Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes au Canada. La curiethérapie HDR combinée à la radiothérapie externe (EBRT) et l'hormonothérapie (ADT) constitue une excellente approche thérapeutique pour traiter le CaP à risque intermédiaire et élevé. Le traitement par irradiation ciblée (HDR-BT ou EBRT) livre une dose suffisamment élevée de radiations vers les cellules cancéreuses pour les éradiquer en entraînant des cassures dans l'ADN. Ces dommages mènent les cellules à activer les voies de réparation d'ADN. Cependant, lorsque les dommages sont excessifs et irréparables, les cellules arrêtent le processus de réparation. Elles se dirigent vers la mort cellulaire en activant les voies apoptotiques. D'autre part, la suppression androgénique (ADT) peut activer l'apoptose ou la sénescence cellulaire dépendamment de durée de traitement. Il y a donc plusieurs voies de signalisation qui peuvent être possiblement activées à la suite du traitement HDR-BT/ EBRT avec ou sans hormonothérapie (ADT) Le but de ce projet est de comprendre la réponse cellulaire au traitement par HDR/ EBRT, ainsi qu'illustrer l'impact de l'ajout l'ADT sur cette réponse. Notre approche expérimentale consiste à évaluer l'expression et l'activation des marqueurs liés aux dommages et de réparation d'ADN γ-H2AX, DNA-PKcs et la recombinase Rad51, et mesurer aussi l'expression de Ki67 et p53, ainsi que les marqueurs apoptotiques Bax et PUMA, et le marqueur de senescence p16[exposant INK4] dans les biopsies de 22 patients avant, et après traitement avec HDR/ EBRT (avec ou sans ADT) en utilisant les techniques d'immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF). Nos résultats montrent que le traitement par radiations (HDR-BT/ EBRT) a permis d'activer la voie de réparation c-NHEJ. Cependant, cette voie est bloquée probablement à cause de l'activation de l'apoptose. En outre, il a été constaté que l'hormonothérapie additionnelle a induit la sénescence cellulaire après avoir inhibé la voie de réparation c-NHEJ.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 avril 2023) / La cornée, transparente, agit comme le hublot de notre œil et transmet la lumière jusqu'à la rétine où l'image est reconstituée. En raison de sa localisation anatomique superficielle, la cornée est particulièrement vulnérable aux traumatismes de toutes sortes. Certaines blessures graves des retards dans le traitement ou des traitements inadéquats peuvent mener à des déficiences visuelles importantes pouvant aller jusqu'à la cécité. La guérison des plaies cornéennes est un mécanisme complexe faisant intervenir plusieurs processus cellulaires dont la migration, la prolifération, la différenciation et la communication cellule-cellule. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à deux composantes que nous considérons importantes dans la guérison des plaies cornéennes, soit 1) la communication intracellulaire via les intégrines et 2) la communication intercellulaire entre les différentes couches de la cornée (épithélium, stroma et endothélium) via les exosomes. Pour ce faire, nous avons utilisé deux principaux modèles d'étude, soit un modèle en culture monocouche de cellules cornéennes primaires et un modèle 3D de cornée humaine reconstruite par génie tissulaire. Grâce à des études antérieures menées au sein du laboratoire, nous avons identifié trois médiateurs signalétiques en aval de la signalisation par les intégrines qui jouent un rôle important dans le processus de cicatrisation de la cornée, soit CREB, Akt et WNK1. Nous avons donc poursuivi l'étude de ces médiateurs signalétiques d'une part en approfondissant les mécanismes par lequel WNK1 exerce ses effets sur la guérison des plaies cornéennes, et d'autre part, en évaluant l'efficacité des nanoparticules d'or (AuNPs) comme vecteurs de relargage pour deux agents pharmacologiques ciblant CREB et Akt afin d'accélérer la guérison des plaies in vitro et in vivo. Les travaux présentés au chapitre I de cette thèse ont permis de démontrer que : i) la réduction de l'activité et de l'expression d'un grand nombre de facteurs de transcription, et ii) la régulation du patron d'expression génique dans les cellules épithéliales de cornée humaine étaient deux mécanismes majeurs pouvant expliquer pourquoi l'inhibition de WNK1 entraine un retard dans la guérison des plaies cornéennes. Les