Le poisson Astyanax mexicanus présente, au sein de la même espèce, plusieurs populations de poissons de rivières (SF) et de poissons de grottes aveugles (CF). Chez les poisons cavernicoles aveugles, les yeux se développent presque normalement pendant l’embryogenèse. Mais 24 heures après la fécondation (hpf), quand l’embryon éclot, le cristallin entre en apoptose, ce qui déclenche la dégénérescence progressive de l’œil entier. Mon projet de thèse visait à comprendre le mécanisme conduisant à l’apoptose du cristallin, jusqu’alors totalement incompris, en partant du postulat selon lequel le défaut devait avoir lieu pendant les stades précoces du développement du cristallin. Le cristallin se développe à partir d’une placode, un épaississement de l’ectoderme au stade neurula. Toutes les placodes, qui donnent naissance à des organes des sens de la tête, sont issues du champ panplacodal, situé à la bordure de la plaque neurale antérieure à 10 hpf. Nous avons comparé la régionalisation de ce champ chez les deux morphes, par hybridations in situ de gènes marqueurs des différentes placodes. Chez le CF, le territoire présomptif du cristallin est réduit à 10 hpf, et le cristallin est plus petit à tous les stades étudiés. D’autre part, la placode olfactive est étendue, et donne naissance à un épithélium olfactif plus large chez le CF. Les modifications de taille de ces deux placodes pourraient être le résultat évolutif d’un « trade-off » entre ces deux composantes sensorielles. La régionalisation modifiée du champ panplacodal chez le CF est due au moins partiellement à des différences spatiales et temporelles d’expression des molécules de signalisation Shh, Fgf, et peut-être Bmp4.Nous avons pensé que la petite taille du cristallin pouvait être la cause directe de son entrée en apoptose, par un défaut d’effet de communauté. Nous avons réalisé une ablation laser partielle des cellules précurseurs du cristallin à 12-14 hpf chez l’embryon SF, mimant ainsi la taille du cristallin CF. L’apoptose dans le petit cristallin des larves SF à 60 hpf n’a pas été augmentée, ce qui montre que la petite taille n’est pas suffisante pour induire l’apoptose.L’apoptose du cristallin pourrait aussi provenir de défauts de morphogenèse ou d’un problème de lignage cellulaire. Nous utilisons donc l’imagerie biphoton in vivo sur des embryons SF et CF, de 10 à 24 hpf, préalablement injectés au stade une cellule avec des ARNm de H2B-mCherry et Ras-GFP pour marquer les noyaux et les membranes. Les premiers résultats sur les poissons de surface montrent que nous pouvons suivre à rebours les cellules du cristallin de la fin du film jusqu’au champ panplacodal, et étudier la morphogenèse et les divisions.La différenciation du cristallin est également affectée chez le CF : au moins 5 cristallines, qui sont des protéines structurales du cristallin, ne sont pas exprimées correctement chez le CF, d’après des hybridations in situ et des qPCR. Cependant, le rôle fonctionnel de deux de ces modifications d’expression a été testé, et individuellement, elles n’expliquent pas le phénotype apoptotique. Nous émettons l’hypothèse qu’une combinaison de défauts d’expression de plusieurs cristallines serait à l’origine de l’apoptose du cristallin CF. Enfin, et plus largement, les forces évolutives qui ont conduit à la perte de l’œil chez Astyanax mexicanus ne sont pas encore comprises. Par une étude d’évolution moléculaire à l’échelle du transcriptome nous avons identifié des mutations fixées entre SF et CF, et avons pu mettre en évidence une accumulation de mutations dans des « gènes d’yeux » chez les CF. Cela suggère un relâchement de la pression de sélection sur ces gènes, peut-être devenus inutiles dans l’obscurité. De même, les séquences des cristallines de CF paraissent accumuler des mutations fixées à un taux élevé vu leur bas niveau de polymorphisme. / The fish Astyanax mexicanus presents, within the same species, several populations of river-dwelling surface fish (SF) and blind cave-living fish (CF). In blind cavefish, the eyes first develop almost normally during embryogenesis. But 24 hours after fertilization (hpf), when the embryo hatches, the lens enters apoptosis, which triggers the progressive degeneration of the entire eye. My thesis project aimed at understanding the mechanism leading to lens apoptosis, which was so far unknown. We reasoned that the defect(s) should take place during the early stages of lens development. The lens develops from a placode, a thickening of the ectoderm at the neurula stage. All placodes, giving rise to sense organs of the head, originate from the “panplacodal” field, located at the