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Modelamento estocástico para a expressão gênica / Modeling stochastic gene expression

Innocentini, Guilherme da Costa Pereira 07 March 2008 (has links)
Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.
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Um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster / A stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene

Prata, Guilherme Nery 30 January 2013 (has links)
Nesta tese desenvolvemos um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster no qual a variável estocástica é o número de moléculas de mRNA transcritas. Nesse modelo, consideramos um gene com dois níveis de ativação sendo regulado externamente. As probabilidades de se encontrar o gene ligado ou desligado e com determinado número de moléculas de mRNA transcritas obedecem equações lineares dadas por processos markovianos de nascimento-e-morte (taxas de produção e degradação) e termos de chaveamento entre os níveis cujas dependências temporais são dadas por funções de Heaviside. Notamos que tal dependência é suficiente para garantir uma atividade transcricional inicial intensa seguida de uma súbita interrupção, conforme sugerem os dados experimentais. Desconsiderando efeitos difusivos e fenômenos de transporte, estendemos esse constructo às outras regiões do embrião, permitindo dependências espaciais apenas às termos de chaveamento, e o resultado gerado descreve os dados experimentais com boa concordância, indicando também que o aspecto binário do gene é suficiente para uma descrição semiquantitativa do fenômeno. Notavelmente, na região onde a listra se forma e concomitantemente a sua formação, o modelo prevê a redução do desvio quadrático (flutuação) e do ruído. Calculando a distribuição de probabilidade, verificamos que o regime estacionário é atingido antes da listra começar a desaparecer. Também estudamos uma conexão entre parâmetros do modelo e as proteínas envolvidas na regulação e, baseado em resultados da literatura, obtemos uma função com aproximadamente o mesmo efeito regulatório considerando gradientes de seis fatores de transcrição (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) e apenas quatro sítios de ligação, o que sugere que a informação transcricional pode estar concentrada na regulação de poucos sítios. / In this thesis we develop a stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene in which the stochastic variable is the number of mRNA molecules transcribed. In this model we considered a gene with two activation levels being regulated externally. The probabilities of gene being on or off when there is a certain number of transcripts obey linear equations given by Markovian birth-and-death processes (production and degradation rates) and terms of switch between levels whose time-dependence is given by Heaviside functions. We note that is sufficient to ensure a strong transcriptional activity followed by a sudden disruption, as suggested by the experimental data. Disregarding diffusion effects and transport phenomena, we extend this construct to the others regions ot the embryo, allowing space-dependence only to terms of switch, and the results describe the experimental data with good agreement, indicating also that binary character of gene is sufficient to a semiquantitative description of the phenomenon. Notably, in the region where the stripe 2 is formed and simultaneously with its formation, the model predicts the reduction in standard deviation (fluctuation) and noise. By calculating the probability distribution, we find that stationary state is reached before stripe 2 starts to fade. We also study a connection between the parameters of the model and proteins involved in regulation and, based on results from the literature, we obtain a function with approximately the same regulatory effect considering six transcription factors (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) and only four binding sites, suggesting that transcriptional information may be concentrated in regulation of few sites.
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DESENVOLVIMENTO DE PROTEÍNA SINTÉTICA QUIMÉRICA BASEADA EM TALE (TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR) PARA APLICAÇÃO EM SISTEMA BIOSSENSOR DE DNA. 72f 2017

