Nesta tese propomos um modelo estocástico multimodal para regulação da expressão gênica em nível de transcrição. A definição de um espaço de parâmetros que contém o conteúdo biológico do sistema aliada à escolha apropriada de uma base para construir a matriz de acoplamento entre os estados do sistema levaram à obtenção de soluções exatas do modelo. Tais soluções são obtidas transformando as equações mestras em equações diferenciais parciais usando a técnica das funções geradoras e escrevendo os coeficientes das equações parciais em termos dos parâmetros biológicos do modelo. No regime estacionário obtivemos uma relação de recorrência para os coeficientes das séries de potências que definem as funções geradoras e a especificação das configurações de equilíbrio do sistema permite que estas séries sejam calculadas exatamente. Com as soluções exatas calculadas não só as distribuições de probabilidade foram obtidas como os momentos das distribuições. As distribuições de probabilidade de equilíbrio apresentam estruturas multimodais com vários picos e a análise do ruído (flutuação) mostra que a existência de um estado intermediário de eficiência transcricional leva a redução do ruído global do sistema. A inspeção dos autovalores da matriz de acoplamento mostrou que existem regiões onde a dinâmica dos momentos é de caráter oscilatória com amortecimento. Diferentes esquemas de acoplamento levam à diferentes regimes transientes, tal característica revela que o sistema multimodal apresentam maior flexibilidade adaptativa quando comparado com sistemas de um ou dois estados. / In this thesis we propose a stochastic model for multimodal regulation of gene expression at the transcriptional level. The definition of a parameter space that contains the contents of the biological system coupled with the appropriate choice of a base to build the coupling matrix between the states of the system led to the exact solutions of the model. Such solutions are obtained by transforming master equations in partial differential equations using the technique of generating functions and writing the coefficients of partial equations in terms of biological parameters of the model. In the steady a recurrence relation for the coefficients of power series defining the generating functions was obtained and specification of the equilibrium configurations of the system allows the exact calculation of these series. With the exact solutions calculated not only the probability distributions were obtained but also the moments of the distributions. The equilibrium distributions probability is multimodal and presents several peaks. Analysis of the noise (fluctuation) shows that the existence of an state with intermediate transcriptional efficiency leads to a reduction of the overall system noise. Inspection of the eigenvalues of the coupling matrix showed that there are regions where the dynamics of the moments is damped oscillating. Different coupling schemes lead to different transient regimes, this feature reveals that the multimodal system have greater adaptive flexibility when compared to systems of one or two states.

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.

Submitted by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:05:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Approved for entry into archive by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / As células-tronco (CTs) caracterizam-se por possuírem a capacidade de se autorrenovar e de dar origem a um ou mais tipos celulares diferenciados. Nos últimos anos, diversos trabalhos mostraram a existência de CTs em tecidos adultos, tornando-as uma alternativa interessante para uso em terapias celulares. Contudo, para melhor utilizar as CTs, é preciso primeiramente compreender como ocorre a diferenciação em um tipo celular específico e, principalmente, como é regulada a expressão gênica durante este processo. Em 2009, Ingolia e colaboradores apresentaram uma nova técnica conhecida como ribosome profiling, a qual consiste no isolamento e sequenciamento em larga escala dos fragmentos de RNA associados e protegidos pelos ribossomos, os quais têm um tamanho aproximado de 30 nucleotídeos (conhecido com footprint ribossomal). Ao mapear as sequências obtidas, é possível obter informações não apenas sobre quais sequências estão sendo traduzidas, mas também sobre a cinética da tradução e sua extensiva rede de regulação. Assim, o objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de ribosome profiling ao estudo do processo de diferenciação de CTs adultas. Como modelo de estudo, foram utilizadas CTs obtidas de tecido adiposo antes (t=0) e após a indução para diferenciação adipogênica por 3 dias (t=72h). O primeiro passo do trabalho