border of the anterior neural plate at 10 hpf. We compared the patterning of the panplacodal field in the 2 morphs, using in situ hybridizations for placodal marker genes. In CF, the lens placode territory is reduced at 10 hpf, and the lens is smaller at all stages examined. Conversely, the olfactory placode is enlarged, and gives rise to a bigger olfactory epithelium in CF. The modifications in size of these two placodes could result evolutionarily from a trade-off between these two sensory components. Developmentally, the modified patterning of the panplacodal field in CF is at least partly due to the spatial and temporal differences in the expression of Shh and Fgf (and perhaps Bmp4) signaling molecules.We hypothesized that the small size of the lens could be the direct cause of its apoptosis, through a lack of community effect. We performed partial laser ablation of lens precursor cells at 12-14hpf in surface fish (thereby mimicking the CF lens size). Apoptosis in the resulting small lens of SF larvae at 60hpf was not enhanced, showing that small size is not sufficient to induce apoptosis. Lens apoptosis could also result from morphogenesis defects or from a problem in cell lineage. We are performing two-photon live imaging, from 10 to 24 hpf, of SF and CF embryos previously injected at the one cell stage with H2B-mCherry and Ras-GFP mRNAs to label nuclei and membranes. First results on surface fish show that we can back-track lens cells to the panplacodal field, and follow morphogenesis and divisions. Lens differentiation is also affected in cavefish: at least 5 crystallins, which are lens structural components, are not expressed correctly in CF, based on in situ hybridization and qPCR data. However the functional role of two of these expression modifications / losses was tested and, individually, they don’t seem to explain the apoptosis phenotype. We propose that a combination of several crystallins expression defects would explain CF lens apoptosis.Finally, and more globally, evolutionary forces that led to eye loss in Astyanax mexicanus are not yet understood. Through a transcriptome-wide molecular evolution approach, we identified fixed mutations in transcripts between SF and CF, and we could show an accumulation of mutations in “eye genes” in CF. This suggests that the selection is relaxed on these genes, that have maybe become useless in the dark. Similarly, CF crystallin sequences seem to accumulate fixed mutations at a high rate, considering their low polymorphism level.

Le génome humain contient environ 200 000 séquences d'origine rétrovirale (HERV), intégrées au fil de l'évolution et organisées aujourd'hui en familles multicopies complexes globalement réprimées par un contrôle épigénétique. L'étude du transcriptome HERV au niveau locus est compliquée par les similarités phylogénétiques au sein d'une famille et par la profusion des sites d'intégration, deux propriétés inhérentes aux éléments transposables. Dans ce travail, nous avons utilisé une méthode de conception de sondes de détection de 25 mer afin d'adresser la question de l'expression individuelle des HERV. Une puce à ADN haute densité intégrant plus de 5 500 séquences HERV et permettant une lecture fonctionnelle de l'activité de leurs LTRs a été utilisée sur un panel de tissus sains et cancéreux. Cela a permis d'identifier 1 718 séquences HERV actives, dont 326 LTRs promotrices et 209 LTRs polyA. L’étude de l’environnement génomique a mis en évidence une fenêtre d’environ 8 kb en amont des LTRs promotrices, caractérisée par une sous-représentation en gènes cellulaires en orientation sens. Nous avons également montré que le transcriptome des rétrovirus endogènes humains suit des règles de tropisme d’expression, qu’il est sensible aux états de différenciation cellulaire et qu’il ne semble pas être corrélé à l’âge des familles. Une première tentative d’exploitation de ce répertoire HERV dans un contexte clinique a visé à rechercher de nouveaux marqueurs diagnostiques du cancer de la prostate à partir de prélèvements urinaires, par la réalisation d’une étude pilote sur 45 patients / The human genome contains around 200,000 endogenous retroviral sequences (HERV) integrated during the evolution and which are nowadays organized into complex multicopy families, globally repressed by epigenetic control. The study of the HERV transcriptome at the locus level is complicated by phylogenetic similarities within one family and by the profusion of integration sites, two inherent characteristics of transposable elements. In this work, we used a method aiming to optimally characterize individual loci associated