Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-07-29T21:29:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) Previous issue date: 2013 / microRNAs (miRNAs) são uma classe de reguladores pós-transcricionais com aproximadamente 22 nucleotídeos. Estas moléculas regulam a expressão gênica por se ligarem a sequências complementares existentes na região 3’UTR de mRNAs específicos, induzindo sua degradação ou silenciamento. Utilizando abordagens computacionais, nosso grupo de pesquisa identificou 42 novos miRNAs precursores em Schistosoma mansoni, sendo que 5 destes, eram de origem intrônica. Considerando que cerca de metade dos miRNAs humanos conhecidos estão localizados em íntrons de genes codificantes de proteínas e que muitos deles são expressos somente quando o gene é transcrito, levantamos a hipótese de que parte do repertório de miRNAs de S. mansoni poderia ser de origem intrônica. Para investigar esta hipótese foi utilizada a versão 5.1 do genoma deste parasito, bem como analisada o perfil de expressão utilizando a metodologia de qRT-PCR nos seguintes estágios evolutivos do parasito: cercárias, esquistossômulos jovens (3,5 e 24h de cultivo in vitro), vermes adultos, ovos e miracídios. Após a recuperação do arquivo contendo as sequências de íntrons presentes nos genes de S. mansoni, foram recuperadas somente as que continham entre 50 a 120 nucleotídeos e que apresentavam o mínimo de energia livre de ΔG<-25 Kcal/mol, estimado pelo software RNAfold. Essas análises mostraram um conjunto de 38 candidatos a moléculas precursoras de miRNAs. Posteriormente utilizando a ferramenta Mature Bayes foram preditos os miRNAs maduros, e a seguir, utilizados para busca de homologia no o banco de dados miRBase. Os resultados mostraram que os miRNAs preditos não apresentam homólogos no mirBase, levantando a hipótese de que este conjunto seja específico da espécie S. mansoni. A análise do perfil de expressão mostrou que dos 38 miRNAs preditos, 19 apresentaram expressão em pelo menos um estágio evolutivo analisado. Não foram identificados miRNAs estágios específicos, apesar de todos serem diferencialmente expressos. Com relação ao perfil de expressão dos genes hospedeiros, também foi observado uma expressão diferencial entre os estágios analisados. Finalmente para a predição dos alvos, foi utilizado o programa miRanda, evidenciando um conjunto de 993 alvos potenciais, sugerindo que 10% dos genes preditos em S. mansoni poderiam ser regulados por miRNAs. Em conjunto os resultados sugerem que parte dos miRNAs de S. mansoni estão localizados em genes que codificam proteínas. Esta observação levanta uma série de questões interessantes que serão futuramente investigadas __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: microRNAs (miRNAs) are a class of post-transcriptional regulators with approximately 22 nucleotides. These molecules regulate gene expression by interaction to complementary sequences in the 3'UTR region of specific mRNA and inducing its degradation or silencing. Using computational approaches, our research group has identified 42 new miRNAs precursor in Schistosoma mansoni, and 5 of these were of intron origin. Whereas about half of the known human miRNAs are located in introns of protein coding genes and many of them are express only when the gene is transcribed, hypothesized was that part of the miRNAs repertoire in S. mansoni could be intron origin. To investigate this hypothesis we used version 5.1 of this parasite genome and analyzed the expression profile using qRT-PCR methodology in the following evolutionary stages of the parasite: cercariae, schistosomula young (3.5 and 24 hours of in vitro culture), adult worms, eggs and miracidium. After recovery of the file containing the sequence of introns present in the genes of S. mansoni, the sequences that contained between 50 and 120 nucleotides and who had at least ΔG<-25 Kcal/mol free energy, estimated by RNAfold software were recovered. Together, these analyzes revealed a set of 38 miRNA precursor candidates. Subsequently, the software Mature Bayes was used to miRNAs mature candidates and searched for homology using the miRBase database. The results showed that predicted miRNAs have no counter parts in mirBase, suggesting that this miRNA set is S. mansoni species-specific. The expression profile analysis showed that the 38 predicted miRNAs, 19 were expression in at least one developmental stage analyzed. miRNAs were not identified as stage specific expression, despite all being differentially expressed. Regarding the profile of expression of host genes was also observed a differential expression between stages analyzed. Finally for the prediction of targets, we used the software miRanda, revealing a set of 993 potential targets, suggesting that 10% of the predicted genes in S. mansoni could be regulated by miRNAs. Together these results suggest that parts of S. mansoni miRNAs are located in genes that encode proteins. This observation raises a number of interesting questions that will be further investigated.