Moreira, Catarina Alfaya January 2017 (has links)
Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2018-02-05T18:15:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T18:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / As abordagens de Biologia Sintética possuem potencial de aumentar a produção de ferramentas diagnósticas adequadas para utilização na prática, como os biossensores de DNA. O controle dos sistemas biológicos permite o aprimoramento de tecnologias em uso e surgimento de novas tecnologias, como o diagnóstico molecular através da identificação de sequências específicas de DNA. A maioria dos métodos moleculares de diagnóstico de DNA se baseiam em hibridização. Contudo, atualmente, as proteínas ligadoras de DNA tem tido destaque, devido às suas numerosas vantagens. As principais vantagens são a identificação de sequências em DNA dupla-fita, eliminando o passo de desnaturação, e a alta especificidade pelo alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína sintética quimérica para aplicação em sistema biossensor de DNA que permitirá rápida identificação de uma sequência específica de DNA de Corynebacterium striatum, um importante patógeno emergente. Foi construída, neste estudo, uma proteína quimérica biossensora composta por: (I) um domínio de ligação ao DNA derivado de proteínas TALEs (proteínas efetoras do tipo ativadores transcricionais) o qual reconhece especificamente uma sequência de 18 pb de um gene único de C.striatum codificador de uma permease para transporte de ferro; combinado a (II) uma cromoproteína tsPurple (Tinsel Purple) para permitir detecção visual da sequência alvo. Para construção do gene codificador da proteína TALE específica, o gene específico de C. striatum foi analisado com a ferramenta Tal Effector Nucleotide Targeter (Cornell University) e uma sequência-alvo de 18pb foi definida. A construção de domínios TAL foi realizada utilizando a ferramenta GeneArtTM Perfect Match TAL (Thermo Scientific); o gene sintético encontra-se clonado no plasmídeo pTALE. Para construir as sequências gênicas quiméricas, foram desenhados primers de PCR para isolamento da sequência da tsPurple com a adição de sítios artificiais de restrição para EcoRI e BamHI; os produtos de PCR digeridos foram clonados no plasmídeo pTALE, downstream à sequência da TALE específica. Essas sequências fusionadas foram então sub-clonadas em um vetor de expressão pDESTTM17, através de recombinação utilizando tecnologia Gateway para expressão das proteínas quiméricas. A expressão da proteína quimérica foi induzida pela adição de 1mM de IPTG. A expressão da proteína quimérica foi confirmada através de análises de SDS PAGE 10% , que demonstraram a superexpressão da proteína esperada de 151kDa; além disso, foi observada a forte coloração roxa no precipitado bacteriano, em razão da funcionalidade da cromoproteína TsPurple.
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Identificação do polimorfismo no receptor para TNF-\03B1 (TNFR1 posição +36A/G) e sua expressão em lesões de colo uterino

Rocha, Natália Pereira da January 2013 (has links)
Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_rocha_ipec_mest_2013.pdf: 1339870 bytes, checksum: 1b75fa3998a6ced2d2cf3691a4f88a49 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo HPV é o principal fator de risco para o desenvolvimento do carcinoma cervical. Contudo, a maioria das mulheres permanece assintomática, desenvolvendo lesões intraepiteliais de baixo e alto grau. Estudos demonstram que polimorfismos nas regiões promotoras de genes de citocinas estão associados com a gravidade de muitas doenças infecciosas. Dentre estas, podemos citar a citocina pró-inflamatória TNF-\F061, onde suas atividades celulares são mediadas pela interação entre a citocina e seus receptores (TNFR1 e R2). Assim, tivemos como objetivo neste estudo, identificar polimorfismos dos receptores de TNF-\F061 e associar ao aparecimento e progressão da lesão cervical, além de avaliar a expressao da proteína TNFR1 em lesoes cervicais. As técnicas de PCR e RFLP foram realizadas para identificar o polimorfismo de base única (SNP) do gene TNFR1 na posição +36A/G. Para a expressão da proteína foi realizada a imunohistoquimica em fragmentos de tecido parafinado provenientes de lesões cervicais e histerectomias (controle) Foram incluídas 365 mulheres neste estudo, sendo 183 pacientes e 182 controles. O genótipo AA TNFR1+36A/G foi associado com a proteção ao desenvolvimento de lesões de baixo grau (p=0,03) Para a análise da expressão de TNFR1, foram selecionadas 46 mulheres (17 controles, 15 HSIL e 14 LSIL). Foi observado um aumento na expressão deste receptor em células inflamatórias no corion de mulheres portadores de HSIL quando comparadas com o grupo controle (p=0,001). Ao associarmos os genótipos com a expressão da proteina, foi observado que portadoras de TNFR1+36AA não apresentam alterações na expressão TNFR1 independente do grau de lesão cervical. Assim, a presença de TNFR1 pode estar sendo modulada negativamente pela infecção por HPV e este marcador pode ser utilizado como indicador para a progressão de lesões pré-malignas cervicais / HPV infection is the main risk factor for development of cervical carcinoma. However, most women remain asymptomatic, develo ping high grade and low intraepithelial lesions. Studies demonstrated that polymorphisms in promoter regions of cytokines genes are associated with the severity of many infectious diseases. Among these, we mention the proinflammatory cytokine TNF -  , where their cellular activities are mediated by cytokine and their receptors (TNFR1 and R2) interaction . Thus, in this study, we have the aim to identify TNF -  receptors polymorphisms and associate with the onset and progression of cervical lesions, and to evalu ate the TNFR1 expression in cervical lesions. PCR and RFLP techniques were performed to identify the single base polymorphism (SNP) TNFR1 gene at position +36 A/G. For protein expression , it was performed immunohistochemistry on paraffin tissue fragments f rom cervical lesions and hysterectomies (control). Three hundred and sixty five women were included, 183 patient s and 182 controls. The AA genotype TNFR1 +36 A / G was associated with protection from developing low - grade lesions (p = 0.03) for the analysis of TNFR1 expression, we selected 46 women (17 controls, 15 HSIL and 14 LSIL). It was observed a n increase in the receptor expression o n inflammatory cells from corion of HSIL women when compared with the control group (p = 0.001). By associating genotypes with expression of the protein, it was observed that carriers of TNFR1 +36 AA did not show changes in the TNFR1expression , independent cervical lesion degree. Thus, the TNFR1 presence may be negatively being modulated by HPV infection and this marker can b e used as an indicator of premalignant cervical lesions progression .
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CARACTERIZAÇÃO DE TcRBSR1 EM Trypanosoma cruzi