with 25 mer probes. A custom microarray dedicated to more than 5,500 HERV sequences and allowing a functional interpretation of the LTRs expression was used on a panel of normal and tumor tissues. We therefore identified 1,718 active HERV sequences, including 326 promoter LTRs and 209 polyA LTRs. The study of the genomic environment has highlighted an approximately 8 kb zone upstream of promoter LTRs characterized by a drastic reduction in sense cellular genes. We also showed that the HERV transcriptome follows tropism rules, is sensitive to the state of cell differentiation and, unexpectedly, seems not to correlate with the age of the families. In a first attempt to use the HERV repertoire in clinical, we sought to identify new markers of prostate cancer from urine samples. This goal was pursued by conducting a pilot study on 45 patients

Chez les eucaryotes, l’ARN polymérase (RNAP) III transcrit les ARN de transferts, l’ARN ribosomique 5S, et plusieurs douzaines d’autres ARNs non traduits. Le génome des mammifères contient plusieurs milliers d’éléments répétés, les SINEs. In vitro, leur transcription dépend de la RNAP III. Le taux de transcription de la RNAP III détermine la croissance et la prolifération cellulaires, sa dérégulation a été associée à de nombreux cancers. Afin de caractériser la distribution sur l’ensemble du génome de la RNAP III et de ses facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC, nous avons développé un protocole très spécifique de ChIP-seq en tandem. Nous avons déterminé l’ensemble des gènes liés par la RNAP III dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cet ensemble est bien inférieur au nombre de gènes prédits dans le génome. Nous avons également observé la RNAP III et ses facteurs de transcription liés à 30 régions non annotées, seule une d’entre elles est conservée chez l’humain. Un très faible nombre de SINEs sur un demi-million prédits est associé à la RNAP III. Notre étude révèle de nombreux sites liés uniquement par TFIIIC, nommés « extra-TFIIIC loci », ETC chez la levure. Ces sites sont associés à la protéine CTCF, et à la cohésine. La cohésine occupe les sites liés par CTCF, et contribue à la formation de boucles ADN, associées à la répression ou à l’activation de l’expression des gènes. Ces données suggèrent que TFIIIC peut jouer un rôle dans l’organisation de l’architecture chromosomique chez les souris. Nous avons également démontré que TCEA1, l’isoforme ubiquitaire de TFIIS, le facteur d’élongation de la RNAP II, est associée aux gènes actifs de classe III. Ceci suggére que TFIIS est un facteur de transcription de classe III. Finalement, la distribution de TFIIS aux gènes de classe II indique que le recrutement de TFIIS n’est pas suffisant pour contrôler la transition de la RNAP II pausée en 5’ des gènes en élongation. / In eukaryotes, RNA polymerase (RNAP) III transcribes the tRNAs, the 5S ribosomal RNA and a half a dozen known untranslated RNA. Mammalian genome contains several thousand of repeated elements, the Short interspersed repetitive elements (SINE). In vitro, they are transcribed by RNAP III. RNAP III transcription levels determine cell growth and proliferation and, importantly, its deregulation is associated with cancer. Looking at the genome-wide distribution of RNAP III and its transcription factors, TFIIIB and TFIIIC, we develop a highly specific tandem ChIP-sequencing method. We have determined the set of genes that are transcribed by RNAP III in mouse embryonic stem cells. We discovered that not all known class III genes were transcribed in ES cells. We also observed that RNAP III and its transcription factors were present at thirty unannotated sites on the mouse genome, only one of which was conserved in human. Only a couple of hundreds of SINEs out of more than half a million are associated with RNAP III in mouse ES cells. Our study reveals numerous ‘TFIIIC-only’ sites, called ETC for extra-TFIIIC loci in yeast. These sites are correlated with association of CTCF and the cohesin. Cohesin has been shown to occupy sites bound by CTCF and to contribute to DNA loop formation associated with gene repression or activation. This observation suggests that TFIIIC may play a role in chromosome organization in mouse. We also demonstrated that TCEA1, the ubiquitous isoform of TFIIS RNAP II elongation factor, is associated with active class III genes suggesting that TFIIS is a RNAP III transcription factor in mammals. Finally, the distribution of TFIIS on RNAP II-transcribed genes indicated that its recruitment does not control the transition of RNAP II paused at genes 5’ end into elongation.

