qPCR, with high sensitivity and dynamic range. Primers and one TaqMan MGB were designed from conserved sequence stretches with the aim of detecting and quantifying any TSWV isolate. It was not possible to develop a molecular method to differentiate between conventional and resistance-breaking isolates since there is no correlation between genotype and biotype. Instead, two TaqMan MGB probes were designed to quantify the two main genotypes (according to the M segment) in mixed infections. RT-qPCR was used to evaluate TSWV accumulation in non-resistant tomato, non-resistant pepper and Datura stramonium (an important reservoir), as well as in the main vector F. occidentalis, which was considered to evaluate transmission efficiency. The results showed that resistance breakdown was not associated to a fitness cost (tradeoff) in the infectivity of susceptible hosts or transmissibility by thrips and that the resistance-breaking isolates have the same potential for dispersion in field as the conventional isolates. Finally, the information obtained from the previous studies and the RT-qPCR technique were used to evaluate the resistance and tolerance to TSWV of a new accession of Capsicum baccatum. In addition to considering the genetic and biological variation of TSWV, a new approach was used based on analysis of longitudinal data (those measured in the same individuals over time). The resistance level was estimated with two variables: A) absolute fitness, calculated from the variation in time of the viral titer, quantified by RT-qPCR; and B) infectition survival, the median time in which the virus was detected in a plant by ELISA. The tolerance level was estimated as symptom survival, the median time in which a plant developed severe symptoms. This analysis showed that this new accession is partially resistant and totally tolerant to TSWV conventional and resistance-breaking isolates and therefore is a good candidate for a pepper breeding program / [ES] Tomato spotted wilt virus (TSWV) es uno de los virus más extendidos y de mayor importancia económica del mundo. Infecta a un gran número de especies vegetales, siendo los cultivos de tomate y pimiento los más afectados. Este virus se transmite de una planta a otra por trips en una manera propagativa y circulativa, siendo Flankliniella occidentalis el más eficaz. El cultivo de variedades resistentes de tomate y pimiento permitió el control de la enfermedad, ya que estos genes inducen una respuesta hipersensible impidiendo la infección sistémica del virus. Sin embargo, con frecuencia aparecen aislados del virus capaces de superar estas resistencias. Para obtener un control de la enfermedad más eficaz y duradero es necesario: A) la caracterización genética y biológica de los aislados del TSWV que superan y no superan las resistencias; B) el estudio de los factores evolutivos y epidemiológicos implicados en la aparición y establecimiento de los aislados que superan las resistencias; C) el desarrollo de herramientas que permitan la detección y cuantificación de estos aislados virales; y D) la evaluación de nuevas fuentes de resistencia o tolerancia. En este trabajo se han caracterizado biológicamente y molecularmente diferentes aislados del TSWV procedentes de cultivos de tomate y pimiento de España. Se determinó la secuencia nucleotídica del genoma completo de tres aislados españoles correspondientes a tres biotipos: N (incapaz de infectar variedades resistentes de tomate o pimiento); T (supera la resistencia Sw-5 de tomate); y P (supera la resistencia Tsw de pimiento). No se encontró correlación entre la variación genética y la capacidad de superar la resistencia. Estas secuencias nucleotídicas y otras obtenidas de la base de datos Genbank se utilizaron para desarrollar una técnica basada en la RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) que permite detectar el virus con un alto grado de sensibilidad y cuantificar en un amplio rango dinámico. Se diseñaron los iniciadores y una sonda TaqMan MGB a partir de segmentos de secuencia conservados para que fueran válidos para todos los aislados del TSWV. También se desarrollaron dos sondas Taqman que permitían cuantificar diferencialmente variantes genéticas del virus en infecciones mixtas. La RT-qPCR se utilizó para evaluar la acumulación de varios aislados del TSWV en tomate sin Sw-5, pimiento sin Tsw y Datura stramonium, así como, en su principal vector F. occidentalis que se usó para evaluar la eficiencia de la transmisión. Se observó que la superación de la resistencia no suponía un coste en la eficacia biológica (fitness) tanto en la multiplicación del virus en estas plantas como en la transmisión por trips. Por tanto, los aislados que superan las resistencias tienen la misma capacidad de dispersión en campo que los aislados convencionales. Por último, se utilizó la RT-qPCR y la información obtenida para evaluar la capacidad de resistencia y tolerancia al TSWV de una accesión de Capsicum baccatum. El nivel de resistencia se estimó a partir de dos variables: A) la eficacia absoluta, calculada a partir de la variación en el tiempo del título viral, cuantificado por RT-qPCR; y B) la infectividad, como la mediana del tiempo que tarda el virus en ser detectado en una planta por ELISA. El nivel de tolerancia se estimó como la mediana del tiempo que tarda una planta en mostrar síntomas graves. Esta nueva accesión es parcialmente resistente