MALGARIN, JULIANE SOLDI January 2015 (has links)
Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:09:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) Previous issue date: 2015 / Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas que afeta milhões de pessoas no mundo. A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos se dá majoritariamente a nível póstranscricional diferindo daquela de outros eucariotos. Apesar de demonstrada a mobilização diferencial de mRNAs em T. cruzi e a importância da regulação pós-transcricional, poucas proteínas de ligação ao RNA foram caracterizadas até o momento. O domínio RNA Recognition Motif (RRM) de ligação ao RNA é um dos mais abundantes domínios encontrados em proteínas de ligação a RNA (RBPs). Proteínas com esse domínio RRM estão envolvidas na maioria dos processos póstranscricionais. RBPs associadas a moléculas de mRNA e outras proteínas regulatórias formam os complexos ribonucleoproteicos (mRNPs), que estão envolvidos na regulação do RNA. Nesse trabalho, reportamos a caracterização de uma proteína de ligação a mRNAs que apresenta domínio RRM, denominada RBSR1. A proteína foi fusionada a uma etiqueta TAP-tagging N-terminal (RBSR1TAP tagging) e os experimentos foram realizados com parasitas transfectados. Ensaios de imunofluorescência, para determinar a localização da proteína, mostraram que a proteína apresenta um padrão de migração entre o núcleo e o citoplasma em diferentes etapas da diferenciação do parasita e que sua expressão é regulada ao longo do ciclo de vida, não sendo expressa em tripomastigotas metacíclicos. O ensaio também foi realizado sob condições de estresse e demonstrou-se a mudança de localização da proteína RBSR1 quando submetida a estresse nutricional e oxidativo. O perfil de polissomos em gradiente de sacarose mostrou que RBSR1, tanto em epimastigotas, quanto sob estresse nutricional, está relacionada a complexos ribonucleoproteicos pesados não associados à tradução. Foram realizados ensaios de imunoprecipitação para identificação dos mRNAs alvos da proteína, seguido de sequenciamento massivo, onde observou-se transcritos que codificam para proteínas ribossomais e também proteínas hipotéticas. Também foi realizada a identificação de proteínas parceiras a RBSR1 por imunoprecipitação de formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento e sob estresse nutricional, seguida de espectrometria de massas. Em epimastigotas em crescimento exponencial foram identificadas 86 proteínas parceiras e sob estresse nutricional 31 proteínas, observou-se alta heterogeneidade das parceiras, a qual pode ser explicada pela mobilidade apresentada por RBSR1 nas diversas formas do parasita. Adicionalmente, foram vistas várias proteínas que se associam a grânulos de RNA, como por exemplo DHH1 e HSP70, e dessa forma é possível que haja a associação de RBSR1 com esses grânulos. O estudo do papel das RBPs na modulação da expressão gênica em tripanossomatídeos pode pavimentar o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias para combater as doenças causadas por esses organismos e ajudar a elucidar sua biologia.
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Estudos cristalográficos da proteína ElrR, regulador transcricional do fator de virulência ElrA de Enterococcus faecalis, e indícios de sua interação com a região de ligação ao DNA / Crystallographic studies of the protein ElrR, a transcriptional regulator of the Enterococcus faecalis virulence factor ElrA, and indications of its interaction with DNA fragment