foi a adaptação do protocolo de ribosome profiling para o estudo de CTs adultas, o qual consiste na lise celular, digestão do lisado com uma RNA nuclease (a qual irá degradar o RNA exposto, preservando os fragmentos protegidos pelo ribossomo), ultracentifrugação do homogenato sobre colchão de sacarose 1 M para sedimentação dos ribossomos, extração de RNA e isolamento dos fragmentos de 30 nucleotídeos. Também foi feita extração do RNA poliA. As amostras foram sequenciadas (SOLiD™) e os dados obtidos foram triados e mapeados contra um banco de dados de RNAm, utilizando-se a ferramenta CLC Genomics Workbench. Foram identificados mais de 8.000 transcritos para as amostras de ribosome profiling e mais de 17.000 para as de poliA. Ao calcular o fold change entre as condições t=0 e t=72h, foi possível verificar que mais de 50% dos genes foram detectados como diferencialmente expressos apenas por ribosome profiling. Observou-se que genes relacionados com vias de diferenciação adipogênica e de metabolismo de lipídeos encontravam-se regulados positivamente em ambas as amostras de RNA. Por outro lado, observou-se que vias de regulação do citoesqueleto de actina e de adesão focal estavam reguladas negativamente apenas nas amostras de ribosome profiling. Isso é interessante, uma vez que a inibição destas vias já foi descrita como importante para o processo de adipogênese. Além disso, foi observada uma forte redução na eficiência de tradução de genes relacionados com a tradução após 72 horas de indução para diferenciação. Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam as evidências de que os mecanismos de regulação pós-transcricionais e traducionais têm um papel muito importante na regulação da diferenciação celular de CTs, sendo que a técnica de ribosome profiling permitiu obter informações mais detalhadas de como este processo pode estar acontecendo. / Stem cells (SC) are characterized by their capacity of both self-renewing and giving rise to new differentiated cells. SC are found in adult tissues, which are considered a putative source for cell therapy. However, little is known about the mechanisms involved in the trigger of SCs differentiation into a specific cell type. Understanding adult SCs differentiation process is a fundamental step to better use and to take advantage of their potential. In 2009, Ingolia and collaborators presented a new methodology of transcriptome analysis named ribosome profiling, which consists on the isolation and deep-sequencing of the mRNA fragments enclosed by ribosomes. When lysed cells are submitted to nuclease digestion, unprotected mRNA is degraded, while fragments within ribosomes are preserved and have a known footprint of 30 nucleotides. Sequencing these ribosome-protected fragments results in a high-precision measurement of in vivo translation, providing precise information about translation kinetics and its extensive regulation. The objective of this work was to apply the ribosome profiling methodology to the study of adipogenic differentiation in adult SCs. SCs were isolated from human adipose tissue from three donors and were cultured in a control medium (t=0) and induced to adipogenic differentiation for 72 hours (t=72h). The first step was to adapt and optimize the ribosome profiling protocol to the SC model, which consists in cell lysis, cell lysate digestion by nuclease (to degrade unprotected RNA, preserving ribosome-protected fragments), ultracentrifugation over a 1M sucrose cushion to pellet ribosomes, RNA extraction and 30 nucleotides fragments isolation. poliA RNA was also isolated. Samples were submitted to deep-sequencing (SOLiD™) and the reads obtained were trimmed and mapped onto the reference mRNA database using the CLC Genomics Workbench. Over 8000 transcripts were identified in ribosome profiling samples and over 17000 in poliA samples. Fold change analysis between t=0 and t=72h of both RNA samples showed that differential expression of more than 50% of the genes was identified only by ribosome profiling. Pathways related to adipogenesis and lipid metabolism were upregulated in both RNA samples. However, regulation of the actin cytoskeleton and focal adhesion proteins were downregulated only in ribosome profiling samples. Interestingly, downregulation of these pathways was already described as an important phenomenon to cell adipogenesis. Besides, we observed a strong reduction of translational efficiency of genes involved in translation at t=72h. Our results reinforce previous data, suggesting that posttranscriptional and translational regulation play a fundamental role in the regulation of SC differentiation process and that ribosome profiling is an important tool to better understand this process.

