Das Polyether-Antibiotikum Salinomycin stammt ursprünglich aus der Tierzucht und wurde kürzlich als Inhibitor epithelialer Tumorstammzellen identifiziert. Vor einem möglichen Einsatz in der Onkologie müssen zunächst toxische Effekte von Salinomycin in nicht malignen humanen Zellen evaluiert werden. In dieser Arbeit sollte daher die geno- und zytotoxische Wirkung von Salinomycin auf Zellen humaner nasaler Mukosa und Lymphozyten untersucht werden. Dazu wurden Zellen humaner nasaler Mukosa (Einzelzellkulturen und Miniorgankulturen) und Lymphozyten von 10 Patienten für 24h mit Salinomycin (0,1 bis 175 μM) inkubiert. Zur Untersuchung der Genotoxizität wurde die Einzelzellmikrogelelektrophorese angewendet. Zur Untersuchung der Zytotoxizität wurden der MTT-Test sowie die Annexin-Propidiumjodid-Durchflusszytometrie durchgeführt. Zusätzlich wurde mit einem Sandwich-ELISA die IL-8-Konzentration in den Überständen der Miniorgankulturen gemessen, um die proinflammatorische Wirkung von Salinomycin bewerten zu können. Es zeigte sich kein signifikanter Anstieg der DNA-Schädigung der behandelten Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Im MTT-Test und in der Annexin-Propidiumjodid-Durchflusszytometrie ließ sich ab Konzentrationen von 10-20 μM eine signifikante Reduktion der Vitalität der behandelten Zellen nachweisen. Der Sandwich-ELISA zeigte einen Anstieg der IL-8-Konzentration bei einer Salinomycin-Konzentration von 5 μM und 10 μM. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Salinomycin in den verwendeten Konzentrationen zytotoxisch und proinflammatorisch aber nicht genotoxisch wirkt. Eine toxische Wirkung auf Tumorstammzellen konnte schon ab 0,5 μM beobachtet werden. Dennoch sollten weitere Untersuchungen folgen, um den genauen Wirkmechanismus von Salinomycin zu klären und dessen zytotoxische Wirkung auf nicht maligne Zellen reduzieren zu können. / The polyether antibiotic salinomycin is primary used in stock breeding but has also been identified as a growth inhibitor of epithelial cancer stem cells. Prior to a possible clinical application, toxicological analysis in non-malignant human cells is warranted. Thus, the aim of this study was to investigate cyto- and genotoxic effects of salinomycin in human nasal mucosa cells and peripheral blood lymphocytes. Primary human nasal mucosa cells (monolayer and mini organ cultures) and lymphocytes from 10 individuals were exposed to salinomycin (0,1 to 175 μM) for 24h. The comet assay was performed to detect DNA damage. Cytotoxic effects were investigated by MTT assay and Annexin V-propidium iodide test. Additionally, the secretion of interleukin-8 was analyzed by ELISA to evaluate pro-inflammatory effects of salinomycin. No significant increase of DNA damage in the treated cells compared to the negative control was detected. MTT assay and flow cytometry revealed a significant reduction of cell vitality starting from 10-20 M. IL-8 secretion was elevated at 5 μM and 10 μM. These results suggest cytotoxic and pro-inflammatory but no genotoxic effects of salinomycin at used concentrations. Growth inhibition of cancer stem cells has already been described at salinomycin concentrations of 0,5 μM. However, further investigations regarding its mechanism of action and the reduction of cytotoxic effects in non-malignant cells are necessary.

In dieser Arbeit werden die Toxizitäten und Ansprechraten der postoperativen Bestrahlung des Prostatakarzinoms evaluiert. Das Kollektiv umfasst 219 Patienten, die bei Risikofaktoren eine adjuvante, oder bei PSA-Rezidiv eine salvage Bestrahlung erhielten. Die Bestrahlung erfolgte unter Einsatz eines simultan integrierten Boosts. / This work evaluates the toxicities and response rates of the therapy of the postoperative radiation of prostate cancer. The collective includes 219 patients who either received an adjuvant therapy in case of risk factors or a salvage radiation in case of PSA recurrence. The radiation was submitted with a simultaneously integrated boost.

Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane für Toxizität, allerdings stellt die frühzeitige Erkennung einer Nierenschädigung und/oder kanzerogenen Wirkung infolge einer wiederholten Exposition gegenüber toxischen Verbindungen ein großes Problem dar, da traditionelle Marker für Nierenfunktionsstörungen wenig empfindlich sind. Daher ist es notwendig, verbesserte Testmethoden (Alternativmethoden) zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es daher, mögliche Alternativmethoden zur Prüfung auf Nephrotoxizität nach wiederholter Exposition zu untersuchen. Zum einen wurden dazu in einem in vivo-Modell für chronische Nierentoxizität neue Biomarker für Stress und Gewebeschädigung untersucht, deren erhöhte Genexpression in mehreren Modellen für akute Schädigung des Nierengewebes gezeigt wurde, einschließlich kidney injury molecule-1 (KIM-1), Lipocalin-2 (LCN2), Clusterin (CLU), Osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), Vimentin (VIM) und Hämoxygenase-1 (HO-1). Diese Marker wurden nachfolgend auch in einem zellkulturbasierten in vitro-Modell untersucht. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Veränderungen der Zellteilung als möglicher Marker für die Früherkennung kanzerogener Effekte. Das in vivo-Modell bestand in einer Studie in männlichen F344/N-Ratten, die 14, 28 oder 90 Tage oral mit 0, 21, 70 oder 210 µg/kg Körpergewicht (KG) Ochratoxin A (OTA) behandelt wurden. OTA ist ein Mykotoxin, das in Ratten bei wiederholter Gabe eine Nierenschädigung und Nierenkrebs verursacht. Die Analyse der mRNA-Expression der neuen Biomarker in Nierengewebe zeigte bei Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden, eine frühzeitige, zeit- und dosisabhängige Induktion von KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN und CLU, die mit histopathologischen Veränderungen in Form von Zelldegeneration und Regeneration einherging und das Fortschreiten der Schädigung gut widerspiegelte. Auch die mRNA-Expression von HO 1 und VIM wurde durch OTA moduliert, allerdings war eine Erhöhung nicht zu allen Zeitpunkten zu messen bzw. trat nicht so früh auf wie bei den anderen Markern. Effekte auf traditionelle Marker für Nephrotoxizität (Serum-Kreatinin, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase und γ-Glutamyltransferase im Urin) wurden im Vergleich zu den neuen Markern zu einem späteren Zeitpunkt und zumeist nur in der Hochdosisgruppe festgestellt. Zusätzlich zu den Effekten auf die Genexpression konnte in den Zielzellen von OTA im proximalen Tubulusepithel eine erhöhte Proteinexpression von KIM-1, CLU, OPN und VIM gezeigt werden; nur für KIM-1 wurde allerdings auch im Urin eine erhöhte Konzentration nachgewiesen, die mit den Effekten auf die mRNA- und Proteinkonzentration im Gewebe korrelierte. Damit stellt KIM-1 in dieser Studie hinsichtlich Empfindlichkeit und Messbarkeit den empfindlichsten Biomarker für Nephrotoxizität dar. Die Untersuchung der Zellteilung nach wiederholter Gabe von OTA zeigte einen dramatischen, zeit- und dosisabhängigen Anstieg der Proliferation von proximalen Tubulusepithelzellen in Nieren von Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden. Dagegen wurden nach wiederholter Exposition gegenüber 21 µg/kg KG über 90 Tage keine OTA-abhängigen Effekte auf die renale Zellproliferation festgestellt. Somit korrelieren die Veränderungen der Zellteilung in der Niere in der 90-Tages-Studie sehr gut mit dem Ergebnis der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie mit OTA, in der Nierentumoren nur nach Behandlung mit 70 oder 210 µg/kg KG auftraten. Ausgehend von den verschiedenen Endpunkten für Toxizität, die in der Studie untersucht wurden, liegt der no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) bei 21 µg/kg KG OTA. Dies entspricht dem NOAEL der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die neuen in vivo-Biomarker für Nephrotoxizität in NRK 52E-Zellen als in vitro-Modell ausgetestet. Allerdings konnte eine erhöhte mRNA-Expression von KIM-1, einem sensitiven Marker in vivo, nach 24 oder 48 Stunden Behandlung mit verschiedenen nephrotoxischen Modellverbindungen (OTA, Kaliumbromat (KBrO3), Cisplatin oder Cadmiumchlorid (CdCl2)) in den Zellen nicht nachgewiesen werden. Die mRNA-Expression anderer Marker (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) war dagegen in unbehandelten Zellen bereits so hoch, dass die Behandlung mit Nephrotoxinen zu keiner weiteren Induktion führte. Allein die Gen- und Proteinexpression von HO-1 wurde durch CdCl2, KBrO3 und OTA induziert und könnte daher einen potentiellen Marker für screening-Studien in vitro darstellen. Insgesamt war der Nachweis zytotoxischer Wirkungen jedoch der empfindlichste Endpunkt in der Zellkultur. Die Ergebnisse stützen somit die Verwendung der neuen in vivo-Biomarker als gewebespezifische Marker für Nephrotoxizität in vitro nicht. / The