travaux présentés au chapitre II ont, quant à eux, été utiles afin de démontrer l'innocuité et l'efficacité des AuNPs in vitro. Nous nous sommes ensuite intéressés aux exosomes de la cornée humaine et à leur impact dans la guérison des plaies cornéennes. Les travaux présentés au chapitre III de cette thèse ont permis de démontrer qu'il est possible d'enrichir et de caractériser les exosomes des trois types cellulaires de la cornée. De plus, ils ont permis de mettre en lumière le potentiel intéressant qu'ont les exosomes à accélérer la vitesse de guérison de l'épithélium cornéen. Collectivement, ces résultats auront contribué à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la cicatrisation des plaies cornéennes. Ces études auront aussi permis de confirmer le rôle de WNK1 et des exosomes dans la guérison des plaies cornéennes, en plus d'illustrer le potentiel des AuNPs à être utilisées comme vecteurs de médicaments en ophtalmologie.

Les épithéliums recouvrent l’ensemble des surfaces et des cavités internes du corps humain. Le fonctionnement des cellules épithéliales repose sur la répartition des constituants cellulaires au sein de compartiments distincts : un compartiment apical, un compartiment latéral, et un compartiment basal : c’est ce que l’on appelle la polarité apico-basale. Plus de 80 % des cancers proviennent d’un dérèglement des cellules épithéliales. De plus, la polarité épithéliale est perdue lors des stades avancés du cancer, suggérant qu’elle contribue activement à la progression tumorale. C’est pourquoi il apparaît crucial de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la polarité épithéliale. La polarité est assurée par un ensemble de protéines réparties au sein des différents compartiments et agissant sous forme de modules très dynamiques. Un de ces modules est articulé autour de la protéine CRB3, qui agit comme un déterminant apical essentiel des cellules épithéliales. L’expression de CRB3 est perdue dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses en culture, suggérant que CRB3 pourrait détenir des fonctions inhibitrices de certains processus liés à l’avancement tumoral. Cependant, l’impact fonctionnel de la perte de CRB3 dans ces lignées cancéreuses reste encore peu connu, tout comme les mécanismes signalétiques agissant en aval de CRB3. Les travaux présentés dans cette thèse mettent en lumière de nouvelles évidences concernant le rôle fonctionnel de la perte de CRB3 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses. Plus précisément, nous montrons que CRB3 détient un rôle signalétique important lui conférant une fonction à la fois dans la morphogenèse épithéliale, mais également dans le maintien de l’intégrité épithéliale. Dans un premier temps, nous montrons que la ré-expression de CRB3 dans des cellules cancéreuses d’origine épithéliale permet le rétablissement d’une morphologie de type épithéliale, en lien avec l’organisation d’un réseau circonférentiel d’acto-myosine. Nous identifions également le sentier signalétique activé en aval de CRB3 et menant à l’activation de la petite GTPase RhoA, nécessaire au remodelage de la morphologie et du réseau d’acto-myosine des cellules cancéreuses. Ce sentier semble notamment jouer un rôle important en aval de CRB3 pour limiter la migration cellulaire. Ensuite, nous montrons que CRB3 contrôle différents sentiers signalétiques, et notamment la voie ERK MAP Kinase, une voie de signalisation fortement dérégulée dans le cancer. Bien que le rôle fonctionnel de cette régulation soit encore inconnu, elle pourrait contribuer à limiter la progression tumorale en aval de CRB3. Enfin, nous montrons que la perte d’expression de Crb3 chez la souris induit une mortalité périnatale associée à des défauts de morphogenèse épithéliale, indiquant que Crb3 est requise pour la viabilité des souris et le développement des structures épithéliales. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes liant la perte de la polarité épithéliale à l’avancement du processus tumoral, et vise à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre le développement de cancers.