Submitted by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T16:24:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) / Approved for entry into archive by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / Células-tronco (CT) são células autorrenováveis e não especializadas, com o potencial de diferenciação multidirecional. Células-tronco de tecido adiposo (CT-TA) são um tipo de células-tronco adultas multipotentes, de fácil isolamento e cultura. Nos últimos anos, CT-TA têm mostrado grande potencial para engenharia de tecidos e terapias baseadas em células. Apesar do interesse em aplicações clínicas deste tipo de célula, os mecanismos moleculares fundamentais a sua autorrenovação e diferenciação ainda não foram completamente elucidados. miRNAs são pequenos RNAs não-codificadores, com 21-25 nucleotídeos de comprimento, que tem se mostrado como importantes reguladores da expressão gênica em nível póstranscricional. miRNAs podem atuar por meio de clivagem direta de mRNAs alvo ou através da repressão da tradução, dependendo da complementaridade entre o mRNA e a sequência do miRNA. Perfis de miRNAs de CT adultas sugerem que estes pequenos reguladores podem contribuir para as propriedades intrínsecas das CT. Para entender melhor os mecanismos de ação dos miRNAs em CT-TA, miRNAs associados ao polissomos de CT-TA foram isolados durante a diferenciação celular. Procurando miRNAs reguladores das etapas iniciais de diferenciação ou envolvidos na autorrenovação de CT, as culturas de células foram induzidas a diferenciação adipogênica durante 72 h. O lisado celular foi submetido à ultracentrifugação em gradiente de sacarose para separar monosomos, polissomos e fração livre de ribossomos. O RNA total associado aos ribossomos foi extraído, os fragmentos de RNA (<200 nt) foram enriquecidos e a seleção de tamanho de fragmentos de RNA apropriados ocorreu durante a preparação das amostras para o sequenciamento em larga escala. As amostras foram sequenciadas utilizando a plataforma SOLiD ™, e as frações polissomais de culturas Não Induzida e 72h de indução foram comparadas e dezesseis miRNAs foram identificados. miRNAs encontrados em um trabalho prévio do grupo foram adicionados a esses dados, e sete miRNAs (hsamiR-29b-1-5p, hsa- miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210- 5p e hsa-miR-6775- 5p) foram testados por RT-qPCR para confirmar a expressão diferencial, sendo que um deles (hsa-miR-210-5p) mostrou diferença estatisticamente significativa. / Stem cells (SC) are self-renewing and non-specialized cells with the potential of multi-directional differentiation. Adipose Stem Cell (ADSC) is a type of multipotent adult stem cell, easy to isolate and culture. In the past few years, hADSCs have shown great potential for tissue engineering and cell-based therapies. Despite the interest in clinical applications of this kind of cell, the molecular mechanisms underlying their self-renewal and differentiation have yet to be fully elucidated. miRNAs are small noncoding RNAs, 21-25 nucleotides in length, that have been shown to be important regulators of posttranscriptional gene expression. miRNAs can act through direct cleavage of target mRNAs or through translational repression, depending of complementary pairing between the mRNA and miRNA sequence.miRNA profile of adult SCs suggests that these small regulators can contribute to the intrinsic properties of SCs. To better understand the mechanisms of action of miRNAs in hADSCs, we isolate miRNAs associated to polysomes of hADSC during cellular differentiation. Looking for miRNAs regulators of early steps of differentiation or involved in ADSC self-renewing, cell cultures were induced to adipogenic differentiation for 72 h. The cell lysate was submitted to ultracentrifugation on a sucrose gradient to separate monosomes, polysomes and the fraction free of ribosomes. The total RNA associated to ribosomes was extracted and the RNA fragments (<200 nt) were enriched and the size selection of appropriate RNA fragments occurred during the preparation of samples for deep sequencing. The samples were sequenced using SOLiD™ platform, and polysomal fraction of cell cultures non induced and 72h of induction were compared and sixteen miRNAs were identified. miRNAs found in a previous work of our group were added to these data and seven miRNAs (hsa-miR-29b-1-5p, hsa-miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR- 143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210-5p e hsa-miR-6775-5p) were tested by RTqPCR to confirm differential expression, and one of them (hsa-miR-210-5p) showed statistical significant difference.

