La cellule utilise des nœuds d’interactions protéiques relativement stables, conservés et souvent constitués d’adaptateurs moléculaires pour gérer des signaux reçus (synthèse, sécrétion, traffic, métabolisme, division), des problèmes de sécurité et de niveaux d’énergie. Nos résultats montrent que la cellule utilise aussi des nœuds relativement petits et dynamiques où des informations propres concernant des voies métaboliques apparemment indépendantes sont évaluées. Ces informations y sont intégrées localement et une décision y est prise pour action immédiate. Cette idée est supportée par notre étude sur le récepteur de l’insuline (RI). Ce récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase reconnaît un signal externe (insuline circulante) et engage la signalisation de l’insuline, les réponses métaboliques et le contrôle du glucose circulant. Le RI est aussi impliqué dans l’internalisation de l’insuline et sa dégradation dans les endosomes (clairance). Il régule donc indirectement la sécrétion de l’insuline par les cellules du pancréas endocrine. La signification pathophysiologique de l’endocytose du RI ainsi que les bases moléculaires d’une telle coordination sont peu connues. Nous avons construit un réseau d’interactions du RI (IRGEN) à partir d’un protéome de fractions Golgi-endosomales (G/E) hépatiques. Nous démontrons une forte hétérogénéité fonctionnelle autour du RI avec la présence des protéines ATIC, PTPLAD1, AMPKα et ANXA2. ANXA2 est une protéine impliquée dans la biogénèse et le transport endosomal. Nos résultats identifient un site de SUMOylation régulé par l’insuline dans sa région N-terminale. ATIC est une enzyme de la voie de synthèse des purines de novo dont le substrat AICAR est un activateur de l’AMPKα. Des analyses biochimiques in vitro et in vivo nous montrent que ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI par opposition fonctionnelle à PTPLAD1. Une délétion partielle d’ATIC stimule l’activation de l’AMPK dont la sous-unité AMPKα2 apparaît déterminante pour le trafic du RI. Nous démontrons que ATIC, PTPLAD1, AMPKα, AICAR et ANXA2 contrôlent l’endocytose du RI à travers le cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules. Nous ressortons un nœud de signalisation (ATIC, PTPLAD1, AMPKα) capable de détecter les niveaux d’activation du RI, d’énergie cellulaires (rapports AMP/ATP) et aussi d’agir sur la signalisation et l’endocytose du RI. Cette proximité moléculaire expliquerait le débat sur le mécanisme primaire du diabète de type 2 (DT2), notamment entre la sensibilité à l’insuline et sa clairance. Nous avons calculé un enrichissement de 61% de variants communs du DT2 parmi les protéines fonctionnellement proches du RI incluant RI, ATIC, AMPKα, KIF5A et GLUT2. Cet enrichissement suggère que l’hétérogénéité génétique révélée par les consortiums sur études génomiques (GWAS) converge vers des mécanismes peu étudiés de biologie cellulaire. / The normal cell deals efficiently with multiple signals, processes (synthesis, secretion, trafficking, metabolism, and division), and energy and security problems. To achieve these goals, the cell uses large and relatively stable proteins nodes (or hubs) often sustained by adapters. It appears that the cell also uses small, dynamics nodes where informations about apparently unconnected major pathways are evaluated. Not only these informations are locally integrated but also a decision is made for immediate action. This is exemplified here by the insulin receptor (IR). This receptor-tyrosine kinase recognizes signals from the outside (circulating insulin) and engages insulin signalling activity and the insulin response. Quite simultaneously, the insulin receptor is involved in insulin internalization and its subsequent degradation in endosomes (clearance of circulating insulin) and thus, it indirectly regulates insulin secretion by the -cells of the endocrine pancreas. The physiological significance of trafficking and the molecular bases of such coordination have received little attention. We constructed hepatic Golgi/endosomes (G/E) network of the internalized IR (IRGEN) and we found substantial heterogeneity within the close environment of IR, with the presence of ATIC, a metabolic enzyme of the de novo purine synthesis pathway, the putative tyrosine phosphatase PTPLAD1, the energy sensor AMPK and ANXA2, a protein involved in endosomes biogenesis and endosomal transport. Our results show that ANXA2 is SUMOylated on an insulin-dependent way at a non-concensus motif of its N-terminal domain. It appears that following insulin stimulation, the proteins ATIC, PTPLAD1, AMPKα associate within seconds with the activated IR and control its tyrosine kinase activity and traffic. We found that PTPLAD1 and AMPKα are rapidly compartmentalised within the plasma membrane (PM) and G/E fractions after insulin stimulation and that ATIC accumulates in the G/E fraction later. By using an in vitro reconstitution system and siRNA–mediated partial knockdown of ATIC and PTPLAD1 in HEK293 cells, we confirmed that ATIC, PTPLAD1 and AMPKα affect IR tyrosine phosphorylation and endocytosis and treatment with AICAR, increased IR endocytosis in cultured cells and in the liver. These results suggest the presence of a new signalling mechanism that senses in the same time adenylate synthesis, cell energy (ATP) and IR activation states and that acts consequently in regulating IR autophosphorylation and endocytosis. The IRGEN may explain the perceived promiscuity that exists between insulin resistance and clearance, as this new signalling node apparently controls both the IR activity and trafficking. The elevated number of common heritable variants associated with type 2 diabetes (T2D) in the actual IRGEN (more than 61 %) favours the idea that the confusing genetic heterogeneity converges however towards few biological mechanisms.