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est l’une des maladies auto-immunes qui atteint les articulations. Les symptômes principaux de la PR incluent une inflammation chronique de la synoviale dépendante de diverses cytokines et chimiokines inflammatoires, ainsi que de nombreux médiateurs de caractère lipidique, sécrétés par les cellules immunitaires et par les synoviocytes. L’acide lysophosphatidique (LPA) et son enzyme productrice, l’autotaxine (ATX) ont été détectés dans le liquide synovial. Les niveaux des ARNm de deux des six récepteurs du LPA, soit LPA1 et LPA3, sont aussi plus élevés dans les fibroblastes synoviaux des patients PR comparé à ceux d’arthrose ou suite avec une incubation avec le TNFα. Le LPA est aussi reconnu pour sa capacité à induire une production de cytokines et de chimiokines par des synoviocytes de type B (RAFLS) provenant de patients PR, ainsi que dans le modèle murin de poche d’air. D’ailleurs, la pré-incubation avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) in vitro ou bien in vivo rehaussa cette sécrétion de cytokines et de chimiokines induite par la LPA. Dans le cadre de cette étude, nous avons démontré qu’une chimiokine appelée CXCL13 est impliquée dans le recrutement lymphocytaire induit par le LPA après une pré-incubation au TNFα, dans le modèle de poche d’air. Le mécanisme par lequel le LPA peut faire sécréter des cytokines et des chimiokines et par lequel la TNFα peut contribuer à une superproduction de cytokines et de chimiokines dépendante du LPA a aussi été investigué. Nos résultats indiquent que la p38MAPK, la cascade signalétique ERK-MSK-CREB, la Rho kinase, et la PI3K sont toutes des voies de signalisation stimulées par le LPA qui modulent une sécrétion de l’interleukine-8 (IL-8) chez les synoviocytes de type B. En revanche, nous avons remarqué que la sécrétion de l’IL-8 par les synoviocytes stimulés par le LPA devenait insensible aux inhibiteurs des dites kinases lorsque traités au préalable au TNFα. Il n’en demeure pas moins qu’une inhibition simultanée de la p38MAPK et d’ ERK a mené à une diminution efficace de la sécrétion de l’IL-6 et de l’IL-8. Cette étude a permis de mieux comprendre le mécanisme de la réponse inflammatoire déclenchée par le LPA et d’identifier les principales voies de signalisation intracellulaire contribuant à la sécrétion de cytokines et de chimiokines en présence ou en absence de TNFα. Le travail pourrait avoir des retombées majeures en ce qui concerne les stratégies pour développer des drogues ciblant l’axe ATX-LPA et les kinases mentionnées ci-dessus pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. / Rheumatoid Arthritis (RA) is one of the most severe inflammatory arthritides. The main features of RA include chronic inflammation in the synovium mediated by inflammatory cytokines and chemokines as well as lipid mediators, secreted by immune cells and synoviocytes. Lysophosphatidic acid (LPA), a monoacyl phospholipid mediator, and its producing enzyme autotaxin (ATX) were detected in synovial fluid. LPA1 and LPA3 receptor mRNA levels were also higher in synovium from RA patients than from normal individuals. LPA was previously reported to induce cytokine and chemokine production in RA fibroblast-like synoviocytes (RAFLS) and in a mouse air pouch model. In addition, TNFα pretreatment in vivo or in vitro enhanced this cytokine and chemokine secretion induced by LPA. In this study, we demonstrated that an LPA-induced chemokine named CXCL13 is also involved in LPA-induced leukocyte recruitment in the mouse air pouch model after TNFα pretreatment. The mechanism whereby LPA induces cytokine/chemokine secretion and whereby TNFα pretreatment induces cytokine/chemokine super-production mediated by LPA was also investigated in this study. Our data demonstrated that p38MAPK, the ERK-MSK-CREB axis, Rho kinase, and PI3K were all involved in the LPA signaling resulting in IL-8 secretion in RAFLS. However, we found that, after pretreatment with TNFα, LPA-induced IL-8 secretion became insensitive to inhibitors of those kinases mentioned above. Notwithstanding, blocking both the p38MAPK and ERK pathways could effectively decrease IL-8 and IL-6 secretion. This study allowed a deeper understanding of the mechanism of the LPA-induced inflammatory response, including the signal pathways regulating cytokine/chemokine secretion with or without the exacerbating effect of TNFα. The study may have important implications for the development of drugs targeting ATX-LPA axis and the aforementioned signaling pathways for the treatment of RA.