kidney is a main target organ of toxicity, but early detection of kidney damage and/or carcinogenic effects following the repeated exposure to toxic substances presents a major problem, since traditional markers of renal malfunction suffer from lack of sensitivity. Therefore, nephrotoxic effects are often detected only in long-term experiments in animals. Ethical reasons as well as the immense time and costs required for these animal studies have prompted the search for alternative methods by which animal numbers and duration of studies can be reduced. A further, albeit challenging, attempt is to replace experiments in animals by studies in vitro. The aim of this work was to test possible alternative methods for the detection of nephrotoxicity after repeated exposure. One the one hand, the expression of new biomarkers of stress and tissue damage was studied in an in vivo-model of chronic nephrotoxicity; enhanced gene expression of these biomarkers, including kidney injury molecule-1 (KIM-1), lipocalin-2 (LCN2), clusterin (CLU), osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), vimentin (VIM), and heme oxygenase-1 (HO-1), had been demonstrated before in several models of acute kidney damage. In addition to the experiments in vivo, the markers were also studied in a cell culture-based in vitro-model to assess their use as sensitive endpoints of toxicity in vitro. A further part of this work included the determination of cell proliferation as potential early marker of toxin-induced carcinogenic effects. As an in vivo-model, a toxicity study in male F344/N rats was performed. Rats were treated 14, 28 or 90 days with 0, 21, 70 or 210 µg/kg body weight (bw) ochratoxin A (OTA) by oral administration. OTA is a mycotoxin that is known to cause kidney damage and renal tumors in rats after repeated exposure. Analysis of mRNA expression of the new biomarkers showed early, time- and dose-dependent induction of KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN and CLU in kidney tissue of animals treated with 70 or 210 µg/kg bw. The induction of these biomarkers accompanied histopathological changes like cell degeneration and regeneration and mirrored well the progression of tissue damage. mRNA expression of HO-1 and VIM was also modulated by OTA, but overexpression was not evident at all time points or occurred later than for the other markers. Compared with the new biomarkers, effects on traditional markers of nephrotoxicity (serum creatinine, urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase and γ-glutamyltransferase) were restricted to later time points and the high dose group. In addition to the effects on gene expression, enhanced protein expression of KIM-1, CLU, OPN and VIM was observed in target cells of OTA in the proximal tubule epithelium; however, only for KIM-1, increased protein levels were also measured in urine, which correlated with the effects on the gene and protein expression in kidney tissue. Therefore, KIM-1 appeared to be the most sensitive biomarker of nephrotoxicity in this study. The study of the renal cell division after repeated administration of OTA demonstrated a dramatic, time- and dose-dependent increase in the proliferation of proximal tubule epithelial cells in kidneys of rats exposed to 70 or 210 µg/kg bw. In contrast, no OTA-dependent effects on renal cell proliferation were observed after repeated administration of 21 µg/kg bw. Thus, changes of renal cell proliferation in this 90-day-study correlate well with the results of the 2-year-carcinogenicity study with OTA, where renal tumors were only detected at 70 or 210 µg/kg bw. Based upon the different endpoints of toxicity determined in this study, the no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) is 21 µg/kg KG OTA. This is consistent with the result of the 2-year-carcinogenicity study. In another part of this work, the new in vivo biomarkers of nephrotoxicity were studied in NRK-52E cells as in vitro-model. However, mRNA expression of KIM-1, one of the best biomarkers in vivo, was not detected in the cells after treatment for 24 or 48 hours with several nephrotoxic model substances (OTA, potassium bromate (KBrO3), cisplatin or cadmium chloride (CdCl2)). In contrast, high basal mRNA expression of other markers (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) was evident even in untreated cells and treatment with nephrotoxins did not further enhance marker gene expression. Only in the case of HO-1, both gene and protein expression were induced by CdCl2, KBrO3 and OTA, and could therefore represent potential markers in screening studies in vitro. In summary, measurement of cytotoxicity was still the most sensitive endpoint of toxicity in vitro. Thus, results from this study do not support the use of the new in vivo-biomarkers as tissue-specific markers of nephrotoxicity in vitro.

