Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El ejercicio físico afecta tanto el metabolismo energético del músculo esquelético, como el crecimiento de este, incluyendo cambios a nivel de la síntesis de proteínas y de la expresión de genes. El calcio es una importante señal en la regulación de la transcripción. Resultados del laboratorio indican que la despolarización de células musculares esqueléticas resulta en señales de calcio rápida y lenta, muy definidas en localización subcelular y cinética, y en la activación de algunos intermediarios clásicos de la expresión génica. Entre estos intermediarios se encuentran ERK 1/2 y el factor de transcripción CREB, cuya activación depende de la señal lenta de calcio. El nivel de fosforilación de estas proteínas, que representa activación, es reflejo de la actividad de quinasas y fosfatasas. Sin embargo, en general se les ha dado mayor atención a las quinasas, conociéndose con menor profundidad las fosfatasas En músculo esquelético en particular, no se conoce cuales fosfatasas desfosforilan CREB y ERK activados por despolarización. En este trabajo se determinó que la fosfatasa calcineurina, es activada en nuestro modelo celular por la despolarización generada por dos protocolos, alta concentración de K+ extracelular y estimulación eléctrica. En ambos casos la señal lenta de calcio participa parcialmente en la activación de calcineurina. La despolarización de miotubos en presencia de un inhibidor de calcineurina genera un aumento significativo de los niveles de ERK 1 /2 y de CREB fosforilados, indicando la participación de esta fosfatasa en la desfosforilación de ambos intermediarios. Estudiamos además, el posible rol de las fosfatasas PP1 y PP2A. No hubo cambios significativos en los niveles de activación de CREB y ERK1/2 en miotubos despolarizados en presencia de un inhibidor farmacológico de ambas fosfatasas. Con esta memoria de título se han complementado estudios del laboratorio, cuyo objetivo es determinar los mecanismos de transducción de señales involucradas en la activación por calcio de CREB y ERK1/2 / PROYECTO FONDECYT N°1030988

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El daño oxidativo en proteínas es considerado una de las principales consecuencias del envejecimiento celular y de enfermedades crónicas asociadas a la edad. La oxidación de metionina a metionina sulfóxido (MetO), a diferencia de otras modificaciones oxidativas, puede ser reparada por la enzima Metionina sulfóxido reductasa A (MsrA). Numerosos estudios muestran que la expresión de esta enzima se relaciona con resistencia a estrés oxidativo y longevidad, sin embargo se desconocen los mecanismos involucrados en su regulación. El análisis de una región de 2000 pb del promotor de la MsrA, permitió identificar posibles sitios de reconocimiento de factores transcripcionales relacionados con respuesta a estrés oxidativo y longevidad, entre los cuales se identificaron dos sitios de unión a FOXO3A, factor descrito como regulador central de vías de longevidad y de respuestas frente a estrés oxidativo. Un análisis comparativo entre diferentes organismos permitió determinar que estas secuencias FOXO son conservadas en los promotores de enzimas homólogas a la MsrA, lo que sugiere fuertemente que este factor podría ser un regulador de esta enzima. En este estudio se utilizaron líneas celulares transfectadas con el gen reportero luciferasa, acoplado a distintos fragmentos de la región 5’ no codificante del gen msrA humano (2000, 1408 y 260 pb). Los resultados mostraron que en presencia de FOXO3A la actividad promotora de la MsrA aumenta significativamente, y que al mutar el sitio FOXO ubicado a -920 pb del inicio de la traducción de la MsrA, la activación por este factor transcripcional disminuye significativamente en un 50%. Se evaluó también otros posibles estímulos externos que podrían activar al promotor de la MsrA. Para ello, cultivos celulares transfectados con la construcción de 2000 pb del promotor, fueron tratados conjuntamente con peróxido de hidrógeno y el antioxidante resveratrol, lo que produjo un aumento en la actividad del promotor, efecto independiente a la activación por FOXO3A. / Oxidative damage, in particular the protein oxidative damage is considered one of the main consequences of cellular ageing and age-related chronic diseases. The oxidation of methionine to methionine sulphoxide (MetO) unlike other oxidative modifications can be repaired by the enzyme Methionine sulphoxide reductase A (MsrA). Numerous studies show that the expression of this enzyme is related with resistance to oxidative stress and life span, however the mechanisms involved in the regulation of this expression are unknown. Analysis of the putative promoter region of the human MsrA, consisting of 2000 bp, allowed to identify different transcription factor recognition sites related with oxidative stress responses and longevity. Among these, two binding sites for FOXO3A, a binding factor recognized as a central regulator in longevity pathways and oxidative stress responses were identified. A comparative analysis between