En France, le tritium est principalement rejeté sous forme d’eau tritiée (HTO) par les centres de production d’électricité et les centres de traitement des combustibles en fonctionnement normal. Les effets développementaux et reprotoxiques du tritium ont été étudiés. Cependant, peu d’études portent sur les effets moléculaires. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est d’évaluer les effets de l’HTO sur les stades embryo-larvaire du poisson zèbre (Danio rerio). Deux débits de dose, 0,4 et 4 mGy/h, ont été testés. Un protocole pour la mesure de l’activité dans les organismes a été mis au point. Il a permis (i) de confirmer que l’internalisation de l’HTO est rapide, (ii) la discrimination des formes de tritium libre dans les tissues et lié à la matière organique, et (iii) le calcul de la dose permettant de relier les effets observés à une dose reçue. Les effets de l’HTO ont été évalués à différents niveaux d’organisation biologique. A l’échelle moléculaire, une analyse transcriptomique (mRNAseq) a montré la modulation de gènes impliqués dans la contraction musculaire et le développement de l’œil à 24hpf ainsi que dans le cycle circadien et la réponse au stress oxydant à 96hpf. Une modulation de gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN a été montrée. A des niveaux d’organisation supérieurs, quelques altérations des fibres musculaires ont été observées pour les deux débits de dose. Une diminution de la vitesse de nage a été montrée à 96 hpf après exposition à 0,4 mGy/h. Ces travaux ont permis de mieux appréhender l’internalisation du tritium, de caractériser la dose absorbée dans les organismes et de mieux comprendre les effets du tritium / In France, tritium is mainly released as tritiated water (HTO) by nuclear power plants and nuclear reprocessing plants. The developmental and reprotoxic effects of tritium have already been studied. However, few studies focus on molecular effects. In this context, the aim of this thesis is to evaluate the effects of HTO on the embryo-larvae stages of the zebrafish (Danio rerio). Two dose rates, 0.4 and 4 mGy/h, were tested. A protocol for the measurement of activity in organisms was developed. It has (i) confirmed that the internalization of HTO is rapid, (ii) allowed the discrimination of the tissue-free-water-tritum and organically bound tritium forms, and (iii) allowed the calculation of the dose permitting to link the observed effects to a received dose. The effects of HTO were evaluated at different biological levels. At the molecular level, a transcriptomic analysis (mRNAseq) showed the modulation of genes involved in muscle contraction and eye development at 24hpf, as well as in the circadian rythm and the response to oxidative stress at 96hpf. Modulation of genes involved in the DNA damage repair was shown. At higher levels of organization, some alterations of muscle fibers were observed for both dose rates. A decrease in swimming velocity was shown at 96 hpf after exposure to 0.4 mGy/h. This work allowed a better understanding of the tritium internalization, to characterize the absorbed dose in organisms and to better understand the effects of tritium

Soutenue par le renouveau de la phagothérapie, la découverte de nouveaux bactériophages (phages) nous a permis de définir deux nouveaux genres de virus dénommés Kpp10virus et Pakpunavirus dont les mécanismes infectieux sont inconnus. Il est admis que le succès d’un cycle infectieux est notamment assuré par une réappropriation efficace des ressources de la cellule hôte, conduisant à sa transformation en « virocellule », c’est-à-dire, un organisme cellulaire exclusivement dédié à la production de particules virales. Ce travail de thèse a pour objectif d’apporter une vision globale des stratégies moléculaires utilisées par les virus appartenant aux genres Kpp10virus et Pakpunavirus (respectivement représentés par les phages PAK_P3 et PAK_P4) pour infecter le pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa. Dans un premier temps, nous avons évalué leurs propriétés intrinsèques en analysant le contenu de leurs génomes, leurs spectres d’hôtes, leurs paramètres de croissance ainsi qu’en identifiant