Orientador: Ney Lemke / Resumo: MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas. Em geral, os miRNAs são conservados no genoma de eucariotos, sendo considerados elementos vitais em diversos processos biológicos durante o desenvolvimento, tais como crescimento, diferenciação e morte celular. A grande diversidade de miRNAs identificados está restrita a poucas espécies e apenas uma parte do total de alvos de miRNAs preditos foi caracterizada funcionalmente. Nesse contexto, o uso da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento (high throughput sequencing) atrelada à análise de nível transcricional por RT-qPCR possibilitam a identificação do microRNoma. A tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, é considerada um excelente modelo biológico para o estudo de miRNAs em vertebrados devido à sua importância econômica e evolutiva. O presente trabalho teve como objetivos: organizar os dados do sequenciamento dos miRNAs da tilapia do Nilo; disponibilizá-los em forma de uma base de dados para a comunidade científica; integrar as informações dos miRNAs identificados com outros bancos de dados de miRNAs; analisar os dados através de análises de bioinformática para determinação de agrupamentos definidos pelo nível de expressão de cada miRNA em seis tipos de tecido (músculo branco, músculo vermelho, testículo, ovário, fígado, olho, cérebro e coração) com distinção entre os gêneros e nas fases do desenvolvimento (2,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Nesta tese propomos um modelo estocástico multimodal para regulação da expressão gênica em nível de transcrição. A definição de um espaço de parâmetros que contém o conteúdo biológico do sistema aliada à escolha apropriada de uma base para construir a matriz de acoplamento entre os estados do sistema levaram à obtenção de soluções exatas do modelo. Tais soluções são obtidas transformando as equações mestras em equações diferenciais parciais usando a técnica das funções geradoras e escrevendo os coeficientes das equações parciais em termos dos parâmetros biológicos do modelo. No regime estacionário obtivemos uma relação de recorrência para os coeficientes das séries de potências que definem as funções geradoras e a especificação das configurações de equilíbrio do sistema permite que estas séries sejam calculadas exatamente. Com as soluções exatas calculadas não só as distribuições de probabilidade foram obtidas como os momentos das distribuições. As distribuições de probabilidade de equilíbrio apresentam estruturas multimodais com vários picos e a análise do ruído (flutuação) mostra que a existência de um estado intermediário de eficiência transcricional leva a redução do ruído global do sistema. A inspeção dos autovalores da matriz de acoplamento mostrou que existem regiões onde a dinâmica dos momentos é de caráter oscilatória com amortecimento. Diferentes esquemas de acoplamento levam à diferentes regimes transientes, tal característica revela que o sistema multimodal apresentam maior flexibilidade adaptativa quando comparado com sistemas de um ou dois estados. / In this thesis we propose a stochastic model for multimodal regulation of gene expression at the transcriptional level. The definition of a parameter space that contains the contents of the biological system coupled with the appropriate choice of a base to build the coupling matrix between the states of the system led to the exact solutions of the model. Such solutions are obtained by transforming master equations in partial differential equations using the technique of generating functions and writing the coefficients of partial equations in terms of biological parameters of the model. In the steady a recurrence relation for the coefficients of power series defining the generating functions was obtained and specification of the equilibrium configurations of the system allows the exact calculation of these series. With the exact solutions calculated not only the probability distributions were obtained but also the moments of the distributions. The equilibrium distributions probability is multimodal and presents several peaks. Analysis of the noise (fluctuation) shows that the existence of an state with intermediate transcriptional efficiency leads to a reduction of the overall system noise. Inspection of the eigenvalues of the coupling matrix showed that there are regions where the dynamics of the moments is damped oscillating. Different coupling schemes lead to different transient regimes, this feature reveals that the multimodal system have greater adaptive flexibility when compared to systems of one or two states.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-12T18:06:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-13T10:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-13T10:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional expression regulation by inducing mRNA degradation or translation inhibition. Some miRNAs are known to regulate HLA-G expression, an important immunemodulatory molecule that inhibits both Natural Killer and cytotoxic T cells through interaction with inhibitory receptors. The HLA-G is associated with maternal-fetal tolerance, tissue acceptance in transplants and the progression of tumors. The mechanisms underlying HLA-G expression control are not completely understood, however, its 3’untranslated region (3’UTR) is reported to play an important role on gene regulation influencing mRNA stability and interacting with miRNAs such as miR-148a-3p. In this study, we performed a systematic analysis of all miRNAs that are good candidates to act as HLA-G regulators. In order to determine the miRNAs with the highest potential to influence HLA-G expression, we compared