different organisms showed that these FOXO3A sequences are conserved in the promoters of homologous enzymes of MsrA, strongly suggesting that this factor could be a regulator of the enzyme. In this study, cell lines were transfected with a luciferase reporter gene linked to different fragments of the 5’ non coding region of the human msrA gene (2000, 1408, and 260 pb). The results showed that in the presence of FOXO3A, the promoter activity of MsrA increases significantly, and when the FOXO site located at -920 pb of the translation start site of the MsrA is mutated, the activation by this factor significantly decreased ed by 50%. Other possible stimuli of the MsrA promoter were evaluated. Cellular cultures transfected with the previously described construction of 2000 pb, were treated with hydrogen peroxide and the antioxidant Resveratrol; an increase in the activity of the promoter was observed, independent from the activation by FOXO3A.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La transcripción del DNA, primera etapa de la expresión génica, corresponde a la conversión de un DNA molde a RNA por acción enzimática de la RNA polimerasa (RNAP). En las células de los organismos eucariontes existen tres clases de RNA polimerasas nucleares (RNAP I, II y III). Cada clase de RNAP reconoce promotores específicos mediante la formación de complejos de preiniciación (Pre-initiation Complex o PIC) entre la RNAP y el uso factores de transcripción generales (General Transcription Factors o GTFs), siendo estos últimos los que dan especificidad a cada PIC. Los promotores son secuencias de DNA, normalmente ubicadas río arriba del inicio de la transcripción (Transcription Start Site o TSS), relativamente conservadas en el genoma, que poseen todos los elementos en cis necesarios para el inicio y la regulación de la transcripción de un gen. Los promotores de la RNAP II son los más estudiados y se clasifican en los que poseen caja TATA y en los que no, llamados TATA-Less. Entre los factores de transcripción que se unen a estos promotores están TFIIB, TFIID, TFIIA, entre otros. La caja HomolD es un elemento del promotor mínimo que se encuentra en un promotor de tipo TATA-less de secuencia consenso CAGTCACA, descubierto en genes de proteínas ribosomales de Schizosaccharomyces pombe, y que es capaz de reclutar la RNAP II e iniciar la transcripción. Estudios recientes indican que para iniciar la transcripción desde estos promotores se necesitan los siguientes GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH y TFIIE. Además, se ha propuesto que el factor Rrn7 (antes conocido como miembro de la maquinaria de la RNAP I) podría interaccionar con algunos de estos GTFs, como por ejemplo TFIIB y/o TBP (miembro del complejo TFIID), lo que le conferiría a Rrn7 la facultad de unirse a la caja HomolD y dirigir la transcripción. Sin embargo, aún se desconoce cuáles de estos factores junto a Rrn7 conforman el PIC, que se ensambla sobre la caja HomolD. En este trabajo se estudió la participación de los factores TFIIB y TBP, como miembros candidatos del complejo de pre-iniciación formado sobre la caja HomolD. Mediante ensayos en geles de retardo o EMSA y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina se analizaron las interacciones DNA-proteína y proteína-proteína. Para realizar los ensayos de EMSA fue necesario expresar y purificar la proteína Rrn7 recombinante utilizando una etiqueta de histidina, la que se utilizó junto a TBP y TFIIB. Además, se purificaron anticuerpos policlonales contra ambos factores, y fueron usados en ensayos de EMSA a modo de control. Los resultados de los EMSA muestran una intensificación de la banda representativa al complejo Rrn7-caja HomolD al agregar cada factor a la reacción (TFIIB o TBP). Los ensayos de ChIP se realizaron en una cepa silvestre de S. pombe utilizando los mismos anticuerpos purificados contra los factores TBP y TFIIB. El DNA obtenido, fue sometido a amplificación mediante PCR utilizando partidores específicos para la caja HomolD. Además se realizaron dos controles, uno utilizando partidores que amplificaron parte del promotor y del primer exón del gen nmt1 para la caja TATA como control positivo, y otros para una región del gen de actina (act1) como control negativo. Se observó amplificación del DNA representativo a la caja HomolD, al precipitar cada factor, reflejando la presencia de éstos en la región promotora. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran in vitro (EMSA) un efecto potenciador de TBP y TFIIB sobre la formación del complejo Rrn7-caja HomolD, lo que es complementario a la presencia mostrada in vivo (ChIP) de estos factores en el promotor. De estos experimentos se concluye la participación de ambos factores en la formación del complejo de pre-iniciación sobre la caja HomolD. Además los resultados de EMSA indicaron que TFIIB posee un efecto potenciador mayor que TBP a una determinada concentración. Por otro lado, en ensayos EMSA ambos factores produjeron un desplazamiento o retardo de la banda del complejo Rrn7-HomoID, pero el desplazamiento provocado por TBP fue más intenso y estable, a diferencia del de TFIIB que fue solo temporal. Estos resultados sugieren que los roles que cumplen los factores TFIIB y TBP en el PIC en la caja HomolD, son el de un factor reclutador de Rrn7 al promotor y el de un factor potenciador de la interacción proteína-DNA, respectivamente / DNA transcription, the first stage of gene expression, is defined as the conversion of a template DNA to RNA by the enzymatic action of the RNA polymerase (RNAP). In the eukaryotic cells there are three classes of nuclear polymerases (RNAP I, II and III). Each class of RNAP recognizes specific promoters through the formation of pre initiation complexes (PIC) between the polymerase and general transcription factors (GTF). The latter provide the specificity to each PIC. These promoters are relatively conserved DNA sequences that usually are located upstream from the transcriptional start site (TSS), and have all the cis elements needed for the start and regulation of the transcription of a gene. RNAP II promoters are the most studied ones, and are categorized as those that have a TATA box or those that lack a TATA box, called TATA-less promoters. The factors that bind to these promoters are TFIIB, TFIIA and TFIID, among others. The HomolD box is a core promoter element (CPE) that is found in a TATAless type promoter, whose consensus sequence is CAGTCACA. This CPE was discovered in ribosomal protein genes of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and recruits RNAP II and starts transcription. Recent studies have shown that to start transcription from these RNAP II promoters the GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH and TFIIE are needed. Furthermore, it has been proposed that the Rrn7 factor (formerly known as a member of the RNAP I machinery) interacts with some of these GTFs, for instance with TFIIB and/or TBP (member of the TFIID complex), which could confer Rrn7 the ability to bind the HomolD box and promote transcription. However, it is still unknown which of these factors in addition to Rrn7 conform the PIC that assembles over the HomolD box. In this work the participation of the factors TBP and TFIIB, as candidate members of the PIC formed over the HomolD box, was studied. Using Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation assays (ChIP), DNA-protein and protein-protein interactions were analyzed. To carry out the EMSA studies, it was necessary to express and purify the recombinant Rrn7 protein using a 6xHis tag, which was then used with the factors TBP and TFIIB, also recombinant from S. pombe. Additionally, polyclonal antibodies for both factors were purified and used in EMSA experiments as a control. The EMSA results showed an intensification of the band representative of the complex when each factor was added to the reaction (TBP or TFIIB). ChIP assays were performed in a wild type S. pombe strain, using the same antibodies purified for TFIIB and TBP. The DNA obtained was amplified with PCR using specific primers for the HomolD box. Two controls were carried out, one using primers that amplified part of the promoter and the first exon of the nmt1 gene for the TATA box as a positive control. The other control used primers for a region of the actin gene (act1) as a negative control. When each factor was precipitated, an amplification of the HomolD box sequence, revealing the presence of both factors at the promoter region. Results obtained in this work show in vitro (EMSA) an enhancer effect of TBP and TFIIB on the formation of the Rrn7-HomolD box complex, which is complementary to the presence shown in vivo (ChIP) of these factors in the promoter. From these experiments it is concluded that both factors participate in the formation of the PIC over the HomolD box. Furthermore, the EMSA results indicate that TFIIB has a greater enhancer effect than TBP. On the other side, EMSA assays of both factors produced a shift of the complex Rrn7-HomolD band, but the one produced by TBP was more intense and stable, in comparison with the complex produced by TFIIB, which was temporal and less intense. These results suggest that TFIIB recruits Rrn7 to the PIC and that TBP enhances the interaction between protein and DNA of the PIC at the HomolD box

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Memoria para optar el título de Bioquímico / TonEBP es el factor transcripcional de eucariontes responsable de regular la transcripción de genes involucrados en la respuesta al estrés osmótico. Las proteínas codificadas por estos genes permiten la acumulación de osmolitos orgánicos compatibles, tales como sorbitol. Este se genera a partir de glucosa por la acción de aldosa reductasa (AR). Se desconoce si TonEBP está presente en el cardiomiocito neonato como en el adulto y si se regula por cambios en la osmolaridad externa como también por estrés oxidativo. Los resultados inmunocitoquímicos y de Western blot mostraron que basalmente TonEBP y AR están en el citosol y núcleo de manera homogénea en cardiomiocito de rata neonata, sin embargo en cardiomicitos adultos TonEBP y AR basalmente se encuentran