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:09:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) Previous issue date: 2015 / Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas que afeta milhões de pessoas no mundo. A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos se dá majoritariamente a nível póstranscricional diferindo daquela de outros eucariotos. Apesar de demonstrada a mobilização diferencial de mRNAs em T. cruzi e a importância da regulação pós-transcricional, poucas proteínas de ligação ao RNA foram caracterizadas até o momento. O domínio RNA Recognition Motif (RRM) de ligação ao RNA é um dos mais abundantes domínios encontrados em proteínas de ligação a RNA (RBPs). Proteínas com esse domínio RRM estão envolvidas na maioria dos processos póstranscricionais. RBPs associadas a moléculas de mRNA e outras proteínas regulatórias formam os complexos ribonucleoproteicos (mRNPs), que estão envolvidos na regulação do RNA. Nesse trabalho, reportamos a caracterização de uma proteína de ligação a mRNAs que apresenta domínio RRM, denominada RBSR1. A proteína foi fusionada a uma etiqueta TAP-tagging N-terminal (RBSR1TAP tagging) e os experimentos foram realizados com parasitas transfectados. Ensaios de imunofluorescência, para determinar a localização da proteína, mostraram que a proteína apresenta um padrão de migração entre o núcleo e o citoplasma em diferentes etapas da diferenciação do parasita e que sua expressão é regulada ao longo do ciclo de vida, não sendo expressa em tripomastigotas metacíclicos. O ensaio também foi realizado sob condições de estresse e demonstrou-se a mudança de localização da proteína RBSR1 quando submetida a estresse nutricional e oxidativo. O perfil de polissomos em gradiente de sacarose mostrou que RBSR1, tanto em epimastigotas, quanto sob estresse nutricional, está relacionada a complexos ribonucleoproteicos pesados não associados à tradução. Foram realizados ensaios de imunoprecipitação para identificação dos mRNAs alvos da proteína, seguido de sequenciamento massivo, onde observou-se transcritos que codificam para proteínas ribossomais e também proteínas hipotéticas. Também foi realizada a identificação de proteínas parceiras a RBSR1 por imunoprecipitação de formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento e sob estresse nutricional, seguida de espectrometria de massas. Em epimastigotas em crescimento exponencial foram identificadas 86 proteínas parceiras e sob estresse nutricional 31 proteínas, observou-se alta heterogeneidade das parceiras, a qual pode ser explicada pela mobilidade apresentada por RBSR1 nas diversas formas do parasita. Adicionalmente, foram vistas várias proteínas que se associam a grânulos de RNA, como por exemplo DHH1 e HSP70, e dessa forma é possível que haja a associação de RBSR1 com esses grânulos. O estudo do papel das RBPs na modulação da expressão gênica em tripanossomatídeos pode pavimentar o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias para combater as doenças causadas por esses organismos e ajudar a elucidar sua biologia.

Diabetes é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia associada a prejuízos na captação e utilização de glicose, em que reduções na expressão da proteína GLUT4 (codificada pelo gene SLC2A4), bem como das enzimas Hexokinase-2 e Glycogen synthase (codificadas pelos genes HK2 e GYS1), desempenham papel importante. Recentemente, um novo elemento vem sendo relacionado à etiopatogenia e à fisiopatologia do diabetes, os microRNAs (miRNAs), que são pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão gênica, geralmente afetando a degradação de mRNAs. Entretanto, a participação de miRNAs envolvidos na redução da expressão de mRNAs relacionados a proteínas envolvidas na captação e utilização de glicose, sobretudo em músculo esquelético, permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de miRNAs potencialmente reguladores da expressão de Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 e Gys1/GYS1 em músculo esquelético de ratos diabéticos. Utilizamos ratos Wistar machos que foram tornados diabéticos pela administração de estreptozotocina. Após 13 dias, 3 grupos foram formados: não-diabético (ND) e diabético tratado com placebo (DP) ou insulina (DI). O tratamento foi conduzido por 7 dias, totalizando 21 dias de diabetes. Variáveis metabólicas foram avaliadas e os músculos sóleos foram removidos para avaliar a expressão de mRNAs, miRNAs e proteínas. Uma abrangente análise in silico foi conduzida para determinar miRNAs candidatos a regularem a expressão de Slc2a4, Hk2 e Gys1. Os animais diabéticos apresentaram perda de peso, poliúria, glicosúria, hiperglicemia e aumento de frutosamina plasmática; a insulinoterapia melhorou estas variáveis. O diabetes