Idiosynkratische Leberschädigung durch Arzneimittel (z.B. Diclofenac) stellt trotz ihres seltenen Auftretens eine erhebliche Komplikation in der Arzneimittelentwicklung und -therapie dar. Die zu idiosynkratischen Reaktionen führenden, komplexen chemischen und biologischen Abläufe sind noch weitgehend unklar. Inzwischen wird jedoch vermutet, dass die Toxizität eines Arzneimittels durch Arzneistoff-unabhängige Risikofaktoren, wie Krankheiten, Entzündungsreaktionen, Co-Medikation oder Alkohol, erhöht werden kann. Mögliche Mechanismen könnten hierbei eine vermehrte Bildung reaktiver Metaboliten bzw. eine veränderte zelluläre Stress- und Immunantwort sein. Um tiefere Einblicke in die Bedeutung möglicher Arzneistoff-unabhängiger Risikofaktoren zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss drei verschiedener Stressfaktoren auf die Toxizität von Diclofenac (Dcl) untersucht. Bei diesen Stressfaktoren handelte es sich um Lipopolysaccharid (LPS) und Poly I:C (PIC) zur Simulation einer bakteriellen bzw. viralen Entzündung sowie um Buthionin-Sulfoximin (BSO) zur Depletion zellulären Glutathions. Zusätzlich wurde getestet, ob eine durch Stressfaktoren ausgelöste Erhöhung der Toxizität von Dcl in Ratten mit Veränderungen in der Biotransformation bzw. mit einer Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. Zytokine oder Alarmsignale) einhergeht. Die Kombination einer einwöchigen therapeutisch dosierten Dcl-Behandlung mit einer einmaligen LPS-Dosis erzeugte in den Tieren eine ausgeprägte Hepatotoxizität, die mit erhöhten Aktivitäten der Aminotransferasen im Serum einherging. Diese adversen Effekte konnten jedoch nicht durch LPS oder Dcl alleine, bzw. in Kombination mit PIC oder BSO erzeugt werden. Es besteht die Annahme, dass die Bioaktivierung von Diclofenac zu 5-OH-Dcl oder Dcl-Acylglucuronid (AG) sowie die folgende Bildung kovalenter Proteinaddukte zur Entwicklung von Lebertoxizität beiträgt. Mittels LC-MS/MS-Messungen konnten wir jedoch nachweisen, dass die Gabe von LPS + Dcl keine erhöhte Bildung reaktiver Metaboliten oder Dcl-AG-abhängiger Proteinaddukte auslöst. Im Einklang damit wurden Enzyme, die für die Bio-aktivierung von Dcl zu reaktiven Metaboliten verantwortlich sind (z.B. Cyp2C11, Cyp2C7 und UGT2B1), sowie die MRP-Effluxtransporter der Leber durch die Co-Behandlung mit LPS in ihrer Genexpression gehemmt. Zusätzliche qRT-PCR-Analysen Nrf2-abhängiger Gene, als Sensor für elektrophilen oder oxidativen Stress, zeigten keine Hochregulation zytoprotektiver Faktoren und unterstützen die Schlussfolgerung, dass Arzneistoff-unabhängige Stress-faktoren keine erhöhte Bildung toxischer Dcl-Metaboliten auslösen. Schließlich ergaben unsere Analysen, dass eine Aktivierung co-stimulatorischer NFκB- und MAPK-Signalwege mit Hochregulation co-stimulatorischer Faktoren (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, iNOS) und Akkumulation neutrophiler Granulozyten in der Leber sowohl durch Behandlung mit LPS + Dcl als auch mit PIC + Dcl induziert wurde. Nur die Kombination von LPS und Diclofenac bewirkte jedoch darüber hinaus eine massive Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine, Chemokine sowie toxizitätsfördernder Alarmsignale (z.B. IL-1β, TNF-α, CINC-1, HMGB1, LTB4) ins Plasma. Zusätzlich waren schützende negative Feed-back-Mechanismen, wie die Hitzeschockreaktion, in den mit LPS und Dcl behandelten Tieren gehemmt. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass eine metabolische Aktivierung von Dcl bzw. eine Akkumulation reaktiver Dcl-Metaboliten an der Entwicklung idiosynkratischer Leberschädigung nicht ausschlaggebend beteiligt ist. Im Gegensatz zu PIC oder BSO führte in den verabreichten Dosen nur die Gabe von LPS als Stressfaktor zu einer Aktivierung co-stimulatorischer Signalwege sowie zu einer Hemmung protektiver Systeme, wodurch die leberschädigende Wirkung von Dcl potenziert wurde. / Idiosyncratic drug reactions (IDRs) are rare but major complications of drug therapy and development. A basic understanding of the chemical and biological events leading to IDRs is still lacking. However, it appears that drug-independent risk factors may be critical determinants in the response to an otherwise non-toxic drug. It has been speculated that stress factors like an underlying disease, inflammation, co-medication or alcohol may increase reactive metabolite formation and/or alter cellular stress and immune response. Thus, we were interested to determine the impact of various drug-independent stress factors on the toxicity of diclofenac (Dcl), a model drug associated with rare but significant cases of serious hepatotoxicity. We tested the hypothesis that co-treatment with various drug-independent risk factors may enhance Dcl toxicity. These included lipopolysaccharide (LPS) and poly I:C (PIC) simulating bacterial and viral inflammation, respectively, and buthionine sulfoximine (BSO) as a model for cellular glutathione depletion. Additionally, we were interested to understand if stress factor-induced modulation of Dcl toxicity involves alterations in drug metabolism and/or up-regulation of co-stimulatory molecules thought to constitute “danger signals”. Co-treatment of rats repeatedly given therapeutic doses of Dcl for 7 days with a single dose of LPS resulted in severe liver toxicity accompanied by elevated serum aminotransferase activity. Neither LPS nor diclofenac alone or in combination with PIC or BSO had such an effect. It is thought that bioactivation to reactive 5-OH-Dcl or Dcl acyl glucuronides (AG) with subsequent protein adduct formation contribute to Dcl induced liver injury. However, LC-MS/MS analyses did not reveal increased formation of reactive metabolites or Dcl-AG-dependent protein adducts in animals treated with LPS + Dcl. Consistent with this, co-treatment with LPS induced down-regulation of enzymes responsible for Dcl bioactivation to reactive metabolites (e.g. Cyp2C11, Cyp2C7 and UGT2B1), as well as liver MRP efflux transporters. Furthermore, qRT-PCR analyses of Nrf2-dependent genes, as a sensor of electrophilic or oxidative stress, showed no up-regulation of cytoprotective factors, supporting the conclusion that drug-independent stress factors do not enhance formation of toxic Dcl metabolites. Hepatic gene expression analyses revealed activation of NFκB and MAPK pathways with up-regulation of co-stimulatory molecules (IL-1β, TNF-α, CINC-1, iNOS) and accumulation of neutrophil granulocytes in liver tissue by LPS + Dcl as well as by PIC + Dcl. However, only LPS + Dcl lead to extensive release of pro-inflammatory cytokines, chemokines and cytotoxic danger signals (IL-1β, TNF-α, CINC-1, HMGB1, LTB4) into plasma. Furthermore, down-regulation of protective factors (SOD2, HSPs, PGE2) suggested an impairment of negative feedback mechanisms in animals treated with LPS + Dcl. In summary our results show no major role of metabolic Dcl bioactivation or accumulation of reactive Dcl metabolites in the pathogenesis of idiosyncratic hepatotoxicity. In contrast to PIC or BSO only administration of LPS as stress factor lead to activation of co-stimulatory pathways as well as impairment of protective systems, resulting in potentiation of liver toxicity of therapeutic Dcl doses.