sólo en la periferia celular. Cultivos primarios de cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico (Sorbitol 600 mOSm) por 8, 16 y 24 h, mostraron un aumento de TonEBP y de su translocación al núcleo. Los niveles de AR y su actividad también aumentaron significativamente a las 8, 16 y 24 h postestímulo. En cambio, los cultivos expuestos a estrés hiposmótico (30% de dilución del medio de cultivo, 202 mOsm), la cantidad de proteína de TonEBP y AR disminuyeron respecto al control y no se detectó actividad de AR. Dado que nuestro laboratorio previamente demostró que el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol genera ROS y aumenta los niveles intracelulares de Ca2+, también se estudió sus efectos en la regulación de TonEBP. Los resultados mostraron que la translocación de TonEBP al núcleo es independiente del calcio y que las ROS son necesarias pero no suficiente para su completa activación. Bajo estas últimas condiciones, TonEBP migró al núcleo pero no se activó dado que no aumentaron sus niveles de proteína ni los de su gen blanco AR. En su conjunto, estos resultados sugieren que TonEBP está presente en el cardiomiocito y tanto este factor transcripcional como AR modifican sus niveles y actividad en respuesta a cambios en la osmolaridad externa en forma independiente del calcio. El estrés oxidativo estimuló su translocación al núcleo pero no su activación / The transcription factor TonEBP has been implicated in regulation of gene transcription involved in the response to osmotic stress. These genes allow the accumulation of intracellular organic osmolytes and protect to the cell against hypertonicity, normalizing both cell volume and inorganic ion concentration. Sorbitol, one of these compatible organic osmolytes, is generated from glucose by action of Aldose Reductase (AR). It remains unknown whether TonEBP is present in the neonate and adult cardiac myocytes and if it is regulated by changes in the external osmolality and also by oxidative stress. Both immunofluorescence and Western blot results showed that in basal conditions, TonEBP and AR were localized in the cytosol and nucleus in equal amount of cultured neonatal cardiac myocytes. But in adult rats in basal conditions, TonEBP and AR were localizated only in the external membrane cellular. When these cells were exposed to hyperosmotic stress (Sorbitol 600 mOSm) by 8, 16 and 24 h, TonEBP levels increased and it is translocated to the nucleus. Levels of AR and their activity also increased significantly after 8, 16 and 24 h post-stimulus. However, cells exposed to hyposmotic stress (30% dilution in culture medium, 202 mOsm), the amounts of TonEBP and AR decreased respect to controls and AR activity was not detected. On the other hand, our laboratory has previously shown that hyperosmotic stress induced by Sorbitol generates ROS and induces increase in intracellular calcium levels. We tested whether these variables regulates TonEBP. The results showed that nuclear translocation of TonEBP was independent of calcium but ROS were necessary but not sufficient for a complete TonEBP activation. Under these conditions, TonEBP is translocated to the nucleus but that was not induced and neither increased AR levels. Collectivelly, these results suggest TonEBP is present in cultured cardiac myocytes and response to changes in the external osmolality independent of calcium. Nevertheless oxidative stress was not sufficient for a complete activation of TonEBP

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / La hipertensión arterial es uno de los factores de riesgo cardiovascular más importante en todo el mundo industrializado. En las últimas décadas, la vía de señalización RhoA/ROCK ha mostrado tener un rol clave en la hipertensión arterial al ser responsable de la sensibilización del calcio en células musculares lisas y estimular diversos procesos celulares, entre los que se incluye al crecimiento, diferenciación, proliferación y migración celular entre otros. En este trabajo se planteó como hipótesis que “La vía RhoA/ROCK está sobreactivada en ratas hipertensas, generando una mayor fosforilación de las proteínas Smad2/3 en tejido de aorta, ventrículo izquierdo y riñón, resultado que se ve revertido por la administración de candesartán y/o fasudil”. Los objetivos de este estudio fueron: a) Investigar los efectos antihipertensivos de fasudil y/o candesartan el modelo de hipertensión arterial experimental por sobrecarga de volumen independiente de renina y b) estudiar si fasudil y/o candesartan modifican las formas totales y fosforiladas de Smad2/3 en aorta, ventrículo izquierdo y riñón de ratas hipertensas y controles. Para responder a estos objetivos, ratas Sprague Dawley se uninefrectomizaron y trataron con DOCA (100 mg/kg/semana) más dieta hipersódica (NaCl 1%; KCl 0,4%) por 6 semanas para generar hipertensión arterial por sobrecarga de volumen. Fasudil (50 mg/kg/día) y candesartán (10 mg/kg/día) se administraron por gavage desde la tercera semana de hipertensión. Al término del tratamiento, se determinó presión sistólica y peso corporal. Los animales se