Massively parallel whole transcriptome sequencing and its ability to generate full transcriptome data at the single transcript level provides a powerful tool with multiple interrelated applications, including transcriptome reconstruction, gene/isoform expression estimation, also known as transcriptome quantification. As a result, whole transcriptome sequencing has become the technology of choice for performing transcriptome analysis, rapidly replacing array-based technologies. The most commonly used transcriptome sequencing protocol, referred to as RNA-Seq, generates short (single or paired) sequencing tags from the ends of randomly generated cDNA fragments. RNA-Seq protocol reduces the sequencing cost and significantly increases data throughput, but is computationally challenging to reconstruct full-length transcripts and accurately estimate their abundances across all cell types. We focus on two main problems in transcriptome data analysis, namely, transcriptome reconstruction and quantification. Transcriptome reconstruction, also referred to as novel isoform discovery, is the problem of reconstructing the transcript sequences from the sequencing data. Reconstruction can be done de novo or it can be assisted by existing genome and transcriptome annotations. Transcriptome quantification refers to the problem of estimating the expression level of each transcript. We present a genome-guided and annotation-guided transcriptome reconstruction methods as well as methods for transcript and gene expression level estimation. Empirical results on both synthetic and real RNA-seq datasets show that the proposed methods improve transcriptome quantification and reconstruction accuracy compared to previous methods.

Cotesia congregata est une guêpe parasitoïde qui se développe à l’intérieur de la larve du Lépidoptère, Manduca sexta. Ce parasitoïde a développé une stratégie de virulence qui utilise un symbionte viral de la famille des Polydnavirus nommé Cotesia congregata bracovirus. Mon travail de thèse a permis de caractériser le dialogue moléculaire au cours de l’interaction par des approches de transcriptomique à haut débit et de physiologie. Ces travaux ont permis d’établir la première carte fonctionnelle du génome viral et de visualiser l’ensemble des gènes de M. sexta régulés au cours du parasitisme. La régulation des gènes de l’immunité a révélé que le parasitisme n’empêche pas l’induction de peptides antimicrobiens, mais entraine la sous-expression de gènes impliqués dans la réponse cellulaire. De plus j’ai pu mettre en évidence une réduction du nombre de cellules adhérentes au cours de l’interaction et décrire l’induction d’un phénotype de type apoptose d’une catégorie de cellules immunitaires. Ces résultats permettent d’identifier des gènes acteurs de l’interaction et apportent de nouvelles connaissances relatives aux interactions hôtes-parasitoïdes. / Cotesia congregata is a parasitoid wasp that develops inside the lepidopteran larvae, Manduca sexta. This parasitoid wasp has evolved virulence strategies using an obligate viral symbiont from the Polydnavirus family named Cotesia congregata bracovirus. My thesis work has allowed us to characterize the molecular dialogue during the interaction by physiological and high-throughput transcriptomic approaches. This work allowed to obtain the first functional map of the viral genome and to identify all M. sexta genes regulated during parasitism. Regulation of immune genes revealed that parasitism does not prevent induction of antimicrobial peptides, but leads to the down-regulation of genes involved in the cellular response. Moreover, I was able to demonstrate a reduction in the number of adherent cells during the interaction and to describe this induction as an apoptosis-like phenotype targeting a specific population of immune cells. These findings open the way to the identification of candidate genes involved in this particular interaction and provide new insights into host-parasitoid interactions in general.

En climat tempéré, le changement climatique aura pour conséquence une augmentation de la fréquence et de l’intensité des sécheresses. Parmi les facteurs influençant la survie des espèces à cet environnement fluctuant, la plasticité d’ajustement des traits de réponse semble constituer un atout majeur. Ce travail de thèse a étudié de façon intégrée la réponse physiologique et transcriptionnelle du peuplier noir à une carence hydrique progressive jusqu’à un niveau sévère. Dans le cadre d’une analyse globale, la plasticité des traits de réponse physiologiques de la plante et, pour la première fois, celle de l’expression des gènes foliaires a été estimée. Différentes échelles d’étude ont été prise en compte : les génotypes issus de populations différentes, les clones d’un même génotype et les structures de la feuille (nervure principale versus limbe). Un continuum de réponses phénotypiques au déficit hydrique sévère a été identifié permettant de classer la