leur récepteur bactérien. Dans un second temps, une combinaison d’approches transcriptomiques et métabolomiques a permis de montrer que ces deux virus ont des programmes transcriptionnels similaires, incluant notamment une régulation temporelle de leur expression génétique et la production de transcrits antisens. De plus, ils provoquent tous deux la dégradation rapide de 90% des ARNm de l’hôte, qui sont alors remplacés par des ARNm viraux. Malgré cette dégradation, nous avons constaté que ces deux phages redirigent les voies de biosynthèse bactériennes plutôt que de provoquer une extinction totale du métabolisme cellulaire, en utilisant cependant des mécanismes différents. De plus, nous avons détecté l’activation, par l’hôte, d’une réponse commune en réponse à une infection par PAK_P3 ou PAK_P4 et avons émis l’hypothèse qu’il s’agit d’une tentative de réparation des importants dommages ARN induits par l’infection virale. Enfin, nous avons étudié les fonctions d’une protéine virale (Gp92), largement conservée chez les virus appartenant à ces deux genres et qui est produite au stade précoce du cycle infectieux. Lorsqu’elle est produite seule chez l’hôte, cette protéine altère la morphologie cellulaire et interagit avec un complexe de régulation bactérien de type sigma/anti-sigma impliqué dans la réponse au stress (appelé AlgU-MucA). Notre étude suggère un rôle potentiel de Gp92 dans l’atténuation du stress provoqué par l’infection virale. Ce manuscrit fournit un modèle de transformation d’une cellule de P. aeruginosa en « virocellule » au cours de l’infection par PAK_P3 ou PAK_P4. De plus, la comparaison des stratégies de ces deux virus, vraisemblablement issus d’un ancêtre commun, nous a permis de discuter l’évolution des mécanismes infectieux chez les phages virulents / Previous investigations in the field of phage therapy led to the discovery of two new genera of bacteriophages (phages), namely Kpp10virus and Pakpunavirus whose infection mechanisms are unknown. It is acknowledged that a successful infection is notably ensured by an effective takeover of host cell resources, leading to its transformation into a virocell, a cellular organism exclusively dedicated to the production of progeny phages.This PhD work aims to provide a comprehensive view of molecular strategies set up by Kpp10virus and Pakpunavirus (represented by phages PAK_P3 and PAK_P4, respectively) to infect the opportunist pathogen Pseudomonas aeruginosa.First, we assessed phage intrinsic properties by analyzing their genomic content, evaluating their host range and growth parameters and identifying their bacterial receptor.Then, by coupling transcriptomics and metabolomics approaches, we found that both viruses have similar transcriptional programs, with a temporal regulation of their gene expression and production of antisense transcripts. They both strikingly prompt a rapid degradation of 90% of host mRNAs, which are eventually replaced by viral RNAs. Despite this extensive degradation, we found that both phages do not shutoff host metabolism but redirect biosynthesis pathways, however through different mechanisms. In addition, we found that a common host response is elicited upon both PAK_P3 and PAK_P4 infections and hypothesized it represents an attempt of the host to repair extensive RNA damage.Finally, we investigated the functions of an early produced phage protein (Gp92), broadly conserved in both phage genera, in order to identify particular mechanisms of host subversion used by these phages. When expressed alone in the host, Gp92 alters cell morphology and interacts with the bacterial regulatory complex sigma/anti-sigma involved in stress response (namely AlgU- MucA). Our study suggests a potential role of Gp92 in alleviating the stress caused by phage infection.This manuscript provides a model of virocell transformation upon infection of P. aeruginosa by PAK_P3 or PAK_P4. In addition, by comparing their reproductive strategies, it addresses the evolution of infection mechanisms in virulent phages deriving from a common ancestor

AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES / Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied.