y totalmente tolerante tanto para aislados del TSWV convencionales como para aquellos capaces de infectar e inducir síntomas severos en variedades de pimiento con el gen Tsw. Por tanto, esta nueva variedad de C. baccatum es un buen candidato para usarlo en programas de mejora genética de pimiento. / [CAT] Tomato spotted wilt virus (TSWV) és un dels virus més estesos i de major importància econòmica del món. Infecta a un gran nombre d'espècies vegetals i els cultius de tomaca i pebrot són alguns dels més afectats. Aquest virus es transmet d'una planta a una altra, per trips de manera propagativa i circulativa, i Flankliniella occidentalis és el més eficaç. El cultiu de varietats resistents de tomaca i pebrot (en els quals s'han introduït per millora genètica els gens Sw-5 i Tsw, respectivament) va permetre el control de la malaltia, ja que aquests gens indueixen una resposta hipersensible i impedeixen la infecció sistèmica del virus (resistència total). No obstant açò, amb freqüència apareixen aïllats del virus que són capaços de superar aquestes resistències. Per a obtenir un control de la malaltia més eficaç i durador és necessari: A) la caracterització genètica i biològica dels aïllats del TSWV que superen i no superen les resistències; B) l'estudi dels factors evolutius i epidemiològics implicats en l'aparició i establiment dels aïllats que superen les resistències; C) el desenvolupament d'eines que permeten la detecció i quantificació d'aquests aïllats virals; i D) l'avaluació de noves fonts de resistència (total o parcial, que dificulten la infecció i multiplicació viral) o tolerància (total o parcial, que dificulten l'aparició de símptomes i danys encara que no tinguen un efecte en la infecció viral). En aquest treball s'han caracteritzat biològicament i molecularment diferents aïllats del TSWV procedents de cultius de tomaca i pebrot d'Espanya. Es va determinar la seqüència nucleotídica del genoma complet de tres aïllats espanyols corresponents a tres biotips: N (incapaç d'infectar varietats resistents de tomaca o pebrot); T (supera la resistència Sw-5 de tomaca); i P (supera la resistència Tsw de pebrot). Els resultats van mostrar que no hi havia una correlació entre la variació genètica i la capacitat de superar la resistència. Aquestes seqüències nucleotídiques i altres obtingudes de la base de dades Genbank es van utilitzar per a desenvolupar una tècnica basada en la RT-qPCR que permet detectar el virus amb un alt grau de sensibilitat i quantificar en un ampli rang dinàmic. Es van dissenyar els iniciadors i una sonda TaqMan MGB a partir de segments de seqüència conservats perquè foren vàlids per a tots els aïllats del TSWV. Tambe es van desenvolupar dos sondes Taqman que permetien quantificar diferencialment variants genètiques del virus en infeccions mixtes. La RT-qPCR es va utilitzar per a avaluar l'acumulació de diversos aïllats del TSWV en tomaca sense Sw-5, pebrot sense Tsw i Datura stramonium així com, en el seu principal vector F. occidentalis que es va usar per a avaluar l'eficiència de la transmissió. Es va observar que la superació de la resistència no suposava un cost en l'eficàcia biològica (fitness) tant en la multiplicació del virus en aquestes plantes com en la transmissió per trips. Per tant, els aïllats que superen les resistències tenen la mateixa capacitat de dispersió en camp que els aïllats convencionals. Finalment, es va utilitzar la RT-qPCR i la informació obtinguda per a avaluar la capacitat de resistència i tolerància d'una accessió de Capsicum baccatum al TSWV. El nivell de resistència es va estimar a partir de dues variables: A) l'eficàcia absoluta, calculada a partir de la variació en el temps del títol viral, quantificat per RT-qPCR; i B) la infectivitat, com la mitjana del temps que es tarda a detectar el virus en una planta per mitjèr d'ELISA. El nivell de tolerància es va estimar com la mitjana del temps que tarda una planta a mostrar símptomes greus. Aquesta nova accessió és parcialment resistent i totalment tolerant tant per a aïllats del TSWV convencionals com per a aquells capaços d'infectar i induir símptomes severs en varietats amb el gen Tsw. Per tant, aquesta nova varietat d / Debreczeni, DE. (2015). Caracterización de aislados del virus del bronceado del tomate (TSWV) que superan las resistencias de los genes Sw-5 en tomate y Tsw en pimiento. Identificación de una fuente de tolerancia en pimiento [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51460 / TESIS

Para que el proceso infeccioso de un virus de plantas tenga éxito la progenie viral tiene que propagarse desde las primeras células infectadas al resto de la planta; inicialmente se moverá célula a célula a través de los plasmodesmos (PDs) hasta alcanzar el sistema vascular, lo cual le permitirá invadir las partes distales de la planta. En este proceso, las proteínas de movimiento (MPs), junto con la colaboración de otros actores secundarios, desempeñan un papel relevante. El conocimiento de la posible asociación de las MPs con estructuras u orgánulos celulares así como de la interacción con factores del huésped es de vital importancia para poder desarrollar estrategias antivirales que permitan una mejora en la producción de los cultivos. Además, este tipo de estudios no sólo han posibilitado un mayor conocimiento de las respuestas al estrés en plantas sino que han sido pioneros en desentrañar los mecanismos de translocación