the outputs of three distinct algorithms - miRanda, RNAhybrid and Pita. For this purpose, a method of miRNA inference was developed using Perl scripts to compare and filter results and a scoring system was created in order to evaluate both the binding stability of the miRNA/mRNA interaction and the miRNA specificity to its target sequence. Then, a panel of miRNAs with great potential of controlling HLA-G expression was generated. / MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional por meio da degradação da molécula de RNA mensageiro ou da inibição da tradução. Alguns miRNAs foram relatados como sendo responsáveis pela regulação da expressão do gene HLA-G, um importante imunomodulador que inibe a ação de células Natural Killer e células T citotóxicas ao interagir com receptores inibitórios. Este gene está associado à tolerância maternofetal, aceitação de tecidos após transplantes e progressão de tumores. Os mecanismos subjacentes à regulação da expressão de HLA-G não foram completamente elucidados, mas sabe-se que sua região 3’ não traduzida (3’NT) possui um papel importante na regulação gênica tanto por manter a estabilidade da molécula de mRNA quanto por interagir com miRNAs como miR-148a-3p. Neste estudo, foram inferidos miRNAs que são bons candidatos para atuarem como reguladores do gene HLA-G. Para determinar os miRNAs com o maior potencial de operarem no controle pós-transcricional dos níveis de HLA-G, comparamos os resultados de três algoritmos distintos – miRanda, RNAhybrid e Pita. Para tanto, foi desenvolvida uma estratégia de inferência de miRNAs que utiliza scripts em Perl para comparação e filtragem dos dados e um sistema de pontuação que permite avaliar tanto a estabilidade da interação miRNA/mRNA quanto a especificidade do miRNA à sua sequência alvo. Assim, um painel confiável de miRNAs com grande possibilidade de influenciar a expressão de HLA-G foi gerado considerando as regiões polimórficas e não polimórficas da região 3’NT do gene HLA-G individualmente.

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Já foram identificadas mais de 30 CDKs humanas. A CDK10 é uma proteína quinase dependente de ciclina pertencente ao grupo de quinases relacionadas à Cdc2. CDK10 é essencial na fase G2/M do ciclo celular, possivelmente no progresso dessa fase, monitorando a replicação completa do DNA e permitindo que as células passem desse ponto de restrição. Essa proteína é um importante determinante de resistência à terapia endócrina para câncer de mama. Portanto, é um alvo potencial para o desenvolvimento de inibidores, uma vez que está presente em células cancerosas. O estudo da estrutura e função da CDK10 deverá ser realizado após sua clonagem, expressão e purificação. O cDNA da CDK10 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), e posteriormente, o produto foi aplicado em gel de agarose para análise e purificação. O vetor de clonagem recombinante foi obtido, o qual foi clonado em células competentes e sequenciado. A obtenção do plasmídeo recombinante para expressão deu-se pela inserção do DNA nos vetores de expressão pET28a(+) e pET23a(+) (Novagen). A proteína foi expressa em células competentes e analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, a proteína obtida foi purificada em coluna de afinidade por níquel e em coluna de afinidade por ATP. Com a otimização dos resultados obtidos, será possível, futuramente, caracterizar bioquimicamente a CDK10 e elucidar suas estruturas secundária e terciária. O estudo da CDK10 irá contribuir para o entendimento da sua relação estrutura-função e sua relação com oncogenes e supressores de tumor, e o estudo estrutural para o desenvolvimento de inibidores químicos de baixo peso molecular que possa inibir especificamente a CDK10. / Cyclin-dependent kinases (CDKs) comprise a family of proteins that can be subdivided into two major groups based on their functional role in cell cycle and / or transcriptional control. Over 30 human CDKs have been identifies. CDK10 is a cyclin-dependent kinase protein that belongs to the cdc2-related kinases group. CDK10 is essential in phase G2 / M of the cell cycle, possibly in the progress of this phase, monitoring the complete DNA replication and allowing the cells to pass through this restriction point. This protein is an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Therefore, it is a potential target for the development of inhibitors, since it is present in cancerous cells. The study of the structure and function of CDK10 must be performed after its cloning, expression and purification. cDNA of CDK10 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then the product was applied into agarose gel for analysis and purification The cloning vector was obtained, which was cloned into competent cells and sequenced. The obtaining of the recombinant plasmid for expression was due to the insertion of DNA into expression vectors pET28a(+) and pET23a(+) (Novagen). The protein was expressed in competent cells and analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Then, the obtained protein was purified by nickel affinity column and ATP affinity column. With the optimization of the results obtained, it will be possible, in the future, to biochemically characterize CDK10 and elucidate its secondary and tertiary structures. The study of CDK10 will contribute to the understanding of its structure-function relationship and its relationship with oncogenes and tumor suppressors, and the structural study for the development of low molecular weight chemical inhibitors that can specifically inhibit CDK10. The structural studies will contribute to the development of chemical inhibitors of low molecular weight that may this and other CDKs.