In recent decades, the acceptance has steadily increased that oxidative stress plays an important role in the development of chronic diseases, malignant neoplasia and the acceleration of the aging process. As one of the most common chronic diseases, hypertension is often associated with a misregulated renin-angiotensin-aldosterone system that causes chronic oxidative stress. Hypertension is a risk factor for neurological diseases such as vascular dementia (VaD) and many neurological disorders, including VaD, have an ROS-associated or inflammatory component in their etiology. Our group has already demonstrated AT-II-induced genotoxicity in kidney and myocardial cells and tissues. The aim of this dissertation was to investigate a possible association between AT-II and neurodegeneration that is triggered by neuronal genotoxicity of AT-II. First, we showed in two neuronal cell lines that AT-II causes dose-dependent genome damage. Subsequent experiments could attribute this toxicity to NOX-produced superoxide generated after AT-II binding to the AT1R. In addition, AT-II-induced depletion of the most important intracellular antioxidant - glutathione - was demonstrated. In vivo, we were able to show that AT1aR knockout mice after AT-II treatment showed significantly more genome damage in the subfornic organ (SFO) than wild-type mice. The SFO is one of the few structures in the brain with an interrupted blood-brain barrier, which makes it accessible and particularly sensitive to circulating AT-II. In the recent literature, these genome damages were also observed in kidney and heart tissues and prove an additional genotoxicity of AT-II independent of AT1aR and consequently independent of blood pressure. In summary, this work shows that increased AT-II levels in neuronal cells cause genome damage due to NOX-produced superoxide. It is hoped that these results will one day help to decipher the complete development of VaD. / In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird. Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden. In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln.

In dieser Arbeit wird die intraoperative Boost-Bestrahlung mit 9 oder 20 Gy bei Mammakarzinompatientinnen evaluiert. Es werden das onkologische Ergebnis, die bestrahlungsassoziierte Toxizität, das kosmetische Therapieergebnis und die Lebensqualität ausgewertet. Die Analyse bezieht sich auf 124 Fälle im frühen Brustkrebsstadium. / This paper evaluates the use of intraoperative boost irradiation with 9 or 20 Gy in breast cancer patients. The study assesses the oncological outcome, radiation-associated toxicity, cosmetic therapeutic outcome and quality of life. The analysis refers to 124 cases of early-stage breast cancer.