RESUME : Le Quorum Sensing est un système de communication bactérien permettant à une population de coordonner l’expression de gènes cibles en fonction de sa densité ou des propriétés du milieu (diffusion, flux....). Chez les bactéries à Gram négatif, le Quorum Sensing est basé sur la synthèse et la détection de petites molécules signal appelées N-acyl-homosérine lactones (AHLs). Les régulateurs transcriptionnels de type LuxR sont les médiateurs de ce système de régulation. Lorsque la concentration en AHLs augmente, ces molécules se fixent au domaine N-terminal d’un régulateur LuxR et provoquent des changement conformationnels entraînant une modification de l’activité du régulateur. Un tel système de régulation a été mis en évidence chez la bactérie Gram négative Brucella melitensis. Cette bactérie pathogène intracellulaire synthétise une dodécanoyl-homosérine lactone (C12-HSL) et possède deux régulateurs de type LuxR : VjbR et BabR. VjbR est impliqué dans la virulence de B. melitensis et est indispensable à l’expression de deux facteurs de virulence: le système flagellaire et le système de sécrétion de type IV VirB. Les C12-HSL ont quant à elles un effet répresseur sur ces deux structures membranaires. Durant ce travail, la mutation du domaine Nterminal du régulateur VjbR a permis de démontrer la capacité de VjbR à médier l’effet des C12-HSL sur l’opéron virB. Les souches mutées dans le gène vjbR forment des agrégats en cultures liquides. Nous avons montré que ce phénotype est lié à la production d’un exopolysaccharide, suggérant pour la première fois que Brucella pourrait former des structures de type biofilm. Cette étude a également permis de mettre en évidence un rôle majeur de VjbR dans la régulation de structures de surface puisque ce régulateur est impliqué dans le contrôle de l’expression de nombreuses protéines de membrane externe (Omp). L’utilisation de la technique d’immunoprécipitation chromatinienne (ChIP) a permis de montrer que VjbR régule directement deux de ces Omps ainsi que l’opéron virB. La virulence de Brucella est en partie basée sur sa capacité à dévier le trafic intracellulaire de ses cellules hôtes (phagocytes professionnels et nonprofessionnels) et à s’y multiplier. Lors de son cycle infectieux, Brucella est confrontée à de nombreux stress et environnements différents, suggérant la nécessité d’une régulation génétique fine en réponse à des stimuli environnementaux. Le Quorum Sensing, de par son implication dans la virulence de ce pathogène pourrait être impliqué dans de telles régulations. Afin d’aborder de façon globale le rôle de VjbR et de BabR chez B. melitensis, des études transcriptomique et protéomique des mutants ΔvjbR et ΔbabR ont été réalisées. Ces études ont permis de mettre en évidence que le Quorum Sensing chez B. melitensis est un système de régulation global, puisqu’il permet de réguler 10% du génome dans les conditions testées (dont 9% sous le contrôle de VjbR). De nombreuses cibles de ces régulateurs sont impliquées dans la virulence et l’adaptation aux conditions de stress (oxydatif, métabolique...), suggérant un rôle important du Quorum Sensing dans l’accomplissement du cycle infectieux de B. melitensis. SUMMARY : Quorum Sensing is a bacterial communication system wich allows the coordinated gene expression within a population regarding its density and environmental properties (diffusion, flow...). In Gram negative bacteria, Quorum Sensing is based on the synthesis and the detection of small diffusible molecules called N-acyl-homoserine lactones (AHLs). LuxR transcriptional regulators are the mediators of these regulation systems. When AHL concentration increases, these molecules bind to the N-terminal domain of a LuxR-type regulator and leads to conformational changes driving the modification of the regulator activity. A similar regulation system has been discovered in the Gram negative bacteria Brucella melitensis. This intracellular pathogen synthesizes a dodecanoylhomoserine lactone (C12-HSL) and possesses two LuxR-type regulators: VjbR and BabR. VjbR is involved in the virulence of this pathogen and is crucial for the expression of two virulence factors : the flagellar system and the type four secretion system VirB. C12-HSL have a repressor effect on these two membrane structures. During this work, mutation of the N-terminal domain of VjbR allowed us to demonstrate the ability of VjbR to mediate C12-HSL effect on the virB operon. vjbR mutated strains aggregate in liquid cultures. We have demonstrated that this phenotype is linked to the production of an exopolysaccharide, suggesting for the first time that Brucella could form biofilm-type structures. This study also demonstrates that VjbR has a major role in the regulation of surface structures because this regulator controls the expression of many outer membrane proteins (Omp). Using the chromatin immunoprecipitation technique (ChIP), we have shown that two of these Omps, as well as the virB operon, are directly regulated by VjbR. The virulence of Brucella is partly based on its ability to deviate the intracellular traffic of its host cells (professional and nonprofessional phagocytes) and to proliferate within these cells. During its infectious cycle, Brucella faces numerous stresses and environments, suggesting the necessity of a finely tuned genetic regulation depending on environmental stimuli. Quorum Sensing, through its involvement in the virulence of this intracellular pathogen, could be involved in such regulations. In order to investigate the role of VjbR and BabR in B. melitensis, global transcriptomic and proteomic studies of ΔvjbR and ΔbabR mutants were performed. These studies demonstrate that Quorum Sensing is a global regulation system in B. melitensis because it controls the expression of 10% of the genome in the condition tested (9% through VjbR). Numerous targets of these two regulators are involved in virulence and adaptation to environmental stresses (oxydative, metabolic...), suggesting an important role of Quorum sensing in the achievement of the infectious cycle of B. melitensis.