sacrificaron, extrayéndose la aorta toraco-abdominal, corazón y riñón. Estos tejidos se pesaron y se almacenaron a -80°C hasta su procesamiento. La fracción soluble de extractos tisulares se utilizaron para separar las proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamina-SDS y detectar las formas fosforiladas y totales de Smad2/3 por Western blot. Los resultados mostraron que las ratas experimentaron un aumento del 42% en la presión arterial sistólica debido a la administración de DOCA-sal: 164 vs 118 mmHg. El peso disminuyó significativamente en las ratas Doca-sal mientras que las masas cardiaca y pulmonar relativa aumentaron significativamente (p<0,01). Fasudil y candesartán redujeron la presión arterial significativamente (fasudil: 111 mmHg, candesartán: 125 mmHg). Sin embargo, no se observó sinergia al asociar fasudil con candesartán. Solo candesartán pero no fasudil atenuaron el efecto de la hipertensión arterial sobre el peso corporal y las masas cardiaca y pulmonar relativas. Por otro lado, los niveles de las formas fosforiladas de Smad2/3 no cambiaron por acción de la administración DOCA/sal ni tampoco por efectos de fasudil o candesartán ni ambos lograron disminuir la fosforilación de Smad2/3 en aorta, ventrículo izquierdo y riñón. Los niveles de relativos de las formas totales de Smad2/3 tampoco se modificaron en estos grupos y tejidos, excepto en riñón (p<0,05). Se concluye de este trabajo de tesis que fasudil y candesartán redujeron el aumento de la presión arterial inducida por la administración de DOCA/sal, pero su asociación no logró un efecto sinérgico. Candesartán pero no fasudil atenuó la hipertrofia cardiaca inducida por la sobrecarga de presión. Los factores transcripcionales Smad2/3 no se activan en este modelo de hipertensión experimental ni tampoco por acción de fasudil o candesartán en los tejidos blancos estudiados / The arterial hypertension is one the most important cardiovascular risk factor in the industrialized world. In the last decades, the RhoA/ROCK signaling pathway has a key role in the arterial hypertension. This pathway is responsible for calcium sensitization in smooth muscle cells but it also regulate cell growth, differentiation, proliferation and migration in these cells. We hypothesized here that “The RhoA/ROCK pathway is upregulated in hypertensive rats, promoting and activation of Smad2/3 transcription factor in aorta, left ventricle and kidney, effect that is prevented by fasudil and/or candesartan”. The specific aims were: a) To investigate the effect of fasudil and/or candesartan on systolic blood pressure and cardiac hypertrophy in an experimental renin-independent hypertension model. b) To study if fasudil and/or candesartan modify total and phosphorylated Smad2/3 levels in aorta, left ventricle and kidney in hypertensive and control rats. To this end, Sprague Dawley rats were uninephrectomized and treated with DOCA (100 mg/kg/week) and NaCl 1%; KCl 0.4% for 6 weeks to develop hypertension induced by volume overload. Fasudil (50 mg/kg/day) and candesartan (10 mg/kg/day) were administrated by gavage since third week of hypertension. At end of treatment, systolic pressure and body weight were measured. The animals were sacrified, and toraco-abdominal aorta, heart and kidney were obtained, weighted and stored at -80°C until processing. Protein from soluble tissue fraction were resolved polyacrylamide-SDS electrophoresis and total and phosphorylated Smad2/3 levels were determined by Western blot. The results showed that the DOCA-salt administration induced a 42% increase in systolic blood pressure and a significantly decreased in body weight. Relative cardiac and pulmonary mass were significantly increased (p<0,01) in DOCA-salt treated rats. Fasudil and candesartan decreased systolic blood pressure significantly. However any synergistic effect was observed by fasudil-candesartan coadministration. Only candesartan but not fasudil prevented the increase in systolic blood pressure induced by DOCA/salt and in the relative cardiac and pulmonary mass. Both total and phosphorylated Smad2/3 levels did not change by the DOCA-salt administration or by fasudil or candesartan in the studied tissues Total Smad2/3 protein levels did not change by effect of hypertension, fasusil or candesartan , except in kidney (p<0,05). In summary, fasudil and candesartan prevented hypertension induced by DOCAsalt administration butany synergistic effect was observed between both drugs. Candesartan but not fasudil attenuated cardiac hypertrophy induced by volume overloadhypertension. The Smad2/3 transcriptional factors were not activated in the studied tissues using this experimental hypertension model and neither fasudil or candesartan