Michel Conrad Robert De Groote 21 November 2017 (has links)
A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.
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Um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster / A stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene

Guilherme Nery Prata 30 January 2013 (has links)
Nesta tese desenvolvemos um modelo estocástico para a transcrição do gene even-skipped de Drosophila melanogaster no qual a variável estocástica é o número de moléculas de mRNA transcritas. Nesse modelo, consideramos um gene com dois níveis de ativação sendo regulado externamente. As probabilidades de se encontrar o gene ligado ou desligado e com determinado número de moléculas de mRNA transcritas obedecem equações lineares dadas por processos markovianos de nascimento-e-morte (taxas de produção e degradação) e termos de chaveamento entre os níveis cujas dependências temporais são dadas por funções de Heaviside. Notamos que tal dependência é suficiente para garantir uma atividade transcricional inicial intensa seguida de uma súbita interrupção, conforme sugerem os dados experimentais. Desconsiderando efeitos difusivos e fenômenos de transporte, estendemos esse constructo às outras regiões do embrião, permitindo dependências espaciais apenas às termos de chaveamento, e o resultado gerado descreve os dados experimentais com boa concordância, indicando também que o aspecto binário do gene é suficiente para uma descrição semiquantitativa do fenômeno. Notavelmente, na região onde a listra se forma e concomitantemente a sua formação, o modelo prevê a redução do desvio quadrático (flutuação) e do ruído. Calculando a distribuição de probabilidade, verificamos que o regime estacionário é atingido antes da listra começar a desaparecer. Também estudamos uma conexão entre parâmetros do modelo e as proteínas envolvidas na regulação e, baseado em resultados da literatura, obtemos uma função com aproximadamente o mesmo efeito regulatório considerando gradientes de seis fatores de transcrição (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) e apenas quatro sítios de ligação, o que sugere que a informação transcricional pode estar concentrada na regulação de poucos sítios. / In this thesis we develop a stochastic model to transcription of Drosophila melanogaster even-skipped gene in which the stochastic variable is the number of mRNA molecules transcribed. In this model we considered a gene with two activation levels being regulated externally. The probabilities of gene being on or off when there is a certain number of transcripts obey linear equations given by Markovian birth-and-death processes (production and degradation rates) and terms of switch between levels whose time-dependence is given by Heaviside functions. We note that is sufficient to ensure a strong transcriptional activity followed by a sudden disruption, as suggested by the experimental data. Disregarding diffusion effects and transport phenomena, we extend this construct to the others regions ot the embryo, allowing space-dependence only to terms of switch, and the results describe the experimental data with good agreement, indicating also that binary character of gene is sufficient to a semiquantitative description of the phenomenon. Notably, in the region where the stripe 2 is formed and simultaneously with its formation, the model predicts the reduction in standard deviation (fluctuation) and noise. By calculating the probability distribution, we find that stationary state is reached before stripe 2 starts to fade. We also study a connection between the parameters of the model and proteins involved in regulation and, based on results from the literature, we obtain a function with approximately the same regulatory effect considering six transcription factors (Bcd, Hb, Gt, Kr, Kni e Tll) and only four binding sites, suggesting that transcriptional information may be concentrated in regulation of few sites.
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Modelamento estocástico para a expressão gênica / Modeling stochastic gene expression