reduziu a expressão dos mRNAs Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) e Gys1 (~45%), e das proteínas GLUT4 (~77%), HK2(~52%) e GYS1 (~49%); a insulinoterapia restaurou essas variáveis. A expressão de 20 miRNAs foi avaliada neste estudo; 8 foram modulados pelo diabetes, sendo três supra-regulados, miR-1 (~28%), miR-29b (~118%) e miR-29c (~51%); e cinco infra-regulados, miR-93 (~39%), miR-199a (~30%), miR-345-3p (~23%), miR-532-3p (~26%) e miR-150 (~32%). Exceto pelo miR-1 e miR-150, a insulinoterapia reverteu as demais alterações. Além disso, miR-29b e miR-29c correlacionaram-se negativamente com GLUT4 e HK2, e positivamente com glicemia, glicosúria e frutosamina, sugerindo uma possível relação causal; enquanto que miR-199a e miR-532-3p correlacionaram-se positivamente com GLUT4 e HK2, e também com as variáveis metabólicas, sugerindo uma regulação indireta sobre os mRNAs dessas proteínas. No último caso, demonstrou-se que o miR-199a tem como alvo o NFKB1, um repressor do gene Slc2a4, o qual diminuiu no diabetes, explicando, pelo menos parcialmente, o efeito indireto sobre o GLUT4. Em suma, o diabetes aumenta a expressão de miR-29b e miR-29c, e reduz a expressão de miR-199a e miR-532-3p; o primeiro efeito, potencialmente age diretamente na tradução do mRNA Slc2a4 e Hk2, e o segundo, potencialmente age indiretamente, via NFKB, na transcrição dos genes. Como consequência, as proteínas GLUT4 e HK2 diminuem, o que reduziria a utilização de glicose pelo músculo, contribuindo para a hiperglicemia do diabetes. / Diabetes is a metabolic disease characterized by hyperglycemia associated with impaired glucose metabolism and uptake, in which reductions of GLUT4, hexokinase 2 (HK2) and glycogen synthase 1 (GYS1) proteins, encoded respectively by SLC2A4, HK2 and GYS1 genes, play an important role. Recently, a new element have been related to etiopathogeny and pathophysiology of diabetes, the microRNAs (miRNAs), which are small RNAs involved in the regulation of gene expression, usually by affecting the degradation of mRNAs. However, the participation of miRNAs diabetes-induced reduction of expression of genes related to glucose uptake and metabolism in skeletal muscle remains unknown. Thus, the objective of this study was to investigate the expression of miRNAs potentially regulators of the Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 and Gys1/GYS1 in skeletal muscle of diabetic rats. Male Wistar rats were rendered diabetic by receiving streptozotocin. After 13 days, 3 groups were formed: non-diabetic (ND), and diabetic treated with placebo (DP) or insulin (DI) (NPH insulin, 6U/day). Treatment was conducted for 7 days, totalizing 21 days of diabetes. At the end of the experimental period, metabolic variables were evaluated and the soleus muscle was removed for evaluation of mRNA, miRNA and protein expression. A broad in silico analysis was performed to determine candidate miRNAs as potential regulators of Slc2a4, Hk2 and Gys1. Diabetic rats shown weight loss, polyuria, glycosuria, hyperglycemia and increased plasma fructosamine; insulin treatment improved these variables. Diabetes reduced Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) and Gys1 (~45%) mRNAs, as well as GLUT4 (77%), HK2 (52%) and GYS1 (49%) proteins; insulin treatment restored these variables. Twenty miRNAs were assessed in this study. Eight miRNAs were modulated by diabetes in skeletal muscle; three were upregulated: miR-1 (28%), miR-29b (118%) and miR-29c (51%), whereas five were downregulated: miR-93 (39%), miR-150 (32%), miR-199a (30%), miR-345-3p (23%) and miR-532-3p (26%). Except for miR-1 and miR-150, all regulations were reverted by insulin treatment. Besides, miR-29b and miR-29c were negatively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and positively with glucose, glycosuria and plasma fructosamine suggesting a direct causal relationship; while miR-199a and miR-532-3p were positively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and also with the metabolic variables, suggesting an indirect causal relationship. In the last case, it was demonstrated that miR-199a has the Slc2a4 repressor Nfkb1 as target, which was reduced in muscle from diabetic rats, explaining, at least partially, the indirect effect upon GLUT4. In conclusion, diabetes increase the expression of miR-29b and miR-29c, and reduce the expression of miR-199a e miR-532-3p; the first effect, potentially acts directly in the translation of Slc2a4 and Hk2 mRNAs, and the second one, potentially acts indirectly, via NFKB, in the transcription of these genes. As a result, the expression of GLUT4 and HK2 decreases, which would reduce the muscle glucose uptake and metabolization, contributing to the hyperglycemia of the diabetes.