Refrigeration has been found to cause cell elongation in mesophilic enteric organisms like commensal Escherichia coli and E. coli O157:H7. As elongated cells may divide into multiple daughter cells, they may result in underestimation of pathogen numbers in foods when plate counts are used. When E. coli cultures were incubated at 6°C for ≤10 days, cells grew by elongation, did not divide, and lost viability (LIVE/DEAD vitality stain) at similar rates. Substantial fractions of cells in cultures elongating at 6°C were inactivated by an abrupt shift to 37°C. Direct microscopic observation of cells transferred to 37ºC after 5 days at 6°C showed that few or no cells of normal size (≤4µm) divided, while elongated cells (>4 µm) formed multiple daughter cells. Thus the threat from mesophilic pathogens with a low infective dose may be underestimated in refrigerated foods. It was also found that E. coli O157:H7 cultures containing elongated cells prepared at 6 or 15 °C have greater potential to attach to food contact surfaces than those grown at higher temperatures. Interestingly, at 6°C cell elongation was inhibited by ≥ 100 mg/l cinnamaldehyde and ≥ 200 mg/l cinnamaldehyde was lethal. In contrast, at 37°C 200 mg/l cinnamaldehyde initially delayed multiplication of E. coli cells by causing cell elongation, but from 2 to 4 h, growth resumed and cells reverted to normal length. To understand this transient behaviour, genome-wide transcriptional analysis of E. coli O157:H7 was performed at 2 and 4 h exposure to cinnamaldehyde in conjunction with reverse phase-high performance liquid chromatography analysis for cinnamaldehyde and other cinnamic compounds. At 2 h exposure, cinnamaldehyde induced expression of many oxidative stress-related genes, reduced expression of genes involved in DNA replication, synthesis of protein, O-antigen and fimbriae. At 4 h many repressive effects of cinnamaldehyde on E. coli O157:H7 gene expression were reversed. Data indicated that by 4 h, E. coli O157:H7 was able to convert cinnamaldehyde into the less toxic cinnamic alcohol using alcohol dehydrogenase or aldehyde reductase enzymes (YqhD and DkgA). The results also showed that the antimicrobial activity of cinnamaldehyde was likely attributable to its carbonyl aldehyde group.

In situ protein detection in human tissues using antibodies reveals the cellular protein localization, and affinity-based proteomic studies can help to discover proteins involved in the development of diseases. However, antibodies often suffer from cross-reactivity, and the lack of positive and negative tissue controls for uncharacterized proteins complicates the mapping of the proteome. The aim of this thesis is thus to improve the methodology for validating antibodies used for immunostaining on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Two of the papers include comparisons between mRNA-expression and immunostaining of corresponding protein. In paper I, ISH and IHC staining patterns were compared on consecutive TMA-slides. The study of well-characterized genes showed that ISH could be used for validation of antibodies. ISH was further used for antibody evaluation, and could validate four out of nine antibodies showing potentially interesting staining patterns. In paper III, transcriptomic data generated by RNA-sequencing were used to identify tissue specific expression in lymphohematopoietic tissues. An increased expression in one or more of these tissues compared to other tissue types was seen for 693 genes, and these were further compared to the staining patterns of corresponding proteins in tissues. Antibody labeling is necessary for many immunoassays. In paper II, two techniques for antibody-biotinylation were compared, aiming to find a stringent labeling method for antibodies used for immunostaining on TMAs. The ZBPA-method, binding specifically to Fc-part of antibodies, was found to be superior to the Lightning Link-biotinylation kit targeting amine groups, since labeling of amine groups on stabilizing proteins in the antibody buffer causes unspecific staining. The localization of the estrogen receptor beta (ERβ) in human normal and cancer tissues was studied in paper IV. Thorough evaluation of 13 antibodies using positive and negative control cell lines showed that only one antibody, PPZ0506, is specific for ERβ in all three immunoassays used. Contradictory to previously published data, tissue profiling using PPZ0506 showed that ERβ is expressed in a limited number of normal and cancer tissues. In conclusion, the present investigations present tools for validation of antibodies used for large-scale studies of protein expression in tissues.