Metalloxidnanopartikel gewinnen eine zunehmend größere Bedeutung aufgrund ihres immer weiter reichenden Einsatzes in verschiedensten Produkten. Somit steigt auch die Wahrscheinlichkeit für den Menschen mit derartigen Partikeln in Berührung zu kommen. Deswegen ist eine Untersuchung der Toxizität derartiger Substanzen unumgänglich, um ein Risikoassessment durchführen zu können. Methoden: Die Zellkultivierung der A549 Zellen erfolgte in RPMI supplementiert mit 10% FKS. Alle Toxizitätstests wurden mit mit FKS supplementiertem Medium und mit RPMI ohne FKS durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellvitalität mit Hilfe des MTT-Tests und das Auftreten von Apoptose und Nekrose mit Hilfe des Annexin-V-Propidiumiodid-Assays bestimmt. Weiterhin wurde die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine Interleukin-1, TNF-α, Eotaxin und MCP-1 durch die Zellen in Zytokin-ELISAs untersucht. Ergebnisse: Zinkoxid Nanopartikel führen zu einer Verringerung der Zellvitalität und lösen überwiegend Nekrosen der verwendeten A549 Zellen aus. Ceroxid Nanopartikel wirken nicht zytotoxisch und lösen weder Apoptose noch Nekrose aus.:0 Referat 1 1 Einleitung 7 1.1 Nanotechnologie – Nutzen und Gefahren 7 1.2 Toxizitätsuntersuchungen von Nanopartikeln 10 1.3 Zielstellung 12 2 Wissenschaftlicher Hintergrund 14 2.1 Eintrittspforten von Nanopartikeln 14 2.1.1 Eintrittspforten von Nanopartikeln in den Organismus 14 2.2 Biologische Reaktionen auf Zellschädigungen 14 2.2.1 Zellzyklus und Wachstumshemmung 14 2.2.2 Apoptose 15 2.2.3 Nekrose 18 2.2.4 Entzündung 20 2.3 Physiko-chemische Eigenschaften von Nanopartikeln im Hinblick auf ihre Wechselwirkung mit Zellen und Organismen 23 2.4 Biologische Wirkungen von Nanopartikeln 28 3 Materialen 33 3.1 Geräte 33 3.1.1 BD FACSCalibur 33 3.1.2 Tecan Infinite Reader M200 35 3.1.3 Sonstige Laborausrüstung 36 3.1.4 Verbrauchsmaterialien 37 3.2 Zellen 38 3.3 Chemikalien 38 3.3.1 Nanopartikel 38 3.3.2 Chemikalien für Zellkultur 39 3.3.3 Sonstige Chemikalien und Kits 39 4 Methoden 41 4.1 Zellkultivierung von A549 41 4.2 Zellaussaat für Versuchsansätze 42 4.3 Nanopartikelpräparation 43 4.3.1 Begriffsbestimmung Ultraschallbehandlung 43 4.3.2 Herstellung der Nanopartikelstammlösungen 43 4.3.3 Nanopartikelpräparation mit FKS 43 4.3.4 Nanopartikelpräparation ohne FKS 44 4.4 Nanopartikelexposition 46 4.5 MTT-Test 46 4.5.1 Theoretische Grundlagen 46 4.5.2 Labortechnische Durchführung 47 4.6 Annexin-V/Propidiumiodid-Assay 47 4.6.1 Prinzip der Annexin-V/Propidiumiodid-Färbung 47 4.6.2 Labortechnische Durchführung 49 4.6.3 Datenauswertung 49 4.7 Zytokin-ELISAs 52 4.7.1 Prinzip eines Enzyme-Linked-Immunsorbent-Assay (ELISA) 52 4.7.2 Labortechnische Durchführung der Zytokin-ELISAs 54 4.8 Statistische Auswertung 55 5 Ergebnisse 56 5.1 Dispergierung der Nanopartikel 56 5.2 Nanotoxizität von Zinkoxid 57 5.2.1 Nanotoxizität von Zinkoxid in Anwesenheit von FKS 57 5.2.2 Nanotoxizität von ZnO in Abwesenheit von FKS 63 5.3 Nanotoxizität von Ceroxid 72 5.3.1 Nanotoxizität von Ceroxid in Anwesenheit von FKS 72 5.3.2 Nanotoxizität von Ceroxid in Abwesenheit von FKS 76 6 Schlussfolgerungen und Diskussion 82 6.1 Herstellung homogener Nanopartikeldispersionen 82 6.2 Zinkoxid Nanopartikel wirken zytotoxisch auf A549 Zellen 85 6.3 Die Abwesenheit von FKS im Medium verstärkt die Effekte der ZnO NP 88 6.4 Die primäre und sekundäre Partikelgröße von ZnO-NP hat keinen Einfluss auf ihre Zytotoxizität 89 6.5 Ceroxid Nanopartikel wirken nicht zytotoxisch 90 6.6 Spezifisches Gefährdungspotential von Nanomaterialien 92 7 Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit 96 8 Lebenslauf 97 9 Danksagung 98 10 Anhang 99 10.1 Abkürzungsverzeichnis 99 10.2 Abbildungsverzeichnis 100 10.3 Literaturverzeichnis 102

The toxicity of 36 aliphatic amines on the embryos of the zebrafish Danio rerio were investigated. The DarT (Danio rerio Toxicity assay) was used to determine the lethal concentrations within a 48 h static acute toxicity test. A QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) was performed using the LC50 values and molecular descriptors such as lipophilicity, maximum positive charge on hydrogen atom and the effective diameter of the molecule. In general, the toxicity of primary and secondary amines could be described by the lipophilicity as descriptor. The toxicity of the tertiary amines tested could be only described by a bilinear regression model. Further, regression models for other aquatic species such as the fathead minnow Pimephales promelas, Daphnia magna and Tetrahymena pyriformis showed that the toxicity of each species is a good predictor for each other.