Guilherme da Costa Pereira Innocentini 07 March 2008 (has links)
Nesta dissertação consideramos um o modelo para um gene como sendo um sistema de dois estados, tipo spin, e apresentamos um modelo estocástico para a expressão gênica. As soluções estacionárias e, também, as dependentes do tempo, para o processo de transcrição, são obtidas e as distribuições de probabilidade, que descrevem o estado funcional do gene, são calculadas analiticamente. O valor médio e o ruído transcricional na população de mRNA são analisados. O efeito do ruído transcricional na síntese proteica é contemplado acoplando-se os processo de transcrição e tradução. / In this dissertation we present a two state stochastic model, spin-like, for gene expression. The steady-state solutions and also the time-dependente solutions for the transcription are probed and the probability distribution functions, which describe the functional state of the gene, are exactly calculated. The mean value and the transcriptional noise in the mRNA population are analyzed. The effects of the transcriptional noise in the protein synthesis are contemplated by coupling the transcription and the translation.
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microRNAs 29b, 29c, 199a e 532-3p são potenciais repressores da expressão de GLUT4 e HK2 em músculo esquelético de ratos diabéticos. / microRNAs 29b, 29c, 199a e 532-3p are potentials repressors of GLUT4 and HK2 expression in skeletal muscle of diabetic rats.