Refrigeration has been found to cause cell elongation in mesophilic enteric organisms like commensal Escherichia coli and E. coli O157:H7. As elongated cells may divide into multiple daughter cells, they may result in underestimation of pathogen numbers in foods when plate counts are used. When E. coli cultures were incubated at 6°C for ≤10 days, cells grew by elongation, did not divide, and lost viability (LIVE/DEAD vitality stain) at similar rates. Substantial fractions of cells in cultures elongating at 6°C were inactivated by an abrupt shift to 37°C. Direct microscopic observation of cells transferred to 37ºC after 5 days at 6°C showed that few or no cells of normal size (≤4µm) divided, while elongated cells (>4 µm) formed multiple daughter cells. Thus the threat from mesophilic pathogens with a low infective dose may be underestimated in refrigerated foods. It was also found that E. coli O157:H7 cultures containing elongated cells prepared at 6 or 15 °C have greater potential to attach to food contact surfaces than those grown at higher temperatures. Interestingly, at 6°C cell elongation was inhibited by ≥ 100 mg/l cinnamaldehyde and ≥ 200 mg/l cinnamaldehyde was lethal. In contrast, at 37°C 200 mg/l cinnamaldehyde initially delayed multiplication of E. coli cells by causing cell elongation, but from 2 to 4 h, growth resumed and cells reverted to normal length. To understand this transient behaviour, genome-wide transcriptional analysis of E. coli O157:H7 was performed at 2 and 4 h exposure to cinnamaldehyde in conjunction with reverse phase-high performance liquid chromatography analysis for cinnamaldehyde and other cinnamic compounds. At 2 h exposure, cinnamaldehyde induced expression of many oxidative stress-related genes, reduced expression of genes involved in DNA replication, synthesis of protein, O-antigen and fimbriae. At 4 h many repressive effects of cinnamaldehyde on E. coli O157:H7 gene expression were reversed. Data indicated that by 4 h, E. coli O157:H7 was able to convert cinnamaldehyde into the less toxic cinnamic alcohol using alcohol dehydrogenase or aldehyde reductase enzymes (YqhD and DkgA). The results also showed that the antimicrobial activity of cinnamaldehyde was likely attributable to its carbonyl aldehyde group.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: This thesis involved the development and application of network approaches for the construction, analysis and visualization of phylogenomic and transcriptomic networks. A co-evolutionary network model of grapevine genes was constructed based on three mechanisms of evolution. The investigation of local neighbourhoods of this network revealed groups of functionally related genes, illustrating that the multi-mechanism evolutionary model was identifying groups of potentially co-evolving genes. An extended network definition, namely 3-way networks, was investigated, in which edges model relationships between triplets of objects. Strategies for weighting and pruning these 3-way networks were developed and applied to a phylogenomic dataset of 211 bacterial genomes. These 3-way bacterial networks were compared to standard 2-way network models constructed from the same dataset. The 3-way networks modelled more complex relationships and revealed relationships which were missed by the two-way network models. Network meta-modelling was explored in which global network and node-bynode network comparison techniques were applied in order to investigate the effect of the similarity metric chosen on the topology of multiple types of networks, including transcriptomic and phylogenomic networks. Two new network comparison techniques were developed, namely PCA of Topology Profiles and Cross-Network Topological Overlap. PCA of Topology Profiles compares networks based on a selection of network topology indices, whereas Cross- Network Topological Overlap compares two networks on a node-by-node level, identifying nodes in two networks with similar neighbourhood topology and thus highlighting areas of the networks with conflicting topologies. These network comparison methods clearly indicated how the similarity metric chosen to weight the edges of the network influences the resulting network topology, consequently influencing the biological interpretation of the networks. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hierdie tesis hou verband met die ontwikkeling en toepassing van netwerk benaderings vir die konstruksie, analise en visualisering van filogenomiese en transkriptomiese netwerke. 'n Mede-evolusionêre netwerk model van wingerdstok gene is gebou, gebaseerd op drie meganismes van evolusie. Die ondersoek van plaaslike omgewings van die netwerk het groepe funksioneel verwante gene aan die lig gebring, wat daarop dui dat die multi-meganisme evolusionêre model groepe van potensieele mede-evolusieerende gene identifiseer. 