Submitted by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:05:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Approved for entry into archive by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / As células-tronco (CTs) caracterizam-se por possuírem a capacidade de se autorrenovar e de dar origem a um ou mais tipos celulares diferenciados. Nos últimos anos, diversos trabalhos mostraram a existência de CTs em tecidos adultos, tornando-as uma alternativa interessante para uso em terapias celulares. Contudo, para melhor utilizar as CTs, é preciso primeiramente compreender como ocorre a diferenciação em um tipo celular específico e, principalmente, como é regulada a expressão gênica durante este processo. Em 2009, Ingolia e colaboradores apresentaram uma nova técnica conhecida como ribosome profiling, a qual consiste no isolamento e sequenciamento em larga escala dos fragmentos de RNA associados e protegidos pelos ribossomos, os quais têm um tamanho aproximado de 30 nucleotídeos (conhecido com footprint ribossomal). Ao mapear as sequências obtidas, é possível obter informações não apenas sobre quais sequências estão sendo traduzidas, mas também sobre a cinética da tradução e sua extensiva rede de regulação. Assim, o objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de ribosome profiling ao estudo do processo de diferenciação de CTs adultas. Como modelo de estudo, foram utilizadas CTs obtidas de tecido adiposo antes (t=0) e após a indução para diferenciação adipogênica por 3 dias (t=72h). O primeiro passo do trabalho foi a adaptação do protocolo de ribosome profiling para o estudo de CTs adultas, o qual consiste na lise celular, digestão do lisado com uma RNA nuclease (a qual irá degradar o RNA exposto, preservando os fragmentos protegidos pelo ribossomo), ultracentifrugação do homogenato sobre colchão de sacarose 1 M para sedimentação dos ribossomos, extração de RNA e isolamento dos fragmentos de 30 nucleotídeos. Também foi feita extração do RNA poliA. As amostras foram sequenciadas (SOLiD™) e os dados obtidos foram triados e mapeados contra um banco de dados de RNAm, utilizando-se a ferramenta CLC Genomics Workbench. Foram identificados mais de 8.000 transcritos para as amostras de ribosome profiling e mais de 17.000 para as de poliA. Ao calcular o fold change entre as condições t=0 e t=72h, foi possível verificar que mais de 50% dos genes foram detectados como diferencialmente expressos apenas por ribosome profiling. Observou-se que genes relacionados com vias de diferenciação adipogênica e de metabolismo de lipídeos encontravam-se regulados positivamente em ambas as amostras de RNA. Por outro lado, observou-se que vias de regulação do citoesqueleto de actina e de adesão focal estavam reguladas negativamente apenas nas amostras de ribosome profiling. Isso é interessante, uma vez que a inibição destas vias já foi descrita como importante para o processo de adipogênese. Além disso, foi observada uma forte redução na eficiência de tradução de genes relacionados com a tradução após 72 horas de indução para diferenciação. Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam as evidências de que os mecanismos de regulação pós-transcricionais e traducionais têm um papel muito importante na regulação da diferenciação celular de CTs, sendo que a técnica de ribosome profiling permitiu obter informações mais detalhadas de como este processo pode estar acontecendo. / Stem cells (SC) are characterized by their capacity of both self-renewing and giving rise to new differentiated cells. SC are found in adult tissues, which are considered a putative source for cell therapy. However, little is known about the mechanisms involved in the trigger of SCs differentiation into a specific cell type. Understanding adult SCs differentiation process is a fundamental step to better use and to take advantage of their potential. In 2009, Ingolia and collaborators presented a new methodology of transcriptome analysis named ribosome profiling, which consists on the isolation and deep-sequencing of the mRNA fragments enclosed by ribosomes. When lysed cells are submitted to nuclease digestion, unprotected mRNA is degraded, while fragments within ribosomes are preserved and have a known footprint of 30 nucleotides. Sequencing these ribosome-protected fragments results in a high-precision measurement of in vivo translation, providing precise information about translation kinetics and its extensive regulation. The objective of this work was to apply the ribosome profiling methodology to the study of adipogenic differentiation in adult SCs. SCs were isolated from human adipose tissue from three donors and were cultured in a control medium (t=0) and induced to adipogenic