majorité des génotypes étudiés comme évitants avec un seul génotype tolérant, maintenant son développement foliaire, conservant ses feuilles matures et limitant la tension hydrique. Le transcriptome du limbe était profondément remodelé en réponse au déficit hydrique maximal (41% des transcrits différentiellement exprimés) et présentait des fonctions en lien avec la modification de la composition membranaire, le maintien de l’homéostasie cellulaire et la détoxication. L’expression des gènes liés au transport intra- et extra-cellulaire et aux flux d’eau (par les aquaporines) était également fortement régulée. Ces gènes étaient associés aux fonctions de maintien de l’intégrité et de l’hydratation cellulaire du limbe. La modulation du transcriptome était partiellement spécifique de la nervure principale par rapport au limbe. Les 958 transcrits spécifiquement régulés de la nervure principale indiquaient une sur-expression des gènes liés aux métabolismes du glyoxylate et des carbohydrates, et une sous-expression des gènes liés au transport intra- et extra-cellulaire. Ceci pourrait favoriser une accumulation de sucres dans la nervure principale, ce qui permettrait de maintenir les flux de sève et de limiter l’embolie. Les plasticités phénotypiques et transcriptionnelles moyennes calculées étaient différentes entre génotypes. Le nombre de feuilles et le potentiel hydrique foliaire étaient les deux traits permettant de discriminer statistiquement les génotypes par leur plasticité. Le niveau de plasticité de certains transcrits était également spécifique des génotypes : la plasticité transcriptionnelle était forte pour les gènes impliqués dans la fixation du carbone et le transport des messagers secondaires pour le génotype, qui en moyenne, était le moins plastique. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le génotype le plus tolérant à la sécheresse possédait les plus faibles degrés de plasticités phénotypiques et transcriptionnelles. A l’inverse, les génotypes les plus sensibles détenaient des plasticités phénotypiques et transcriptionnelles plus fortes. Enfin, la régulation du degré de plasticité dépendrait à la fois de mécanismes conservés et d’autres acquis par les génotypes. / In temperate climates, climate change will result in an increase of the frequency and intensity of droughts. Among the factors influencing the species survival in fluctuating environment, trait responses plasticity seems to be a major asset. This thesis has focused on the integrated study of physiological and transcriptional responses of black poplar responding to a progressive water deficit until a severe level. For an overall analysis, plant phenotypic traits responses plasticity and, for the first time, plasticity of the leaf genes expression has been estimated. Different scales of study were taken into account: genotypes from different populations, clones of the same genotype and leaf structures (midrib versus leaf blade). A continuum of phenotypic responses to severe water deficit was identified allowing classifying the majority of the genotypes as sensitive with only one tolerant genotype, maintaining its foliar development, preserving its mature leaves and limiting hydraulic tension. The leaf blade transcriptome was deeply remodeled under severe drought (41% differentially expressed transcripts) and exhibited functions related to the modification of the membrane composition, maintenance of cellular homeostasis and detoxication. Transcripts related to intra- and extra-cellular transport and water flows (by aquaporins) were also highly regulated and associated with integrity and cellular hydration functions of the leaf blade. The transcriptome modulation was in part specific to the midrib compared to the leaf blade. The 958 specifically regulated transcripts of the midrib indicated up-regulation of genes implied in glyoxylate and carbohydrates metabolisms and down-regulation of genes involved in intra- and extra-cellular transport. In consequence, these modifications may favor sugar accumulation in the midrib and could force the sap flow and limit embolism. The estimated mean phenotypic and transcriptional plasticities were different between genotypes. The number of leaves and the leaf water potential were the two traits allowing discriminating statistically the genotypes by their plasticity. The plasticity level of some genes expression was also specific to genotypes: transcriptional plasticity was high concerning genes involved in carbon fixation and transport of secondary messengers for the genotype, which on average was the least plastic. All these results allowed concluding that the most drought-tolerant genotype possessed the lowest degrees of phenotypic and transcriptional plasticities. Conversely, the most sensitive genotypes hold high phenotypic and transcriptional plasticities. Finally, the regulation of the plasticity degree would depend on both preserved mechanisms and others acquired by the genotypes.