Ce projet de recherche porte sur la sous-unité gamma de la transducine (Gγt), participant à la phototransduction visuelle, plus précisément pour comprendre son mécanisme d'ancrage aux membranes par des interactions favorables de ses résidus et de son acylation de type farnésyle. La Gγt non-acylée a été obtenue en la surexprimant chez E. coli en fusion avec une étiquette de solubilisation/purification et en la purifiant par chromatographie d'affinité. L'identité de la séquence de la Gγt non-acylée a été confirmée par spectrométrie de masse. Afin d'étudier la forme acylée, des essais de surexpression ont été tentés en procédant à une cotransformation de la Gγt en présence de la farnésyle transférase. De plus, trois peptides ont été synthétisés commercialement pour analyser l'influence de chaque hélice alpha de la Gγt sur sa liaison membranaire, chacune comportant l'une des deux hélices : le segment C-terminal non-acylé, le segment C-terminal acylé et le segment N-terminal. Des analyses par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont permis de confirmer la structure secondaire native des formes de la Gγt et de caractériser leur dénaturation en fonction de la température et du temps. La liaison membranaire des formes de la Gγt a ensuite été analysée par le modèle des monocouches de Langmuir avec tensiométrie de surface, par spectroscopie infrarouge en présence de vésicules lipidiques et par spectroscopie infrarouge PM-IRRAS avec des monocouches de différents lipides. Finalement, l'analyse des résultats a permis de démontrer la fragilité de la structure de l'hélice alpha en C-terminal de la Gγt en fonction de la température et au cours de sa liaison membranaire ainsi que l'impact majeur de la farnésylation sur les propriétés de liaison membranaire de son segment C-terminal. Certaines questions de recherche ont été répondues et de nouvelles perspectives de recherche se dévoilent. / This research project aimed to study the gamma subunit (Gγt) of transducin, implicated in the visual phototransduction, more precisely the stability of its individual alpha helical segments and its mechanism of membrane binding involving favorable interactions from its residues and its farnesyl group. The non-acylated Gγt was obtained based on its expression in E. coli in fusion with a solubilization/purification tag and its subsequent purification by affinity chromatography. Its analysis by mass spectrometry allowed to confirm the identity of the non-acylated Gγt. The expression of the farnesylated Gγt was attempted. Three peptides were commercially synthesized to perform the analysis of each individual alpha helix of Gγt and to determine their role in its membrane binding. Each peptide segment contained one of the two alpha helices : the C-terminal non-acylated segment, the C-terminal acylated segment and the N-end segment. Circular dichroism and infrared spectroscopy analyses allowed to confirm the secondary structure of each form of Gγt, and their extent of denaturation has been determined as a function of temperature and time. The membrane binding of each form of Gγt was then analyzed using Langmuir monolayers with surface tensiometry, as well as by infrared spectroscopy in the presence of lipid vesicles and by infrared PM-IRRAS spectroscopy with different lipid monolayers. Finally, the results demonstrated the instability of the alpha helix of the C-terminal segment of Gγt as a function of temperature and the high impact of its farnesylation on the strength of its membrane binding. Some of the initially raised questions were answered while some new perspectives of research are presented.