differentiation for 72 hours (t=72h). The first step was to adapt and optimize the ribosome profiling protocol to the SC model, which consists in cell lysis, cell lysate digestion by nuclease (to degrade unprotected RNA, preserving ribosome-protected fragments), ultracentrifugation over a 1M sucrose cushion to pellet ribosomes, RNA extraction and 30 nucleotides fragments isolation. poliA RNA was also isolated. Samples were submitted to deep-sequencing (SOLiD™) and the reads obtained were trimmed and mapped onto the reference mRNA database using the CLC Genomics Workbench. Over 8000 transcripts were identified in ribosome profiling samples and over 17000 in poliA samples. Fold change analysis between t=0 and t=72h of both RNA samples showed that differential expression of more than 50% of the genes was identified only by ribosome profiling. Pathways related to adipogenesis and lipid metabolism were upregulated in both RNA samples. However, regulation of the actin cytoskeleton and focal adhesion proteins were downregulated only in ribosome profiling samples. Interestingly, downregulation of these pathways was already described as an important phenomenon to cell adipogenesis. Besides, we observed a strong reduction of translational efficiency of genes involved in translation at t=72h. Our results reinforce previous data, suggesting that posttranscriptional and translational regulation play a fundamental role in the regulation of SC differentiation process and that ribosome profiling is an important tool to better understand this process.

Submitted by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T16:24:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) / Approved for entry into archive by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T16:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Ana Carolina Origa Alves - 02.pdf: 2465539 bytes, checksum: 9ad1e3c8193f72874f714fe1c073b599 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / Células-tronco (CT) são células autorrenováveis e não especializadas, com o potencial de diferenciação multidirecional. Células-tronco de tecido adiposo (CT-TA) são um tipo de células-tronco adultas multipotentes, de fácil isolamento e cultura. Nos últimos anos, CT-TA têm mostrado grande potencial para engenharia de tecidos e terapias baseadas em células. Apesar do interesse em aplicações clínicas deste tipo de célula, os mecanismos moleculares fundamentais a sua autorrenovação e diferenciação ainda não foram completamente elucidados. miRNAs são pequenos RNAs não-codificadores, com 21-25 nucleotídeos de comprimento, que tem se mostrado como importantes reguladores da expressão gênica em nível póstranscricional. miRNAs podem atuar por meio de clivagem direta de mRNAs alvo ou através da repressão da tradução, dependendo da complementaridade entre o mRNA e a sequência do miRNA. Perfis de miRNAs de CT adultas sugerem que estes pequenos reguladores podem contribuir para as propriedades intrínsecas das CT. Para entender melhor os mecanismos de ação dos miRNAs em CT-TA, miRNAs associados ao polissomos de CT-TA foram isolados durante a diferenciação celular. Procurando miRNAs reguladores das etapas iniciais de diferenciação ou envolvidos na autorrenovação de CT, as culturas de células foram induzidas a diferenciação adipogênica durante 72 h. O lisado celular foi submetido à ultracentrifugação em gradiente de sacarose para separar monosomos, polissomos e fração livre de ribossomos. O RNA total associado aos ribossomos foi extraído, os fragmentos de RNA (<200 nt) foram enriquecidos e a seleção de tamanho de fragmentos de RNA apropriados ocorreu durante a preparação das amostras para o sequenciamento em larga escala. As amostras foram sequenciadas utilizando a plataforma SOLiD ™, e as frações polissomais de culturas Não Induzida e 72h de indução foram comparadas e dezesseis miRNAs foram identificados. miRNAs encontrados em um trabalho prévio do grupo foram adicionados a esses dados, e sete miRNAs (hsamiR-29b-1-5p, hsa- miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210- 5p e hsa-miR-6775- 5p) foram testados por RT-qPCR para confirmar a expressão diferencial, sendo que um deles (hsa-miR-210-5p) mostrou diferença estatisticamente significativa. / Stem cells (SC) are self-renewing and non-specialized cells with the potential of multi-directional differentiation. Adipose Stem Cell (ADSC) is a type of multipotent adult stem cell, easy to isolate and culture. In the past few years, hADSCs have shown great potential for tissue engineering and cell-based therapies. Despite the interest in clinical applications of this kind of cell, the molecular mechanisms underlying their self-renewal and differentiation have yet to