Esteves, João Victor Del Conti 13 December 2016 (has links)
Diabetes é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia associada a prejuízos na captação e utilização de glicose, em que reduções na expressão da proteína GLUT4 (codificada pelo gene SLC2A4), bem como das enzimas Hexokinase-2 e Glycogen synthase (codificadas pelos genes HK2 e GYS1), desempenham papel importante. Recentemente, um novo elemento vem sendo relacionado à etiopatogenia e à fisiopatologia do diabetes, os microRNAs (miRNAs), que são pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão gênica, geralmente afetando a degradação de mRNAs. Entretanto, a participação de miRNAs envolvidos na redução da expressão de mRNAs relacionados a proteínas envolvidas na captação e utilização de glicose, sobretudo em músculo esquelético, permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de miRNAs potencialmente reguladores da expressão de Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 e Gys1/GYS1 em músculo esquelético de ratos diabéticos. Utilizamos ratos Wistar machos que foram tornados diabéticos pela administração de estreptozotocina. Após 13 dias, 3 grupos foram formados: não-diabético (ND) e diabético tratado com placebo (DP) ou insulina (DI). O tratamento foi conduzido por 7 dias, totalizando 21 dias de diabetes. Variáveis metabólicas foram avaliadas e os músculos sóleos foram removidos para avaliar a expressão de mRNAs, miRNAs e proteínas. Uma abrangente análise in silico foi conduzida para determinar miRNAs candidatos a regularem a expressão de Slc2a4, Hk2 e Gys1. Os animais diabéticos apresentaram perda de peso, poliúria, glicosúria, hiperglicemia e aumento de frutosamina plasmática; a insulinoterapia melhorou estas variáveis. O diabetes reduziu a expressão dos mRNAs Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) e Gys1 (~45%), e das proteínas GLUT4 (~77%), HK2(~52%) e GYS1 (~49%); a insulinoterapia restaurou essas variáveis. A expressão de 20 miRNAs foi avaliada neste estudo; 8 foram modulados pelo diabetes, sendo três supra-regulados, miR-1 (~28%), miR-29b (~118%) e miR-29c (~51%); e cinco infra-regulados, miR-93 (~39%), miR-199a (~30%), miR-345-3p (~23%), miR-532-3p (~26%) e miR-150 (~32%). Exceto pelo miR-1 e miR-150, a insulinoterapia reverteu as demais alterações. Além disso, miR-29b e miR-29c correlacionaram-se negativamente com GLUT4 e HK2, e positivamente com glicemia, glicosúria e frutosamina, sugerindo uma possível relação causal; enquanto que miR-199a e miR-532-3p correlacionaram-se positivamente com GLUT4 e HK2, e também com as variáveis metabólicas, sugerindo uma regulação indireta sobre os mRNAs dessas proteínas. No último caso, demonstrou-se que o miR-199a tem como alvo o NFKB1, um repressor do gene Slc2a4, o qual diminuiu no diabetes, explicando, pelo menos parcialmente, o efeito indireto sobre o GLUT4. Em suma, o diabetes aumenta a expressão de miR-29b e miR-29c, e reduz a expressão de miR-199a e miR-532-3p; o primeiro efeito, potencialmente age diretamente na tradução do mRNA Slc2a4 e Hk2, e o segundo, potencialmente age indiretamente, via NFKB, na transcrição dos genes. Como consequência, as proteínas GLUT4 e HK2 diminuem, o que reduziria a utilização de glicose pelo músculo, contribuindo para a hiperglicemia do diabetes. / Diabetes is a metabolic disease characterized by hyperglycemia associated with impaired glucose metabolism and uptake, in which reductions of GLUT4, hexokinase 2 (HK2) and glycogen synthase 1 (GYS1) proteins, encoded respectively by SLC2A4, HK2 and GYS1 genes, play an important role. Recently, a new element have been related to etiopathogeny and pathophysiology of diabetes, the microRNAs (miRNAs), which are small RNAs involved in the regulation of gene expression, usually by affecting the degradation of mRNAs. However, the participation of miRNAs diabetes-induced reduction of expression of genes related to glucose uptake and metabolism in skeletal muscle remains unknown. Thus, the objective of this study was to investigate the expression of miRNAs potentially regulators of the Slc2a4/GLUT4, Hk2/HK2 and Gys1/GYS1 in skeletal muscle of diabetic rats. Male Wistar rats were rendered diabetic by receiving streptozotocin. After 13 days, 3 groups were formed: non-diabetic (ND), and diabetic treated with placebo (DP) or insulin (DI) (NPH insulin, 6U/day). Treatment was conducted for 7 days, totalizing 21 days of diabetes. At the end of the experimental period, metabolic variables were evaluated and the soleus muscle was removed for evaluation of mRNA, miRNA and protein expression. A broad in silico analysis was performed to determine candidate miRNAs as potential regulators of Slc2a4, Hk2 and Gys1. Diabetic rats shown weight loss, polyuria, glycosuria, hyperglycemia and increased plasma fructosamine; insulin treatment improved these variables. Diabetes reduced Slc2a4 (~55%), Hk2 (~47%) and Gys1 (~45%) mRNAs, as well as GLUT4 (77%), HK2 (52%) and GYS1 (49%) proteins; insulin treatment restored these variables. Twenty miRNAs were assessed in this study. Eight miRNAs were modulated by diabetes in skeletal muscle; three were upregulated: miR-1 (28%), miR-29b (118%) and miR-29c (51%), whereas five were downregulated: miR-93 (39%), miR-150 (32%), miR-199a (30%), miR-345-3p (23%) and miR-532-3p (26%). Except for miR-1 and miR-150, all regulations were reverted by insulin treatment. Besides, miR-29b and miR-29c were negatively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and positively with glucose, glycosuria and plasma fructosamine suggesting a direct causal relationship; while miR-199a and miR-532-3p were positively correlated with GLUT4 and HK2 proteins, and also with the metabolic variables, suggesting an indirect causal relationship. In the last case, it was demonstrated that miR-199a has the Slc2a4 repressor Nfkb1 as target, which was reduced in muscle from diabetic rats, explaining, at least partially, the indirect effect upon GLUT4. In conclusion, diabetes increase the expression of miR-29b and miR-29c, and reduce the expression of miR-199a e miR-532-3p; the first effect, potentially acts directly in the translation of Slc2a4 and Hk2 mRNAs, and the second one, potentially acts indirectly, via NFKB, in the transcription of these genes. As a result, the expression of GLUT4 and HK2 decreases, which would reduce the muscle glucose uptake and metabolization, contributing to the hyperglycemia of the diabetes.
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Regulação da degradação da parede celular durante a formação do aerênquima em raízes de cana-de-açúcar / Regulation of cell wall degradation during aerenchyma development in roots of sugarcane

Tavares, Eveline Queiroz de Pinho 15 June 2015 (has links)
A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. / In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

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