Une chute d'expression de l'enzyme L-isoaspartyl (D-aspartate) méthyltransferase (PIMT), connue pour réparer les protéines endommagées qui ont accumulé des résidus aspartates anormaux, a été démontrée chez le rat atteint de troubles neurologiques à caractère épileptique et dans les glioblastomes humains. Dans cette étude, un profil protéomique correspondant au phénomène de l'inhibition de la PIMT a été dressé, suite à la combinaison de la technologie de l'ARN interférent (siRNA) et de la technologie de micro-puces d'anticorps (microarray). Un changement du niveau d'expression de plusieurs protéines, sous leur forme totale et phosphorylée, dont Erk et phospho-Erk, RSK et phospho-RSK ainsi que Akt et phospho-Akt a été observé. Ces résultats ont été confirmés par immunodétection, conjointement à la validation d'une méthode d'enrichissement des phosphoprotéines par chromatographie d'affinité dont la matrice est composée de trioxyde d'aluminium. Par la suite, un traitement combinant l'inhibition de la PIMT et l'utilisation de l'acide valproïque, un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, a permis d'observé un effet sur l'activation d'Akt et de RSK ainsi que sur l'expression de RSK1. Paralèllement, le traitement à l'acide valproïque a permis d'observer que celui-ci stimule l'expression de la PIMT. L'identification de ces protéines et de leur régulation lors de l'inhibition de la PIMT, suggère que la PIMT contrôle des voies de signalisation dont celle des Mitogen-activated protein kinases (MAPK) passant par ERK ainsi que d'autres voies de signalisation impliquant Akt et RSK. Lors de l'inhibition de la PIMT de concert avec le traitement à l'acide valproïque, ces voies de signalisation semblent être davantage activées. Bien que ce travail de recherche ne procure que des résultats préliminaires sur le contrôle que peut avoir la PIMT sur les voies de signalisation intracellulaires, ceux-ci font place à des hypothèses intéressantes qui une fois confirmées, permettront de trouver des cibles pharmacologiques qui aideront à contrer le développement des neuropathologies telles que l'épilepsie et les tumeurs cérébrales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : AKT, Cellules gliales cancéreuses, ERK, Immobilized metal-affinity chromatography, Phosphoprotéomique, PIMT, RSK.

Annuellement, la vie de millions de personnes est bouleversée suite à un diagnostic de cancer. Cette maladie est caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un tissu ou d'un organe au point de menacer la vie du patient. Une multitude de gènes sont connus pour leur implication dans le cancer. Toutefois les protéines régulatrices du cycle cellulaire, les cyclines, sont les principaux responsables du dérèglement cellulaire. Les cyclines D contrôlent l'entrée et la progression de la cellule en phase G1. La découverte d'un site commun d'intégration du rétrovirus murin Graffi en amont du gène de la cycline D2 (D2) a révélé l'existence d'un nouvel isoforme, la cycline D2 tronquée (D2Trc). La D2Trc se distingue par l'utilisation d'un site donneur d'épissage alternatif localisé dans le second intron. Il en résulte un exon 2 allongé et l'apparition d'un codon stop après le 156e acide aminé. Par rapport à la D2, 133 acides aminés sont manquants dont les 21 derniers de la boîte cycline. Les 20 acides aminés terminaux diffèrent de la D2. L'altération de la séquence génère une protéine cytosolique contrairement à la D2 qui est nucléaire. Il a été démontré que la D2Trc détient un pouvoir immortalisant supérieur à la D2. Cette étude vise à identifier les principaux partenaires d'interaction de la D2Trc chez la souris par co-immunoprécipitation. Des fibroblastes de souris (NIH/3T3) ont été transfectés par le vecteur pCMV contenant l'ADNc murin de la D2 ou la D2Trc en phase avec l'épitope Myc à l'extrémité N-terminale. La D2 et la D2Trc ont été co-immunoprécipitées à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'épitope Myc associé à de billes de protéine G sépharose. Les complexes protéiques ont été dissociés de l'anticorps par compétition avec le peptide Myc. Les extraits ont été séparés sur un gel de polyacrylamide puis colorés au nitrate d'argent. Les interactions entre l'anticorps et la forme native de la D2 et la D2Trc ont été observées in situ par colocalisation. Les résultats indiquent que l'anticorps peut se lier à l'étiquette Myc des protéines tant dans la forme native que linéaire, toutefois cette liaison serait faible. Les lavages s'avèrent suffisants pour briser le lien entre la protéine et l'anticorps. L'étiquette serait difficilement accessible dû à une congestion engendrée par les partenaires d'interaction et/ou une nouvelle conformation causée par des interactions entre l'étiquette et la protéine. L'utilisation d'une méthode alternative telle que le double hybride chez la levure ou l'utilisation du vecteur TAP serait à envisager. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Colocalisation, Co-immunoprécipitation, Cycle cellulaire, Cycline D2, Cycline D2 tronquée, Interactions protéine-protéine.