Memoria para optar al título Profesional de Bioquímico / El desarrollo embrionario en vertebrados es coordinado por una red de señales y factores de crecimiento que comandan diferentes procesos celulares. Sonic Hedgehog (SHH), es un ligando considerado como un regulador maestro que dirige los procesos de proliferación celular, migración, apoptosis, sobrevida y diferenciación celular. SHH es liberado al medio y una vez que llega a su célula blanco, ésta activa una compleja vía de señalización intracelular, que finalmente, moviliza a los factores transcripcionales Gli. Estos últimos activan la expresión de genes blanco de la vía reconociendo secuencias específicas en el ADN llamadas GBS (del inglés “Gli Binding Site”). Además, se sabe que una desregulación en la vía de SHH/Gli puede llevar al desarrollo de cáncer, como ocurre en los casos del meduloblastoma y el cáncer de células basales de la piel, entre otros. Recientemente, por resultados obtenidos en el laboratorio, se estableció que en los modelos de ratón y pez cebra, el gen neogenina 1 es un blanco transcripcional de la vía SHH/Gli. Considerando la conservación evolutiva de la vía de SHH/Gli y la característica multifuncional de la proteína Neogenina 1, un receptor de membrana que responde a diferentes ligandos, sumado a su reciente implicancia en cáncer, se planteó estudiar a Neogenina 1 como un nuevo blanco transcripcional directo de la vía SHH/Gli, en un modelo celular de neuroblastoma humano, una patología donde se sabe que la vía está activada. En ensayos de pérdida de función farmacológica de SHH realizados en cultivos celulares de neuroblastoma humano, se observó que la expresión de Neogenina 1 disminuía de manera dosis dependiente. A partir de este resultado, se realizó un análisis in silico que determinó la existencia de tres posibles GBS en la secuencia de Neogenina 1: GBS 1 ubicado a los 18,6 Kb río arrida desde el inicio de la traducción, GBS 2 y GBS 3, localizados dentro del primer intrón, a 39,1 y 54,4 Kb desde el inicio de la traducción, respectivamente. Luego, se estudió el reconocimiento y la unión de factores transcripcionales Gli a los posibles GBS mediante ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en células de neuroblastoma. Sólo el sitio GBS 3 fue reconocido por Gli 2. Finalmente, para evaluar la funcionalidad de los GBS encontrados en Neogenina 1, éstos se clonaron río arriba del gen reportero luciferasa. Concordante con el resultado del ChIP, sólo el sitio GBS 3 activó la expresión de luciferasa en respuesta a la activación con Gli 2. Por lo tanto, este trabajo de tesis permite establecer a Neogenina 1 como un nuevo gen blanco transcripcional directo de la vía SHH/Gli en modelo celular de neuroblastoma humano. Con esto, se pretende aportar al entendimiento de los mecanismos celulares que hacen a SHH contribuir en procesos tan diversos durante el desarrollo embrionario y que probablemente subyacen al desarrollo de cáncer. / The patterning and growth of a multicellular embryo is orchestrated by a number of developmental signaling pathways, such as the Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway. SHH is considered a master regulator controlling a variety of complex processes such as proliferation, cellular migration, apoptosis, differentiation and cellular survival. SHH is secreted by a group of specialized cells and once reaching its receptors in targets cells, activates a complex intracellular signaling pathway that finally mobilizes the Gli transcriptional factors. These factors move to the nucleus and recognize specific sequences in the DNA known as Gli Binding Sites (GBS), activating the transcription of their target genes. It is known that a deregulation of the SHH pathway drives the development of several cancers, like medulloblastoma and basal cell carcinoma. Recently our laboratory established neogenin 1 as a transcriptional target of the SHH/Gli pathway both in the mouse and zebra fish models. Considering the evolutionary conservation of de SHH/Gli pathway and the multifunctional properties of Neogenin 1, a transmembrane receptor that binds different ligands, and that has been implicated in cancer, we proposed to study human Neogenin 1 gene as a new and direct transcriptional target of the SHH/Gli pathway using a human cell line of neuroblastoma, a cancer where this pathway is constitutively active. In pharmacological SHH-loss of function assays made in neuroblastoma cell cultures, we observed that Neogenin 1 expression was decreased in a dose-dependent manner. Based on this result, we performed an in silico analysis that showed the presence of three putative GBS in the Neogenin 1 sequence: GBS 1, located 18.6 Kb upstream from the translation start, and GBS 2 and GBS 3, which were located within the first intron, 39.1 Kb and 54.4 Kb from the translation start, respectively. Next, we studied the Gli transcriptional factor recognition and binding to these putative GBS through chromatin immunoprecipitation (ChIP) in neuroblastome cells. We found that only Gli 2 activator recognized only GBS 3. Finally, in order to evaluate the Neogenin 1 GBS functionality, we cloned them upstream of the luciferase reporter gene. Concordant with the ChIP result, only the GBS 3 induced luciferase expression upon Gli 2 stimulation. In summary, this thesis proposes Neogenin 1 as a new direct transcriptional factor of the SHH/Gli pathway in a human neuroblastoma cell model. Our results aim to contribute to the understanding of how the SHH pathway is involved in diverse processes during embryonic development, and also, to the cellular mechanisms that explain the role of SHH in cancer. / Fondecyt 1110237