be fully elucidated. miRNAs are small noncoding RNAs, 21-25 nucleotides in length, that have been shown to be important regulators of posttranscriptional gene expression. miRNAs can act through direct cleavage of target mRNAs or through translational repression, depending of complementary pairing between the mRNA and miRNA sequence.miRNA profile of adult SCs suggests that these small regulators can contribute to the intrinsic properties of SCs. To better understand the mechanisms of action of miRNAs in hADSCs, we isolate miRNAs associated to polysomes of hADSC during cellular differentiation. Looking for miRNAs regulators of early steps of differentiation or involved in ADSC self-renewing, cell cultures were induced to adipogenic differentiation for 72 h. The cell lysate was submitted to ultracentrifugation on a sucrose gradient to separate monosomes, polysomes and the fraction free of ribosomes. The total RNA associated to ribosomes was extracted and the RNA fragments (<200 nt) were enriched and the size selection of appropriate RNA fragments occurred during the preparation of samples for deep sequencing. The samples were sequenced using SOLiD™ platform, and polysomal fraction of cell cultures non induced and 72h of induction were compared and sixteen miRNAs were identified. miRNAs found in a previous work of our group were added to these data and seven miRNAs (hsa-miR-29b-1-5p, hsa-miR-29c-5, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR- 143-5p, hsa-miR-210-3p, hsa-miR-210-5p e hsa-miR-6775-5p) were tested by RTqPCR to confirm differential expression, and one of them (hsa-miR-210-5p) showed statistical significant difference.

Orientador: Ney Lemke / Resumo: MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que regulam pós-transcricionalmente a expressão de genes, modelando o transcriptoma e a produção de proteínas. Em geral, os miRNAs são conservados no genoma de eucariotos, sendo considerados elementos vitais em diversos processos biológicos durante o desenvolvimento, tais como crescimento, diferenciação e morte celular. A grande diversidade de miRNAs identificados está restrita a poucas espécies e apenas uma parte do total de alvos de miRNAs preditos foi caracterizada funcionalmente. Nesse contexto, o uso da tecnologia de sequenciamento de alto rendimento (high throughput sequencing) atrelada à análise de nível transcricional por RT-qPCR possibilitam a identificação do microRNoma. A tilápia do Nilo, Oreochromis niloticus, é considerada um excelente modelo biológico para o estudo de miRNAs em vertebrados devido à sua importância econômica e evolutiva. O presente trabalho teve como objetivos: organizar os dados do sequenciamento dos miRNAs da tilapia do Nilo; disponibilizá-los em forma de uma base de dados para a comunidade científica; integrar as informações dos miRNAs identificados com outros bancos de dados de miRNAs; analisar os dados através de análises de bioinformática para determinação de agrupamentos definidos pelo nível de expressão de cada miRNA em seis tipos de tecido (músculo branco, músculo vermelho, testículo, ovário, fígado, olho, cérebro e coração) com distinção entre os gêneros e nas fases do desenvolvimento (2,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-12T18:06:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-13T10:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-13T10:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Iane de Oliveira Pires Porto - 2014.pdf: 1352493 bytes, checksum: 3e4c1213c96035cbae32d6eeccdd14e5 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs involved in post-transcriptional expression regulation by inducing mRNA degradation or translation inhibition. Some miRNAs are known to regulate HLA-G expression, an important immunemodulatory molecule that inhibits both Natural Killer and cytotoxic T cells through interaction with inhibitory receptors. The HLA-G is associated with maternal-fetal tolerance, tissue acceptance in transplants and the progression of tumors. The mechanisms underlying HLA-G expression control are not completely understood, however, its 3’untranslated region (3’UTR) is reported to play an important role on gene regulation influencing mRNA stability and interacting with miRNAs such as miR-148a-3p. In this study, we performed a systematic analysis of all miRNAs that are good candidates to act as HLA-G regulators. In order to determine the miRNAs with the highest potential to influence HLA-G expression, we compared the outputs of three distinct algorithms - miRanda, RNAhybrid and Pita. For this purpose, a method of miRNA inference was developed using Perl scripts to compare and filter results and a scoring system was created in order to evaluate both the