Thèse de doctorat : Biomécanique : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie : Lyon 1 : 2004. / Titre provenant de l'écran titre. 792 Réf. bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [112]-136. Publié aussi en version électronique.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs NMDA sont essentiels à la fonction synaptique. Ils activent diverses cascades de signalisation, dont celle de la calpaïne. Cette protéase peut cliver la sous-unité GluN2B du récepteur NMDA (rNMDA), mais les conséquences d'une telle coupure ne sont pas encore connues. L'objectif de cette étude est de détecter le fragment C-terminal ainsi généré par la calpaϊne et d'étudier ses possibles interactions avec d'autres protéines, telles que la CaMKII, et, par le fait même, son rôle dans la modulation de cascades de signalisation impliquées dans la fonction synaptique. J'ai donc procédé à des études biochimiques par Western Blot sur différentes fractions (nucléaire, cytosolique, densité post-synaptique (PSD), non-PSD) de neurones corticaux en culture âgée de 12 à 15 jours et j'ai observé le clivage de la sous-unité GluN2B en appliquant une stimulation excitotoxique composée de 100µM de glutamate et 10 µM de glycine, qui est reconnue pour activer tous les récepteurs NMDA (synaptique et extrasynaptique) (Papouin et al., 2012). Cette stimulation a généré un fragment de 60 kDa dans la fraction PSD spécifique à la sous-unité GluN2B. J'ai également démontré, par des expériences d'immunoprécipitation, l'interaction de ce fragment C-terminal avec la CaMKII et la PSD95, ce qui n'a jamais été dévoilé par le passé. Enfin, ce fragment pourrait possiblement être en mesure de maintenir l'activité de la CaMKII lors des processus d'excitotoxicité, ce qui engendrerait la mort neuronale et plusieurs pathologies. / NMDA receptors are essential for synaptic function. They activate various signaling cascades, including that of calpain. This protease can cleave the C-terminal tail of the GluN2B subunit of the NMDA receptor (NMDAr), but the consequences of this cleavage, in neuronal functions, is not yet known. The objective of this study is to detect the C-terminal fragment induced by calpain and to study its possible interactions with other proteins, such as CaMKII, and also, its role in the modulation of signaling cascades involved in synaptic function. I therefore performed biochemical studies by Western blot on different fractions (nuclear, cytosolic, postsynaptic density (PSD), non-PSD) of cortical neurons in culture aged 12 to 15 days and observed the cleavage of the GluN2B subunit by applying an excitotoxic stimulation composed of 100 μM glutamate and 10 μM glycine, which is known to activate all NMDA receptors (synaptic and extrasynaptic) (Papouin et al., 2012). This stimulation generated a fragment at 60 kDa in the PSD fraction specific to the GluN2B subunit. I have also demonstrated, through immunoprecipitation experiments, the interactions of this C-terminal fragment with CaMKII and PSD95, which has never been observed in the past. Finally, this fragment could possibly be able to maintain the activity of CaMKII during the excitotoxicity processes and to induce the neuronal death and several pathologies.

