Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_D.pdf: 11219627 bytes, checksum: b885f7a08525b694c5783c91f122c6c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As plantas, sendo organismos sésseis, desenvolveram um conjunto de mecanismos que possibilitam a adaptação a condições ambientais adversas visando à manutenção da homeostase energética para o desenvolvimento e propagação. Tais respostas valem-se da integração entre a biossíntese de hormônios, ativação de vias gênicas de resposta a estresse e um balanço adequado do uso da energia disponível. Os açúcares, além de serem fontes de carbono e energia, também atuam como moléculas sinalizadoras podendo agir conjuntamente com sinais hormonais na adaptação a estresses bióticos e abióticos e no controle do desenvolvimento. Nesse contexto, diversos estudos apontam para uma importante relação entre o ácido abscísico (ABA), um dos principais hormônios relacionados à resposta a estresses, e a glicose. A sinalização por ABA, além de atuar sobre a regulação da transcrição, é conhecida por envolver fatores de controle de estabilidade do RNAm. Contudo, a participação destes mecanismos em respostas mediadas por glicose ainda é pouco explorada. Num primeiro momento, o presente trabalho visou avaliar o potencial das participações de regulações pós-transcricionais em resposta a ABA e glicose em Arabidopsis thaliana, através da determinação do perfil de expressão de RNAm após a inibição da transcrição. Um modelo experimental com condições de inibição de transcrição otimizadas foi estabelecido e utilizado para análise de transcriptoma por microarranjos CATMA em resposta à glicose e ABA. Um total de 962 genes foi identificado como diferencialmente expresso após os tratamentos, sugerindo uma possível regulação pós-transcricional por glicose sobre 204 transcritos, por ABA sobre 245 e pela combinação dos dois sinais sobre 513 transcritos. Esses genes foram classificados de acordo com o Gene Ontology, sugerindo uma relação importante com respostas adaptativas a condições de estresse. Aparentemente, as respostas mediadas por glicose e ABA seguem estratégias opostas, sendo que as respostas pós-transcricionais por ABA podem também atuar como um mecanismo rápido de retro-regulação negativa sobre a via central de sinalização desse hormônio, uma forma de dessensibilizar e reiniciar as respostas da via. Na segunda parte deste trabalho, levando em consideração as evidências do envolvimento do controle de estabilidade de RNAm na sinalização por glicose, foi avaliada a participação da via de regulação por microRNAs (miRNAs) em respostas mediadas por esses sinal durante os estágios iniciais de desenvolvimento da planta. Os mutantes ago1-25 e hyl1-2, deficientes em atividade e biossíntese de miRNAs, respectivamente, apresentaram hipossensibilidade à glicosedurante um determinado período do desenvolvimento da planta, entre a germinação e o estabelecimento. Tal resultado levanta a possibilidade de que a via dos miRNAs participa do atraso do desenvolvimento mediado por glicose. Visando compreender quais miRNAs poderiam estar envolvidos, análise de expressão em larga escala por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) de 200 precursores de miRNAs (pri-miRs) em resposta a glicose foi conduzida, apontando para uma potencial regulação sobre 38 deles, vários dos quais já são conhecidos por participarem direta ou indiretamente do controle de desenvolvimento da planta. Aparentemente, a deficiência na maquinaria de miRNAs leva a um desbalanço nas regulações de genes responsivos à glicose durante os primeiros estágios de desenvolvimento / Abstract: Plants, as sessile organisms, have developed a set of mechanisms that allow efficient adaptation to adverse environmental conditions. These processes rely on the integration of hormone biosynthesis, activation of stress-responsive pathways and on a balanced use of the available energy. Sugars, besides their role as carbon and energy sources, may also function as signaling molecules that may act together with hormonal signals to trigger adaptive responses to biotic and abiotic stresses. In this context, several studies have indicated an important relation between abscisic acid (ABA), one of the major hormones related to abiotic stresses responses, and glucose. ABA signaling, besides its function over transcription control, is known to involve factors regulating the stability of mRNAs. However, the importance of glucose-mediated mRNA decay control is essentially unknown. Our work intended to evaluate the potential of the participation of post-transcriptional regulations in response to ABA and glucose in Arabidopsis thaliana, by determining mRNA profile alteration in response to these signals after transcription inhibition. An experimental model which optimizes the conditions for transcription inhibition was established and used for transcriptome profiling with CATMA microarrays. A total of 962 genes were found to be differentially expressed after the treatments, suggesting a possible post-transcriptional control acting upon 204, 245 and 513 transcripts in response to glucose, ABA and the combination glucose + ABA, respectively. The genes were classified by their functions according to Gene Ontology, suggesting a close relation with adaptive response to stress conditions. Apparently, ABA- and glucose-mediated control of mRNA stability follows two opposite strategies, while ABA post-transcriptional responses may also act as a fast negative feedback mechanism over its own core signaling pathway, as a way to desensitize and reset the pathway responses. The second part of this work focused on the participation of microRNAs (miRNAs) pathway in responses mediated by glucose during plant early developmental stages. The mutants ago1-25 and hyl1-2, which are deficient in miRNA activity