'n Uitgebreide netwerk definisie, naamliks 3-gang netwerke, is ondersoek, waarin lyne die verhoudings tussen drieling voorwerpe voorstel. Strategieë vir weeg en snoei van hierdie 3-gang netwerke was ontwikkel en op 'n filogenomiese datastel van 211 bakteriële genome toegepas. Hierdie 3-gang bakteriële netwerke is met die standaard 2-gang netwerk modelle wat saamgestel is uit dieselfde datastel vergelyk. Die 3-gang netwerke het meer komplekse verhoudings gemodelleer en het verhoudings openbaar wat deur die tweerigting-netwerk modelle gemis is. Verder is netwerk meta-modellering ondersoek waarby globalle netwerk en punt-vir-punt netwerk vergelykings tegnieke toegepas is, met die doel om die effek van die ooreenkoms-maatstaf wat gekies is op die topologie van verskeie tipes netwerke, insluitend transcriptomic en filogenomiese netwerke, te bepaal. Twee nuwe netwerk-vergelyking tegnieke is ontwikkel, naamlik "PCA of Topology Profiles" en"Cross-Network Topological Overlap". PCA van Topologie Profiele vergelyk netwerke gebaseer op 'n seleksie van netwerk topologie indekse, terwyl Cross-netwerk Topologiese Oorvleuel vergelyk twee netwerke op 'n punt-vir-punt vlak, en identifiseer punte in twee netwerke met soortgelyke lokale topologie en dus lê klem op gebiede van die netwerke met botsende topologieë. Hierdie netwerk-vergelyking metodes dui duidelik aan hoe die ooreenkoms maatstaf wat gekies is om die lyne van die netwerk gewig te gee, die gevolglike netwerk topologie beïnvloed, wat weer die biologiese interpretasie van die netwerke kan beïnvloed.

L'inférence des réseaux de régulation de gènes (RRG) à partir de données d'expression est un défi majeur en biologie. L’arrivée des technologies de mesure de transcriptomique à l’échelle de la cellule a suscité de nombreux espoirs, mais paradoxalement elles montrent une nouvelle complexité du problème d’inférence des RRG qui limite encore les approches existantes. Nous avons commencé par montrer, à partir de données d'expression en cellules uniques acquises sur un modèle aviaire de différenciation érythrocytaire, que les RRG sont des systèmes stochastiques à l'échelle de la cellule et qu'il y a une évolution dynamique de cette stochasticité au cours du processus de différenciation (Richard et al, PLOS Comp.Biol., 2016). C'est pourquoi nous avons développé par la suite un modèle de RRG mécaniste qui inclus cette stochasticité afin d'exploiter au maximum l'information des données expérimentales à l'échelle de la cellule (Herbach et al, BMC Sys.Biol., 2017). Ce modèle décrit les interactions entre gènes comme un couplage de processus de Markov déterministes par morceaux. En régime stationnaire une formule explicite de la distribution jointe est dérivée du modèle et peut servir à inférer des réseaux simples. Afin d'exploiter l'information dynamique et d'intégrer d'autres données expérimentales (protéomique, demi-vie des ARN), j’ai développé à partir du modèle précédent une approche itérative, intégrative et parallèle, baptisée WASABI qui est basé sur le concept de vague d'expression (Bonnaffoux et al, en révision, 2018). Cette approche originale a été validée sur des modèles in-silico de RRG, puis sur nos données in-vitro. Les RRG inférés affichent une structure de réseau originale au regard de la littérature, avec un rôle central du stimulus et une topologie très distribuée et limitée. Les résultats montrent que WASABI surmonte certaines limitations des approches existantes et sera certainement utile pour aider les biologistes dans l’analyse et l’intégration de leurs données. / Inference of gene regulatory networks from gene expression data has been a long-standing and notoriously difficult task in systems biology. Recently, single-cell transcriptomic data have been massively used for gene regulatory network inference, with both successes and limitations.In the present work we propose an iterative algorithm called WASABI, dedicated to inferring a causal dynamical network from timestamped single-cell data, which tackles some of the limitations associated with current approaches. We first introduce the concept of waves, which posits that the information provided by an external stimulus will affect genes one-byone through a cascade, like waves spreading through a network. This concept allows us to infer the network one gene at a time, after genes have been ordered regarding their time of regulation. We then demonstrate the ability of WASABI to correctly infer small networks, which have been simulated in-silico using a mechanistic model consisting of coupled piecewise-deterministic Markov processes for the proper description of gene expression at the single-cell level. We finally apply WASABI on in-vitro generated data on an avian model of erythroid differentiation. The structure of the resulting gene regulatory network sheds a fascinating new light on the molecular mechanisms controlling this process. In particular, we find no evidence for hub genes and a much more distributed network structure than expected. Interestingly, we find that a majority of genes are under the direct control of the differentiation-inducing stimulus. Together, these results demonstrate WASABI versatility and ability to tackle some general gene regulatory networks inference issues. It is our hope that WASABI will prove useful in helping biologists to fully exploit the power of time-stamped single-cell data.