Les crinoïdes sont bien connus pour leurs fossiles, mais la biominéralisation de leurs stades larvaires n’est que peu documentée. La première partie du projet présente le développement des ossicules des trois stades larvaires du comatule Florometra serratissima : doliolaria, cystidienne et pentacrinoïde. Les ossicules du crinoïde démontraient de la plasticité phénotypique et de la désynchronisation dans leur développement. Les crinoïdes étant la classe basale des échinodermes modernes, ceci porte à croire que ces traits étaient aussi caractéristiques des échinodermes ancestraux et auraient joué un rôle dans la radiation hâtive et la grande disparité des échinodermes. Pour notre deuxième étude, comme les patrons de morphologie des crinoïdes et des autres échinodermes sont nombreux et sont régulés par des protéines spécifiques, nous avons vérifié la présence de quatre familles de protéines de la matrice de spicules (SMAP) connues chez les oursins dans les transcriptomes des autres échinodermes et d’autres deutérostomes. La famille des spicules matrix (SM) et l’anhydrase carbonique CARA7LA étaient absentes chez tout autre organisme que les oursins, les protéines spécifiques au mésenchyme (MSP130) étaient présentes en nombres différents chez tous les ambulacraires suggérant de multiples duplications et pertes, et les métalloprotéases étaient nombreuses chez chacun. Le développement des ossicules chez les échinodermes est un sujet qui a gagné en popularité au cours des dernières décennies, spécialement chez les oursins, et inclure les crinoïdes dans ce type d’étude permettra de nous renseigner sur l’origine et l’évolution des échinodermes modernes. / While the fossil record of crinoids is widespread and largely known, biomineralization of their larval stages is poorly documented. The first part of the project focuses on the ossicle development of the three larval stages of the feather star Florometra serratissima: doliolaria, cystidean and pentacrinoid. The ossicles of the crinoid showed phenotypic plasticity and asynchronous development. Crinoids form the basal class of living echinoderms; this prompts one to believe that these traits were also characteristic of the ancestral echinoderms and would have played a role in the early radiation and large disparity of the modern echinoderms. For the second study, as patterns of morphology of crinoids and of other echinoderms are numerous and are regulated by specific proteins, we verified the presence of four families of spicule matrix associated proteins (SMAPs) known among sea urchins in transcriptomes of the other echinoderms and deuterostomes. The family of spicule matrix (SMs) proteins and the carbonic anhydrase CARA7LA were absent in any other organism aside from sea urchins, mesenchyme specific proteins (MSP130s) were present in varying numbers in all ambulacrarians suggesting multiple duplications and losses and matrix metalloproteases were numerous in every organisms. The development of ossicles in echinoderms is a topic that has gained popularity in the last decades, especially in sea urchins, and including crinoids in this type of study will inform us about the origin and evolution of the modern echinoderms.

La pomme est un des fruits les plus consommés au monde.Le développement d’une texture farineuse est un caractère rédhibitoire pour les consommateurs et pour la profession.La farinosité renvoie à une texture sèche et granuleuse en bouche qui se développe en cours de conservation. Malgré son importance, les connaissances sur les processusmoléculaires mis en jeu restent très parcellaires et son évaluation ne repose jusqu’à ce jour que sur des analyses sensorielles. Or, comprendre les mécanismes moléculairessous-jacents à la farinosité est nécessaire à l’amélioration de la qualité du fruit. Cette étude constitue la première étude transcriptomique globale de la farinosité. Une première étude multi-échelle,intégrant des données transcriptomiques, biochimiques et phénotypiques a été réalisée sur six hybrides issus d’un même croisement et présentant des textures contrastées pour lafarinosité.Cette étude a permis d’identifi er un gène marqueur précoce de la farinosité, MdPME2, codant pour une pectine méthylestérase. Par la suite, une analyse transcriptomiqueélargie à 34 variétés a permis de mettre en évidence un rôle clé de la voie du jasmonate dans la régulation de la maturation. Les jasmonates semblent orchestrer la voie de biosynthèse de l’éthylène et le stress oxydatif, contribuant ainsi à retarder la mise en place de la farinosité. Par ailleurs, afin de quantifier la farinosité autrement que via des analyses sensorielles, un nouveau test a été développé et permettra la validation fonctionnelle de ces résultats. Finalement, ce travail de thèse permet de proposer un / Apple fruit is one of the most consumed fruits in the world. Apple mealiness is an important textural deterioration which occurs during storage. This phenotype refers to a dry andgrainy sensory perception during mastication. Despite its significance, this phenotype is still rather poorly characterized, the few available results mostly depending on sensory analyses. Understanding the molecular mechanisms involved in the development of this unwanted character is essential for the improvement of fruit quality and fruit production.The work presented here is focused on the identification of key genes associated with apple mealiness through global transcriptome analyses. A first multiscale analysis combining transcriptomic, biochemical and phenotypic analyses was performed on pairs of individuals displayingcontrasted phenotypes for mealiness.This analysis led us to the identifi cation of one pectin methylesterase gene, MdPME2, which appears as an early molecular marker of mealiness in this genetic background. Next, a transcriptome analysis enlarged to 34 cultivars allowed the identification of the jasmonate hormonal pathway as a key driver of apple fruits ripening. By regulating ethylene and oxidative stress pathways, jasmonates appear as a fi ne-tuning regulator onthe postponement of apple mealiness. In addition, a new quantitative test of mealiness has also been developed to allow the validation of this model by means of pharmacological approaches. The main outcome of this work is to propose a new molecular model to explain apple mealiness development. This work shed