Die kovalente Bindung von elektrophilen körperfremden Stoffen an nukleophile Zentren in Peptiden und Proteinen ist der initiierende molekulare Schritt einer Vielzahl von Erkrankungen und toxischen Prozessen. Für a,b-ungesättigte Aldehyde, Ketone und Ester, die sogenannten Michael-Akzeptoren, spielt dabei die Reaktion mit endogenen Thiolen eine entscheidende Rolle. Für diese Stoffklasse ermöglicht die Quantifizierung der Thiolreaktivität (als logaritmische Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung der Reaktion des Michael-Akzeptors mit dem Tripeptid Glutathion (GSH), log kGSH) eine Vorhersage der akuten aquatischen Toxizität gegenüber den Ciliaten Tetrahymena Pyriformis (quantifiziert als logaritmische 50%-Effekt-Konzentration (effect-concentration, EC) der Wachstumsinhibition, log EC50). Zum besseren Verständnis der an diesen Prozessen beteiligten Reaktionen wurden in dieser Arbeit mehrere mögliche Mechanismen der Addition von Methylthiol an a,b-ungesättigte Carbonylverbindungen quantenchemisch anhand ihrer Übergangszustände untersucht. Dabei lag der Fokus unter anderem auf der Identifikation einer Modellreaktion, deren Barriere eine quantitative Vorhersage der Thiolreaktivität ermöglicht. Entsprechende Regressionsmodelle wurde an experimentelle Daten angepasst. Auf der Basis der berechneten elektrophilen Reaktivität log kGSH und der Hydrophobie (quantifiziert als logarithmischer Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, log Kow) wurden Stoffklassenspezifische Regressionsmodelle zur Toxizitätsvorhersage entwickelt und für die Untergruppe der Ester eine Modell-Suite etabliert.

Die kovalente Bindung von elektrophilen körperfremden Stoffen an nukleophile Zentren in Peptiden und Proteinen ist der initiierende molekulare Schritt einer Vielzahl von Erkrankungen und toxischen Prozessen. Für a,b-ungesättigte Aldehyde, Ketone und Ester, die sogenannten Michael-Akzeptoren, spielt dabei die Reaktion mit endogenen Thiolen eine entscheidende Rolle. Für diese Stoffklasse ermöglicht die Quantifizierung der Thiolreaktivität (als logaritmische Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung der Reaktion des Michael-Akzeptors mit dem Tripeptid Glutathion (GSH), log kGSH) eine Vorhersage der akuten aquatischen Toxizität gegenüber den Ciliaten Tetrahymena Pyriformis (quantifiziert als logaritmische 50%-Effekt-Konzentration (effect-concentration, EC) der Wachstumsinhibition, log EC50). Zum besseren Verständnis der an diesen Prozessen beteiligten Reaktionen wurden in dieser Arbeit mehrere mögliche Mechanismen der Addition von Methylthiol an a,b-ungesättigte Carbonylverbindungen quantenchemisch anhand ihrer Übergangszustände untersucht. Dabei lag der Fokus unter anderem auf der Identifikation einer Modellreaktion, deren Barriere eine quantitative Vorhersage der Thiolreaktivität ermöglicht. Entsprechende Regressionsmodelle wurde an experimentelle Daten angepasst. Auf der Basis der berechneten elektrophilen Reaktivität log kGSH und der Hydrophobie (quantifiziert als logarithmischer Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, log Kow) wurden Stoffklassenspezifische Regressionsmodelle zur Toxizitätsvorhersage entwickelt und für die Untergruppe der Ester eine Modell-Suite etabliert.