intercelular de factores celulares implicados en los procesos de desarrollo de las plantas. Las MPs virales se clasifican en familias/grupos en función de su grado de similitud. Los virus, cuyas MPs pertenecen a la Superfamilia 30K, expresan una única MP encargada de orquestar el movimiento intra- e intercelular de genoma viral. En el Capítulo 1 de la presente Tesis se ha caracterizado la asociación de la MP del Virus del mosaico del tabaco (TMV), miembro tipo de la familia 30K, al sistema de endomembranas. Mediante el uso de aproximaciones in vivo se ha estudiado la eficiencia de inserción de sus regiones hidrofóbicas (HRs) en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Nuestros resultados demuestran que ninguna de las dos HRs de la MP es capaz de atravesar las membranas biológicas y que la alteración de la hidrofobicidad de la primera HR es suficiente para modificar su asociación a la membrana. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo topológico en el cual la MP del TMV se encontraría fuertemente asociada a la cara citosólica de la membrana del ER, sin llegar a atravesarla. La observación de que i), el modelo propuesto es compatible con otros motivos, previamente caracterizados, de la MP de TMV y ii), concuerda con la topología descrita para otras MPs de la familia 30K, permite cuestionar el modelo establecido desde el año 2000 para la MP de TMV así como predecir, en base a la conservada estructura secundaria de las MPs de esta familia, una topología similar para todos sus componentes. Para el transporte intercelular de los virus de plantas se han descrito tres modelos en base a la capacidad de transportar complejos ribonucloeprotéicos, a través de PD modificados, formados por el RNA viral y la MP (ej. MP de TMV) más la proteína de cubierta (ej. MP del virus del mosaico del pepino, CMV) o la capacidad de transportar viriones a través estructuras tubulares formadas por la MP (ej. MP del Virus del mosaico del caupí, CPMV). A pesar de las diferencias observadas entre los tres modelos, las MPs representativas de cada uno de ellos pertenecen a la misma familia 30K y son funcionalmente intercambiables (MPs de TMV, CMV, CPMV, Virus del mosaico del Bromo -BMV- o Virus de los anillos necróticos de los prunus -PNRSV-) por la MP del Virus del mosaico de la alfalfa (AMV), para el transporte a corta distancia. Con el objeto de comprender la versatilidad que presentan las MPs en cuanto al movimiento viral, hemos analizado la capacidad de estas MPs heterólogas de transportar sistémicamente el genoma quimérico del AMV. El estudio ha revelado que todas las MPs analizadas permiten el transporte del genoma quimera a las partes distales de la planta, independientemente del modelo descrito para el transporte a corta distancia, aunque requieren la extensión de los 44 aminoácidos C-terminales de la MP del AMV. Además, para todas las ellas, excepto para la MP del TMV, se ha establecido una relación entre la capacidad de movimiento local y la presencia del virus en las hojas no inoculadas de la planta, indicando la existencia de un umbral de transporte célula a célula, por debajo del cual, el virus es incapaz de invadir sistémicamente la planta. Durante el proceso de infección viral, las MPs interaccionan tanto con otras proteínas de origen viral como de la planta huésped. La interacción entre las MPs y dichos factores de la planta afectan a la patogénesis viral, facilitando u obstaculizando el movimiento intra- o intercelular del virus. En el Capítulo 3 del presente trabajo hemos demostrado la interacción entre la MP del AMV y dos miembros de la familia de Patellinas de arabidopsis, Patellin 3 (atPATL3) y Patellin 6 (atPATL6), mediante el sistema de los dos híbridos de levadura y ensayos de reconstitución bimolecular de la fluorescencia. Nuestros resultados, en general, demuestran que la interacción entre la MP-PATLs obstaculizaría un correcto direccionamiento de la MP al PD, dando lugar a un movimiento intracelular menos eficiente de los complejos virales, que forma la MP, y disminuyendo el movimiento célula a célula del virus. Podríamos estar hablando de un posible mecanismo de defensa de la planta, dirigido a evitar la invasión sistémica del huésped. En este sentido, las MPs virales pueden ser buenos candidatos para el desarrollo de estrategias antivirales dado que cualquier respuesta de defensa de la planta que, a priori, reduzca el transporte célula a célula del virus, puede representar la diferencia entre una infección local o sistémica, como hemos observado en el Capítulo 2 del presente trabajo. Los virus, a su vez, también son capaces de evolucionar hacia variantes más eficaces, que permitan superar las diferentes barreras defensivas de la planta huésped. En este contexto hemos identificado a la MP del Virus del bronceado del tomate (TSWV) como determinante de avirulencia en la resistencia mediada por el gen Sw-5. Del mismo modo, comprobamos que el cambio de 1-2 residuos de amino ácidos de la MP de TSWV fue suficiente para superar la resistencia pero que a la vez, y posiblemente debido a las altas restricciones que conlleva el reducido genoma de un virus, afectaron a la eficiencia de la MP. / Peiró Morell, A. (2014). Proteínas de movimiento de la familia 30K:interacción con membranas biológicas y factores proteicos y su implicación en el transporte viral [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48471 / TESIS