binding stability of the miRNA/mRNA interaction and the miRNA specificity to its target sequence. Then, a panel of miRNAs with great potential of controlling HLA-G expression was generated. / MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional por meio da degradação da molécula de RNA mensageiro ou da inibição da tradução. Alguns miRNAs foram relatados como sendo responsáveis pela regulação da expressão do gene HLA-G, um importante imunomodulador que inibe a ação de células Natural Killer e células T citotóxicas ao interagir com receptores inibitórios. Este gene está associado à tolerância maternofetal, aceitação de tecidos após transplantes e progressão de tumores. Os mecanismos subjacentes à regulação da expressão de HLA-G não foram completamente elucidados, mas sabe-se que sua região 3’ não traduzida (3’NT) possui um papel importante na regulação gênica tanto por manter a estabilidade da molécula de mRNA quanto por interagir com miRNAs como miR-148a-3p. Neste estudo, foram inferidos miRNAs que são bons candidatos para atuarem como reguladores do gene HLA-G. Para determinar os miRNAs com o maior potencial de operarem no controle pós-transcricional dos níveis de HLA-G, comparamos os resultados de três algoritmos distintos – miRanda, RNAhybrid e Pita. Para tanto, foi desenvolvida uma estratégia de inferência de miRNAs que utiliza scripts em Perl para comparação e filtragem dos dados e um sistema de pontuação que permite avaliar tanto a estabilidade da interação miRNA/mRNA quanto a especificidade do miRNA à sua sequência alvo. Assim, um painel confiável de miRNAs com grande possibilidade de influenciar a expressão de HLA-G foi gerado considerando as regiões polimórficas e não polimórficas da região 3’NT do gene HLA-G individualmente.

O gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1) possui 17 éxons e seu transcrito primário pode sofrer splicing alternativo, havendo, entre outros eventos, possibilidade de exclusão ou inclusão do éxon 12. O produto da expressão do FMR1, a proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), possui papéis importantes no sistema nervoso central, atuando como repressora da tradução de RNAm em espinhas dendríticas e controlando a síntese de proteínas envolvidas na função sináptica. Entre dois domínios centrais do tipo KH presentes na FMRP, o segundo (KH-2) é responsável pela interação da proteína aos polissomos. O domínio KH-2 é codificado pelos éxons 9 a 13 do FMR1 e possui a alça variável mais longa já observada entre proteínas humanas, que é codificada pelos éxons 11 e 12. A inclusão do éxon 12 no RNAm do FMR1 causa uma extensão em fase dessa alça variável do KH-2 da FMRP. Estas isoformas apresentam expressão significativa em neurônios cortico-cerebrais e cerebelares do rato, no primeiro mês pós-natal. Este trabalho baseia-se em resultados prévios do grupo de pesquisa, em que se identificaram sequências curtas no íntron 12 do FMR1, com potencial para agir como acentuadores de splicing. Baseando-nos na hipótese de que essas sequências constituem elementos transcritos que se ligam a fatores proteicos do núcleo celular, potencialmente reguladores do splicing do pré-RNAm do FMR1, realizamos ensaios de precipitação por afinidade com extratos nucleares de córtex cerebral de rato e transcritos do loco, biotinilados. Análises por espectrometria de massas revelaram enriquecimento de proteínas nucleares, contendo domínios de ligação a RNA, principalmente aquelas relacionadas à regulação e processamento de pré-RNAm, sobretudo o splicing / Fragile X Mental Retardation 1 gene (FMR1) comprises 17 exons. Its primary transcript is subject to alternative splicing, allowing for the possibility of exon 12 inclusion or skipping, among other events. The product of FMR1 gene expression, fragile X mental retardation protein (FMRP), has important roles in the central nervous system, acting as a translational repressor in dendritic spines, thus controlling the synthesis of proteins involved in synaptic function. FMRP has two central KH domains. One of them (KH-2) is responsible for its interaction with polysomes. The KH-2 domain is encoded by FMR1 exons 9 to 13. It contains the longest variable loop ever observed among human KH-containing proteins, which is encoded by FMR1 exons 11 and 12. Exon-12 inclusion in FMR1 mRNA causes an in-frame extension of FMRP KH-2 domain variable loop. These isoforms appear significantly expressed in cortico-cerebral and cerebellar neurons of the rat in the first month after birth. We have previously identified short sequences within FMR1 intron 12 that may potentially act as splicing enhancers. Our study is based on the hypothesis that those sequences when transcribed should bind to nuclear protein factors that may function as FMR1 exon 12 pre-mRNA splicing regulators. To initiate an experimental approach to test that hypothesis, we conducted affinity precipitation assays with rat cerebral cortex nuclear extracts and biotinylated transcripts. Mass spectrometry analyses disclosed proteins that have been described to be enriched in the cell nucleus, contain RNA-binding domains, and be functionally related to pre-mRNA processing, notably splicing