Les métaux sont indispensables à la vie cellulaire car ils sont constitutifs des protéines. Les ions Ni, font partie intégrante des hydrogénases, enzymes primordiales pour le métabolisme énergétique. Paradoxalement, en excès, les métaux deviennent toxiques pour la cellule. Les bactéries luttent contre cette toxicité en produisant des systèmes de résistance ou d’adaptation. Les cellules procaryotes peuvent équilibrer les teneurs en métaux en contrôlant leur entrée ou leur efflux grâce à la biogenèse de transporteurs spécifiques. L’objectif de ces travaux de thèse a consisté à comprendre les mécanismes principaux permettant à la bactérie modèle Escherichia coli de s’adapter à de fortes variations en ions métalliques, en prenant comme modèle un stress provoqué par un excès d’ions Ni. Afin d’appréhender l’ensemble de la réponse cellulaire, l’effet de ce stress a été évalué sur l’expression de l’ensemble des gènes d’E. coli par des approches de transcriptomique couplées à une validation fonctionnelle. L’excès d’ions Ni induit le système d’efflux RcnRAB. En plus de la pompe d’efflux RcnA, ce système comporte une protéine périplasmique, RcnB, qui module le trafic des ions Ni ou Co via RcnA. Ces travaux ont montré que RcnB n’interagit pas avec les ions Ni ou Co mais de façon inattendue avec les ions Cu, définissant une nouvelle classe de cupro-protéines. Nous montrons que si RcnB n’intervient pas dans le contrôle de l’homéostasie du Cu, l’interaction avec ces ions est essentielle à sa fonction dans la modulation de l’efflux des ions Ni et Co. Ces résultats suggèrent des connexions entre les différents systèmes de maintien des homéostasies métalliques. Les résultats d’analyse transcriptomique montrent une forte modulation de l’expression des gènes impliqués dans les homéostasies du Cu et du Fe en présence d’un excès d’ions Ni, corrélée à une augmentation cellulaire de leur teneur mesurée par spectrométrie plasma. Ces métaux sont responsables de la production d’espèces réactives oxygénées entraînant de sérieux dégâts cellulaires, une des cibles privilégiée étant l’ADN. Nous montrons que les ions Ni ne provoquent pas de cassures de l’ADN et n’ont pas d’effet mutagène, par contre ils provoquent une modification importante de l’état de repliement de l’ADN. Nous proposons que ce relâchement de l’ADN soit dû à l’induction indirecte d’un stress oxydant. Ces travaux ont aboutis à l’identification du premier système de transport spécifique des ions Ni à travers la membrane externe chez E. coli. En résumé, un excès d’ions Ni affecte les systèmes spécifiques d’entrée et d’efflux des ions métalliques troublant les teneurs intracellulaires des autres métaux comme le Cu et le Fe. Ces métaux sont en partie responsables de la production de ROS létaux pour les cellules bactériennes. L’excès de Ni va induire une profonde reprogrammation génétique entraînant des changements physiologiques multifactoriels importants pour la survie bactérienne dans ces conditions de stress. / Metals are necessary components of all living cells because they are constitutive of many essential proteins. Nickel, for example, is required for hydrogenase activity, which is essential for the energetic metabolism. However, metals become toxic when present in excess. Prokaryotes can overcome this toxicity by using several systems of resistance or adaptation. Import systems must be repressed whereas export pathways activated. This work consists in bringing out the principal strategies established by Escherichia coli for accommodating a stress caused by an excess of Ni ions. In order to understand the cellular response, the effect of nickel stress has been evaluated in E. coli by a transcriptomic approach coupled to functional validation. Excess Ni induces the biosynthesis of the efflux system RcnRAB. In addition to the RcnA efflux pump, this system contains a periplasmic protein called RcnB. This protein modulates Ni and Co traffic. RcnB displayed no Ni or Co binding capacity but was shown to bing Cu ions. RcnB was characterized as a new family of cupro-protein. We showed that RcnB is not involved in the control of Cu homeostasis but that Cu binding is essential for its Ni and Co efflux function. Our results suggest connections between different systems of metals homeostasis. Indeed, RNA-Seq data analysis revealed that exposure to Ni induces strong variations of the expression of genes involved in Cu and Fe homeostasis. Our results correlated with an increase of intracellular Cu and Fe pools as assayed by plasma spectrometry. Both metals are involved in reactive oxygen species (ROS) production and generate serious cell damages, targeting DNA for example. We showed that Ni ions do not trigger DNA breakage and are not mutagenic. On the other hand, Ni stress has a strong effect on DNA folding. We propose that excess Ni causes DNA relaxation by the indirect induction of oxidative stress. Furthermore, we identified the first transport system specific for Ni ions localized in the outer membrane. This system, composed of YddA and YddB, allows the transfer of Ni ions accross the two membranes. The genes encoding these proteins are expressed in conditions evocative of a biofilm lifestyle. Moreover, this work showed that Ni stress promotes biofilm growth instead of a planktonic one. Indeed, in the presence of an excess of Ni ions, genes encoding flagella are down regulated whereas genes encoding adherence structures are up regulated. To conclude, an excess of Ni ions affects specific metals import and efflux systems unbalancing intracellular Fe and Cu contents. These metals in turn generate ROS that are toxic for the bacterial cells. Ni stress induces large transcriptomic modifications causing major physiological changes important for the survival of the bacteria.