Des conditions hypoxiques surviennent lors de situations environnementales et physiologiques spécifiques, ainsi que dans le contexte de diverses pathologies. En raison de la place cruciale de l’oxygène dans les fonctions biologiques vitales, des mécanismes complexes ont évolué afin d’assurer une adaptation cellulaire adéquate à tout stress hypoxique. Cette adaptation est induite par une réponse transcriptionnelle rapide et hautement contrôlée. L’étude des mécanismes impliqués dans cette réponse est essentielle à la compréhension de ses conséquences, notamment dans le cadre de pathologies associées à des conditions hypoxiques, tel que la progression tumorale. Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF ; hypoxia-inducible factors) sont les médiateurs centraux et essentiels à la réponse transcriptionnelle adaptative à l’hypoxie. Ils sont responsables de l’induction de nombreux gènes régulant les processus physiologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires à cette adaptation. HIF-1 et HIF-2 sont les principaux membres de cette famille de facteurs de transcription, partageant des fonctions communes, distinctes et complémentaires. Leur activité dépend de leur sous-unité HIF-α respective, HIF-1α et HIF-2α. Divers mécanismes convergent afin d’assurer une modulation précise des HIF-α en fonction du niveau d’hypoxie et du contexte cellulaire. Ceci implique autant des mécanismes inducteurs que répresseurs, intervenant de manière coordonnée. L’étude de ces mécanismes est donc d’un intérêt considérable pour la compréhension de l’adaptation cellulaire en conditions hypoxiques. Des évidences suggèrent un rôle de la méthylation d’arginines dans la réponse cellulaire à l’hypoxie. Ainsi, cette thèse se penche sur l’implication de l’arginine méthyltransférase PRMT1 dans la régulation des HIF-α. Nous caractérisons PRMT1 en tant que nouveau répresseur de la transcription des gènes HIF1A et HIF2A. Cette répression résulte de l’inhibition des facteurs de transcription Sp1/3, des régulateurs connus de ces gènes. L’étude du mécanisme impliqué nous permet alors de décrire un nouveau rôle de PRMT1 dans la cascade de signalisation ERK. En effet, nous montrons que PRMT1 interagit avec la GEF DOCK6, réprimant ainsi l’activation des kinases ERK1/2 en aval. Ceci a pour conséquence de réduire la phosphorylation et l’activité de Sp1/3. Finalement, nous révélons une dynamique hypoxique intéressante, où une répression temporellement distincte de HIF1A et HIF2A par PRMT1 survient en hypoxie. Ainsi, cette thèse met en lumière un nouveau mécanisme de régulation des HIF-α et souligne l’importance de la répression de leur transcription dans l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Cette thèse contribue ainsi aux connaissances sur le contexte hautement dynamique et complexe de la régulation des facteurs de transcription HIF, des médiateurs essentiels de l’homéostasie cellulaire. / Hypoxic conditions occur under specific environmental et physiological situations, as well as in different pathological contexts. Due to the crucial requirement of oxygen for vital biological functions, complex mechanisms have evolved to ensure adequate cellular adaptation to hypoxic stress. Such adaptation is induced by a rapid and highly controlled transcriptional response. The study of this response is essential for the comprehension of its consequences, particularly in the context of pathologies associated with hypoxic conditions, such as tumor progression. Hypoxia-inducible factors (HIFs), are central and essential mediators of the adaptive transcriptional response to hypoxic stress. They are responsible for the induction of numerous genes regulating the physiological, cellular and molecular processes necessary for this adaptation. HIF-1 and HIF-2 are the main members of this family of transcription factors and share common, as well as distinct and complementary, fonctions. Their activities are dependent on their respective HIF-α subunits, HIF-1α and HIF-2α. Diverse mechanisms converge in order to allow precise modulation of HIF-α subunits in accordance to hypoxic and cellular contexts. This implicates positive as well as negative regulators, acting in a coordinated fashion. The study of these mechanisms is of considerable interest for the comprehension of cellular adaptation to hypoxia. Studies suggest a role for arginine methylation in the hypoxic stress reponse. Therefore, this thesis aims at evaluating the role of the protein arginine methyltransferase PRMT1 in HIF-α regulation. We characterize PRMT1 as a novel repressor of HIF1A and HIF2A gene transcription. This repression is caused by the inhibition of Sp1/3 transcription factors, known HIF1A and HIF2A gene regulators. The investigation of the underlining mechanism allowed us to describe a new role for PRMT1 in the ERK signaling cascade. Indeed, we demonstrate that PRMT1 interacts with the Rho GEF DOCK6, repressing downstream ERK1/2 kinases. This results in reduced Sp1/3 phosphorylation and activity. Finally, we reveal an interesting hypoxia-related dynamic, where a distinct temporal repression of HIF1A and HIF2A occurs under hypoxic conditions. This thesis higlights a new regulatory mechanism of HIF-α subunits and underlines the importance of their transcriptional repression in cellular adaptation to hypoxia. This thesis therefore contributes to the knowlegde surrounding the highly dynamic and complex regulation of HIF transcription factors, essential mediators of cellular homeostasis.