O iodo em excesso promove o efeito Wolff-Chaikoff. Oligominerais já foram descritos como potenciais reguladores da expressão de proteínas. Tornou-se interessante avaliar se o iodo interferiria com a expressão do mRNA da NIS, em curtos períodos de tempo. Foram realizados, em ratos e células (de 30 min24h), estudos de expressão, comprimento de cauda poli-A e recrutamento para polissomos, do mRNA de NIS. Observou-se, in vivo e in vitro, que o excesso de iodo promoveu diminuição da expressão e do comprimento da cauda poli-A do mRNA de NIS, em todos os períodos estudados, além de promover menor recrutamento deste mRNA para os polissomos. A diminuição da cauda poli-A do mRNA de NIS pode ter aumentado sua instabilidade/degradação e também ter sido responsável por uma menor eficiência de tradução deste transcrito. Conclui-se que: (a) o iodo regula pós-transcricionalmente a expressão gênica da NIS, sendo fundamental nos processos que norteiam o efeito Wolff-Chaikoff e (b) oligoelementos têm relevância na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao seu transporte. / Iodide in excess exerts the Wolff-Chaikoff effect. It is described that some minerals can regulate the expression of proteins. This study aimed to investigate if the iodide could modify the expression of NIS mRNA, in short periods of time. Rats and cells, divided in time-groups of 30 min up to 24h, were used in studies of expression, poly-A tale length and polysomal profile of NIS mRNA. Both in vivo and in vitro studies showed that the iodide treatment promoted a reduction in the expression and the poly-A length of NIS mRNA, in all time-groups, and decreased its recruitment to the polysomes. It is possible that the reduction of NIS mRNA poly-A tale length has increased the instability/degradation of this transcript, and impaired the translation efficiency of it. Concluding: a) the iodine exerts a post-transcriptional regulation of NIS mRNA expression, being essencial in the processes that guide the Wollf-Chaikoff effect; b) the oligoelements have an extremely important role in the expression regulation of proteins related to their transport.

O iodo em excesso promove o efeito Wolff-Chaikoff. Oligominerais já foram descritos como potenciais reguladores da expressão de proteínas. Tornou-se interessante avaliar se o iodo interferiria com a expressão do mRNA da NIS, em curtos períodos de tempo. Foram realizados, em ratos e células (de 30 min24h), estudos de expressão, comprimento de cauda poli-A e recrutamento para polissomos, do mRNA de NIS. Observou-se, in vivo e in vitro, que o excesso de iodo promoveu diminuição da expressão e do comprimento da cauda poli-A do mRNA de NIS, em todos os períodos estudados, além de promover menor recrutamento deste mRNA para os polissomos. A diminuição da cauda poli-A do mRNA de NIS pode ter aumentado sua instabilidade/degradação e também ter sido responsável por uma menor eficiência de tradução deste transcrito. Conclui-se que: (a) o iodo regula pós-transcricionalmente a expressão gênica da NIS, sendo fundamental nos processos que norteiam o efeito Wolff-Chaikoff e (b) oligoelementos têm relevância na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao seu transporte. / Iodide in excess exerts the Wolff-Chaikoff effect. It is described that some minerals can regulate the expression of proteins. This study aimed to investigate if the iodide could modify the expression of NIS mRNA, in short periods of time. Rats and cells, divided in time-groups of 30 min up to 24h, were used in studies of expression, poly-A tale length and polysomal profile of NIS mRNA. Both in vivo and in vitro studies showed that the iodide treatment promoted a reduction in the expression and the poly-A length of NIS mRNA, in all time-groups, and decreased its recruitment to the polysomes. It is possible that the reduction of NIS mRNA poly-A tale length has increased the instability/degradation of this transcript, and impaired the translation efficiency of it. Concluding: a) the iodine exerts a post-transcriptional regulation of NIS mRNA expression, being essencial in the processes that guide the Wollf-Chaikoff effect; b) the oligoelements have an extremely important role in the expression regulation of proteins related to their transport.