L'ovocyte se développe au sein d'un follicule, en contact étroit avec des cellules d'origine somatique, les cellules de cumulus (CC). Ces deux types cellulaires communiquent entre eux via des jonctions intercellulaires, permettant ainsi la régulation et la coordination du métabolisme pendant le développement et la maturation de l'ovocyte. Notre hypothèse est que l'expression et la régulation des gènes dans les CC joue un rôle crucial dans des fonctions essentielles pour la croissance de l'ovocyte et l'acquisition de sa compétence. Mes travaux de thèse comportent deux parties. Dans la première partie nous avons utilisé le séquençage haut débit pour examiner le répertoire des microARN (communément appelés miRNA) dans les cellules de cumulus et dans l'ovocyte. Les miRNA, séquences d'ARN non codantes dont la longueur varie entre 19 et 25 nucléotides, ont émergé récemment comme régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont le vieillissement. Nous avons identifié 32 miRNA spécifiquement dans les cellules de cumulus humains et seulement 3 dans l'ovocyte MII. Dans la seconde partie de nos travaux, nous avons analysé l'impact de l'âge maternel sur l'expression des gènes dans les cellules de cumulus. Alors qu'une baisse de la compétence de l'ovocyte avec l'avancement de l'âge maternel est bien établie, les bases moléculaires de ce phénomène demeurent peu connues. Dans une première étape pour aborder cette question, nous avons utilisé des puces à ADN pour analyser les profils d'expression des gènes des CC en fonction de l'âge maternel. De façon remarquable l'âge maternel impacte significativement l'expression de gènes qui sont critiques pour la maturation de l'ovocyte tels que les gènes impliqués dans l'angiogenèse, les voies de signalisation de TGF-ß et de l'insuline. Par l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons aussi identifié des miRNA potentiels régulateurs de gènes impliqués dans des processus ou des voies impactés par l'âge ; ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs pour prédire un vieillissement ovarien prématuré ainsi que la qualité et la compétence de l'ovocyte. / The oocyte develops into a follicle where it is in close contact with cumulus cells (CCs), of somatic origin. The two cell types undergo a bidirectional communication via gap junctions, which results in the regulation and coordination of the metabolism during oocyte development and maturation. We assume that gene expression and regulation in the CCs play a crucial role in functions that are essential for oocyte growth and competence acquisition. The present study may be subdivided in two parts. In the first part we used deep sequencing to investigate the repertoire of miRNAs in the cumulus cells and the oocyte. MicroRNAs that are noncoding RNA sequences whose length is approximately 19-25 nucleotides have emerged as important regulators in many biological processes including aging. Our data showed that 32 miRNAs were specifically expressed in human cumulus cells while only 3 miRNAs were identified in MII human oocyte. The impact of maternal age on gene expression in cumulus cells was addressed in a second part of my thesis work. While the correlation of oocyte competence decline with advancing maternal age is well established, little is known on its molecular basis. In a first attempt to address this issue, we used microarrays to study gene expression profiles of human cumulus cells according to maternal age. Remarkably, maternal age greatly impacted expression of genes that are critical for oocyte maturation such as genes involved in angiogenesis, TGF-β signaling, and insulin signaling pathways. Also, using bioinformatic tools, we identified miRNAs that potentially target some of the genes involved in the aging-impacted processes and pathways; this could candidate them as new biomarkers to predict premature ovarian aging and oocyte quality and competence.