A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. / In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

O gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1) possui 17 éxons e seu transcrito primário pode sofrer splicing alternativo, havendo, entre outros eventos, possibilidade de exclusão ou inclusão do éxon 12. O produto da expressão do FMR1, a proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), possui papéis importantes no sistema nervoso central, atuando como repressora da tradução de RNAm em espinhas dendríticas e controlando a síntese de proteínas envolvidas na função sináptica. Entre dois domínios centrais do tipo KH presentes na FMRP, o segundo (KH-2) é responsável pela interação da proteína aos polissomos. O domínio KH-2 é codificado pelos éxons 9 a 13 do FMR1 e possui a alça variável mais longa já observada entre proteínas humanas, que é codificada pelos éxons 11 e 12. A inclusão do éxon 12 no RNAm do FMR1 causa uma extensão em fase dessa alça variável do KH-2 da FMRP. Estas isoformas apresentam expressão significativa em neurônios cortico-cerebrais e cerebelares do rato, no primeiro mês pós-natal. Este trabalho baseia-se em resultados prévios do grupo de pesquisa, em que se identificaram sequências curtas no íntron 12 do FMR1, com potencial para agir como acentuadores de splicing. Baseando-nos na hipótese de que essas sequências constituem elementos transcritos que se ligam a fatores proteicos do núcleo celular, potencialmente reguladores do splicing do pré-RNAm do FMR1, realizamos ensaios de precipitação por afinidade com extratos nucleares de córtex cerebral de rato e transcritos do loco, biotinilados. Análises por espectrometria de massas revelaram enriquecimento de proteínas nucleares, contendo domínios de ligação a RNA, principalmente aquelas relacionadas à regulação e processamento de pré-RNAm, sobretudo o splicing / Fragile X Mental Retardation 1 gene (FMR1) comprises 17 exons. Its primary transcript is subject to alternative splicing, allowing for the possibility of exon 12 inclusion or skipping, among other events. The product of FMR1 gene expression, fragile X mental retardation protein (FMRP), has important roles in the central nervous system, acting as a translational repressor in dendritic spines, thus controlling the synthesis of proteins involved in synaptic function. FMRP has two central KH domains. One of them (KH-2) is responsible for its interaction with polysomes. The KH-2 domain is encoded by FMR1 exons 9 to 13. It contains the longest variable loop ever observed among human KH-containing proteins, which is encoded by FMR1 exons 11 and 12. Exon-12 inclusion in FMR1 mRNA causes an in-frame extension of FMRP KH-2 domain variable loop. These isoforms appear significantly expressed in cortico-cerebral and cerebellar neurons of the rat in the first month after birth. We have previously identified short sequences within FMR1 intron 12 that may potentially act as splicing enhancers. Our study is based on the hypothesis that those sequences when transcribed should bind to nuclear protein factors that may function as FMR1 exon 12 pre-mRNA splicing regulators. To initiate an experimental approach to test that hypothesis, we conducted affinity precipitation assays with rat cerebral cortex nuclear extracts and biotinylated transcripts. Mass spectrometry analyses disclosed proteins that have been described to be enriched in the cell nucleus, contain RNA-binding domains, and be functionally related to pre-mRNA processing, notably splicing