and biogenesis, respectively, showed hyposensitivity to glucose during a narrow time window of early plant development, between germination and seedling establishment. Such result raises the possibility that miRNA pathway may be involved in the glucose-mediated delay of early seedling development. To obtain further evidences about which miRNAs could be involved, the expression profile of 200 pri-miRs was evaluated by large-scale quantitative real-timepolymerase chain reaction (qRT-PCR) profiling, indicating that 38 pri-miRNA are potentially regulated by glucose, several of which are known to participate directly or indirectly in plant development. The data indicate that deficiency in miRNA machinery leads to an imbalance on glucose control over gene expression during early seedling development / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1) possui 17 éxons e seu transcrito primário pode sofrer splicing alternativo, havendo, entre outros eventos, possibilidade de exclusão ou inclusão do éxon 12. O produto da expressão do FMR1, a proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), possui papéis importantes no sistema nervoso central, atuando como repressora da tradução de RNAm em espinhas dendríticas e controlando a síntese de proteínas envolvidas na função sináptica. Entre dois domínios centrais do tipo KH presentes na FMRP, o segundo (KH-2) é responsável pela interação da proteína aos polissomos. O domínio KH-2 é codificado pelos éxons 9 a 13 do FMR1 e possui a alça variável mais longa já observada entre proteínas humanas, que é codificada pelos éxons 11 e 12. A inclusão do éxon 12 no RNAm do FMR1 causa uma extensão em fase dessa alça variável do KH-2 da FMRP. Estas isoformas apresentam expressão significativa em neurônios cortico-cerebrais e cerebelares do rato, no primeiro mês pós-natal. Este trabalho baseia-se em resultados prévios do grupo de pesquisa, em que se identificaram sequências curtas no íntron 12 do FMR1, com potencial para agir como acentuadores de splicing. Baseando-nos na hipótese de que essas sequências constituem elementos transcritos que se ligam a fatores proteicos do núcleo celular, potencialmente reguladores do splicing do pré-RNAm do FMR1, realizamos ensaios de precipitação por afinidade com extratos nucleares de córtex cerebral de rato e transcritos do loco, biotinilados. Análises por espectrometria de massas revelaram enriquecimento de proteínas nucleares, contendo domínios de ligação a RNA, principalmente aquelas relacionadas à regulação e processamento de pré-RNAm, sobretudo o splicing / Fragile X Mental Retardation 1 gene (FMR1) comprises 17 exons. Its primary transcript is subject to alternative splicing, allowing for the possibility of exon 12 inclusion or skipping, among other events. The product of FMR1 gene expression, fragile X mental retardation protein (FMRP), has important roles in the central nervous system, acting as a translational repressor in dendritic spines, thus controlling the synthesis of proteins involved in synaptic function. FMRP has two central KH domains. One of them (KH-2) is responsible for its interaction with polysomes. The KH-2 domain is encoded by FMR1 exons 9 to 13. It contains the longest variable loop ever observed among human KH-containing proteins, which is encoded by FMR1 exons 11 and 12. Exon-12 inclusion in FMR1 mRNA causes an in-frame extension of FMRP KH-2 domain variable loop. These isoforms appear significantly expressed in cortico-cerebral and cerebellar neurons of the rat in the first month after birth. We have previously identified short sequences within FMR1 intron 12 that may potentially act as splicing enhancers. Our study is based on the hypothesis that those sequences when transcribed should bind to nuclear protein factors that may function as FMR1 exon 12 pre-mRNA splicing regulators. To initiate an experimental approach to test that hypothesis, we conducted affinity precipitation assays with rat cerebral cortex nuclear extracts and biotinylated transcripts. Mass spectrometry analyses disclosed proteins that have been described to be enriched in the cell nucleus, contain RNA-binding domains, and be functionally related to pre-mRNA processing, notably splicing

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral. / This work shows, for the fIrst time, the involvement of the RECK gene in cell cycle progression. Our data shows that the RECK gene product regulates cell cycle progression by altering the G1 to S transition. Also, we show that RECK is able to induce p21 expression and, consequently, lead to hypophosphorylation of the Rb protein, revealing at least one molecular mechanism through which RECK modulates the cell cycle progression. It has been described that induction of the c-Myc transcription factor promotes cell proliferation and cell transformation by regulating several genes that are involved in cell cycle progression. Here, we show that activation of a Mycestrogen receptor fusion protein with 4-hydroxytamoxifen in mouse fibroblasts was suffIcient to repress the expression of the RECK gene, by acting at the RECK promoter region. In addition, we show that Myc-responsiveness seems to be mediated by the upstream Sp1 sites and to be dependent on cromatin remodelling mechanisms. RECK gene expression was aIso evaluated during human glioma progression. Our results indicate that RECK gene expression is not altered during glioma progresslOn, but a correlation was found between the abundance of RECK expression in gliomas and patient survival. The levels of RECK expression can be considered a good prognostic indicator for glioma patients. Better understanding of RECK gene regulation may contribute to uncover the mechanisms of cell cycle and tumor progression, and to the development of new strategies for cancer prevention and therapeutic intervention.