Les tumeurs gliales du cerveau et en particulier les glioblastomes sont des tumeurs de très mauvais pronostic. Les paramètres qui contrôlent des phénotypes comme l'agressivité, la migration, ou la chimio-résistance de ces tumeurs sont mal connus. Dans ce contexte tumoral, il est envisagé que les microARN (ARN non-codants d'une vingtaine de bases) soient des acteurs essentiels des phénomènes de modification phénotypique parce qu'ils sont capables d'orchestrer l'expression de nombreux gènes. Nous avons montré que les microARN sont des marqueurs tissulaires précieux pour le diagnostic permettant de différencier les deux types principaux de gliomes à partir de prélèvements tumoraux. Nous avons aussi observé que plusieurs microARN sont, en outre, sécrétés par les cellules gliales saines ou cancéreuses au sein de microvésicules appelées exosomes. Le contenu en ARN de ces exosomes a été caractérisé par analyse moléculaire transcriptomique (ARN messagers et microARN) par techniques d'hybridation sur puces à ADN Affymetrix. Les profils ARN exosomaux sains et cancéreux sont distincts, mais ils ne reflètent pas intégralement le profil ARN des cellules dont ils sont issus. Des conditions de stress hypoxique ou l'utilisation de composés pharmacologiques (GW4869 et 5-aza-2'-désoxycitidine) n'affectent pas la quantité d'exosomes produite par la lignée de glioblastome (U87) en culture. Les profils ARN sont cependant modifiés, et le contenu des exosomes produits semble donc être un mécanisme actif et régulé. Enfin, des exosomes cancéreux incubés avec des cellules saines ont très peu d'effet sur le phénotype de celles-ci. Les microARN tissulaires et exosomaux seraient donc des acteurs importants de la physiopathologie du gliome et de sa progression, dont les rôles restent encore à préciser. / Brain glial tumors, and particularly glioblastomas, are tumors with a very bad prognosis. Nowadays, parameters that control aggressiveness, migration or chemo-resistance are poorly known. In this tumor context microRNAs (20 base-long non-coding RNAs) are thought to be essential actors of phenotypic-modification phenomenons as they are able to control the expression of numerous genes. We showed that microRNAs are precious diagnosis tissular markers helping in differentiating two principal tumor types from tissular samples. We also observed that several microRNAs are secreted by glial cells in microvesicles called exosomes. The exosomes RNA content was characterized by molecular transcriptomic analysis (messenger RNAs and microRNAs) using Affymetrix hybridization techniques. The healthy and cancerous exosomal RNA profiles are distinct but do not reflect the RNA profile of the cells they are derived from. Oxygen stress conditions, or use of chemical drugs (GW4869 or 5-Aza-2'-deoxycitidine), do not affect the quantity of exosomes produced by the culture cell line of glioblastoma U87. Nevertheless, the RNA profiles are modified and contents of exosomes produced seem to be controled by an active and regulated mechanism. Finally, cancerous exosomes incubated with healthy cells have a very restrain effect on their phenotypes. Thus tissular and exosomal microRNAs might be important actors of the glioma physiopathology and progression, which roles remain to be defined in detail.