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Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es el cáncer ovárico más común, siendo en Chile la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Un aspecto importante para la mantención y progresión tumoral es el establecimiento de nueva vasculatura. En COE, NGF y su receptor TRKA son mediadores directos de angiogénesis in vitro, e indirectos al inducir la expresión y secreción de VEGF. El factor transcripcional RUNX2 induce procesos oncogénicos como proliferación, migración e invasión celular. Adicionalmente, se cree que RUNX2 puede ser un mediador de angiogénesis tumoral, ya que en varios modelos de cáncer promueve la expresión de VEGF y sus niveles proteicos se incrementan en hipoxia. En COE, RUNX2 los niveles se relacionan con mal pronóstico y en modelos in vitro promueve proliferación, migración e invasión en células de cáncer ovárico, sin embargo, no existen estudios que busquen vincularlo con angiogénesis en este cáncer. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial se produce un aumento en los niveles de RUNX2, y en la línea celular A2780 de cáncer ovárico sus niveles son incrementados por los factores proangiogénicos NGF e hipoxia cuando se comparan con la línea celular HOSE de epitelio superficial ovárico normal. Objetivos: Establecer si RUNX2 se expresa en cáncer ovárico epitelial, si sus niveles se incrementan con la progresión de la transformación maligna del epitelio ovárico, y determinar si en el modelo de líneas celulares, RUNX2 es aumentado por las condiciones proangiogénicas de hipoxia y estímulo con NGF. Metodología: Se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en tejidos ováricos (OVI, ovario normal inactivo; TBE-TBO, tumores ováricos Benignos y Borderline; y COE) mediante Western Blot, y a través de inmunohistoquímica se determinó el % células positivas con RUNX2 nuclear. En las líneas celulares HOSE y A2780 se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en extractos totales y en fracciones subcelulares mediante Western Blot, y su localización subcelular mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizaron estímulos con NGF, CoCl2 y ensayos de hipoxia en ambas líneas celulares, para posteriormente determinar los niveles proteicos de RUNX2 y HIF-1α por Western Blot. Resultados: Se determinó que los tejidos ováricos correspondientes a TBE-TBO y COE presentaron un mayor porcentaje de células positivas para RUNX2 nuclear respecto a lo observado en OVI. Por otro lado, ambas líneas celulares, HOSE y A2780, presentaron RUNX2 con localización principalmente nuclear, mostrando la línea HOSE niveles más altos respecto a la línea A2780. Los estímulos con NGF y CoCl2 no modificaron los niveles proteicos de RUNX2 en las líneas celulares en las condiciones analizadas. Por otra parte, se determinó que en la línea celular HOSE los niveles de RUNX2 disminuyen durante hipoxia, manteniéndose constantes los de HIF-1α. En el caso de las células A2780, no se observaron cambios en los niveles de las proteínas RUNX2 y HIF-1α en condiciones de hipoxia. Conclusiones: El presente trabajo permite concluir que los tejidos transformados de epitelio ovárico poseen un alto porcentaje de células con RUNX2 nuclear. Consistente con esto, la línea celular A2780 presenta altos niveles de RUNX2 en el núcleo, sugiriendo estos antecedentes un rol de RUNX2 en COE. Por otro lado, en las condiciones evaluadas, NGF e hipoxia no produjeron cambios en los niveles de RUNX2 en las líneas celulares. Proyección: Es necesario realizar nuevos ensayos para determinar con certeza si las condiciones proangiogénicas de NGF e hipoxia pueden inducir angiogénesis a través de RUNX2 en COE. En el caso de NGF es necesario evaluar si este puede influenciar la actividad transcripcional de RUNX2, y en el caso de hipoxia, se requiere modificar las condiciones experimentales para determinar con mayor seguridad si la restricción de oxígeno afecta los niveles de RUNX2 / Epithelial ovarian cancer (COE) is the most common ovarian cancer, being Chile the second cause of death due to gynecological neoplasias. An important aspect for tumor maintenance and progression is the establishment of new vasculature. In COE, NGF and its TRKA receptor are direct mediators of in vitro angiogenesis, and indirectly by inducing VEGF expression and secretion. RUNX2 transcriptional factor induces oncogenic processes such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, it is believed that RUNX2 may be a mediator of tumor angiogenesis, since in several cancer models it promotes the expression of VEGF and its protein levels increase in hypoxia. In COE, RUNX2 levels are related to poor prognosis and in vitro models promote proliferation, migration and invasion in ovarian cancer cells, however, there are no studies that seek to link it with angiogenesis in this cancer. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer there is an increase in RUNX2 levels, and in the A2780 cell line of ovarian cancer their levels are increased by the proangiogenic factors NGF and hypoxia when compared to the HOSE cell line of normal ovarian surface epithelium. Objective: To establish whether RUNX2 is expressed in epithelial ovarian cancer, if its levels increase with the progression of malignant transformation of ovarian epithelium, and to determine if RUNX2 is increased in the cell lines model by the proangiogenic conditions of hypoxia and stimulation with NGF. Methods: RUNX2 protein levels in ovarian tissues (OVI, normal ovary, TBE-TBO, Benign ovarian tumors and Borderline, and COE) were evaluated by Western Blot, and by means of immunohistochemistry the percentage of RUNX2 nuclear positive cells was determined. In the HOSE and A2780 cell lines the protein levels of RUNX2 in total extracts and subcellular fractions were evaluated by Western Blot, and its subcellular localization by immunocytochemistry. Additionally, stimuli were performed with NGF, CoCl2 and hypoxia assays in both cell lines, to later determine the protein levels of RUNX2 and HIF-1α by Western Blot. Results: It was determined that the ovarian tissues corresponding to TBE-TBO and COE presented a higher percentage of RUNX2 nuclear positive cells than observed in OVI. On the other hand, both cell lines, HOSE and A2780, presented RUNX2 with mainly nuclear localization, showing the line HOSE levels higher than the line A2780. The stimuli with NGF and CoCl2 did not modify the protein levels of RUNX2 in the cell lines in the conditions analyzed. On the other hand, it was determined that in the HOSE cell line the levels of RUNX2 decrease during hypoxia, keeping those of HIF-1α constant. In the case of A2780 cells, no changes were observed in the levels of the RUNX2 and HIF-1α proteins under conditions of hypoxia. Conclusions: The present work concludes that the transformed tissues of ovarian epithelium possess a high percentage of cells with nuclear RUNX2. Consistent with this, the A2780 cell line presents high levels of RUNX2 in the nucleus, suggesting this background a RUNX2 role in COE. On the other hand, under the conditions evaluated, NGF and hypoxia did not produce changes in the RUNX2 levels in the cell lines. Projection: Further testing is required to determine with certainty whether the proangiogenic conditions of NGF and hypoxia may induce angiogenesis tHRPough RUNX2 in COE. In the case of NGF it is necessary to evaluate if this can influence the transcriptional activity of RUNX2, and in the case of hypoxia, it is necessary to modify the experimental conditions to determine more safely if the oxygen restriction affects RUNX2 levels / Fondecyt

Magister en biomedicina celular y molecular / En Chile la incidencia y mortalidad del cáncer de próstata (CaP) está aumentado, siendo actualmente la segunda causa de muerte por cáncer en hombres. Durante la progresión tumoral las células epiteliales disminuyen sus moléculas de adhesión, polaridad, posicionamiento, reordenan su citoesqueleto y aumentan sus capacidades migratorias e invasivas. Todos estos cambios se conocen bajo el concepto de Transición Epitelio-Mesénquima (TEM). La TEM se caracteriza por el aumento de ciertos factores transcripcionales, tales como SNAIL1, que reprime genes característicos de un fenotipo epitelial, como E-cadherina, y aumenta indirectamente la expresión de genes que promueven el fenotipo mesenquimático. Se propone que el factor transcripcional SNAIL1 disminuye la proliferación y aumenta las capacidades migratorias e invasivas en líneas celulares de CaP. Para ello se trabajó con las líneas celulares LNCaP y PC3 con expresión ectópica y silenciamiento de SNAIL1 obtenidas mediante el uso de vectores lentivirales. Se caracterizó la expresión de marcadores de TEM mediante PCR en tiempo real, western blot e inmunofluorescencia. Además, se analizó la sobrevida mediante MTS; proliferación utilizando anticuerpos contra PCNA y Ki-67; migración a través de placas con poros de 8 μm (que permiten el paso de células) e invasividad mediante cámaras de membranas cubiertas con una capa de membrana basal. Complementariamente se determinó la apoptosis mediante un kit que contiene un sustrato que es modificado por las caspasas 3 y 7. Se determinó que ambas líneas celulares de CaP con sobreexpresión y silenciamiento de SNAIL1 la proliferación y sobrevida disminuyen. Sin embargo, la sobreexpresión de SNAIL1 disminuye la apoptosis respecto a las células con silenciamiento de la expresión de éste gen, en las cuales aumenta la muerte celular. Respecto a las capacidades migratorias e invasivas, aumentaron sólo en las células con sobreexpresión de SNAIL1 y disminuyeron en las células con silenciamiento. En conclusión, células de CaP con sobreexpresión de SNAIL1 exhibieron características fenotípicas tipo TEM, mientras que el silenciamiento de éste represor transcripcional condujo a las células a un fenotipo tipo epitelial con la disminución de características mesenquimales como la migración e invasión. / FONDECYT No 1110269