La protéine mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin), lorsque dérégulée, favorise le développement tumoral par ses fonctions dans la prolifération et la survie cellulaire. Son activité est contrôlée principalement par les facteurs de sa voie d'activation canonique (PTEN/PI3K/AKT) qui sont souvent mutés dans les cancers. Cependant, certains cancers ne présentent pas d'altérations dans cette voie canonique bien que mTOR soit constitutivement active, suggérant ainsi un mécanisme différent. C'est le cas des gliomes de bas grade dont une grande partie présente des mutations hétérozygotes de l'enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH1 et IDH2) menant à un gain de fonction de celles-ci. En effet, l'α-cétoglutarate (αKG) produite par les formes sauvages sera rapidement transformé en 2-Hydroxyglutarate (2HG) par les formes mutées. De plus, ces gliomes présentent très tôt une activité accrue de mTOR et ce, de façon PTEN indépendante. Un criblage par ARN d'interférence ciblant des enzymes αKG dépendantes a permis l'identification de KDM4A, une lysine déméthylase, comme un nouveau régulateur de mTOR. La régulation de KDM4A sur mTOR n'est pas transcriptionnelle, mais semble due à son interaction avec DEPTOR. En effet, sa stabilité, en absence de KDM4A, est grandement diminuée, ce qui favorise l'activité de mTOR. Ainsi, l'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR s'avère être un nouveau mode de régulation de la protéine mTOR. Nous avons également découvert que DEPTOR peut être phosphorylé sur sa tyrosine 289, ce qui favorise l'activité de mTOR. Cette tyrosine, située près de sérines connues pour réguler la dégradation de DEPTOR, permet une meilleure stabilité de la protéine. De plus, la phosphorylation favorise une réorganisation rapide du cytosquelette d'actine par l'activation de mTORC2. Nous avons par la suite montré qu'elle diminue l'affinité de DEPTOR pour mTOR amenant une activation accrue de cette voie. Un criblage avec différents inhibiteurs de tyrosines kinases de même qu'une analyse par spectrométrie de masse nous a permis d'identifier les kinases SYK (Spleen Tyrosine Kinase) et EPHB2 comme régulateurs de la phosphorylation tyrosine de DEPTOR. En effet, nous avons démontré que la phosphorylation de SYK sur DEPTOR était dépendante de l'activation de SYK par EPHB2. En plus de cette phosphorylation tyrosine, DEPTOR possède également de nombreuses autres modifications post-traductionnelles. En effet, il peut être ubiquitinilé par des chaînes d'ubiquitine de type K48 promouvant sa dégradation par le protéasome, mais également par des chaînes d'ubiquitine K63 dont leur fonction est encore inconnue. L'absence de modification post-traductionnelles sur les 5 dernières lysines de DEPTOR augmente drastiquement la phosphorylation de la tyrosine 289 suggérant que la méthylation ou l'ubiquitination affecte cette modification. Nous avons également trouvé que DEPTOR pouvait être NEDDylée dans sa portion N-terminale au niveau de ses domaines DEP. Une analyse de spectrométrie de masse après des expériences de marquage de proximité par biotinilation a permis d'identifier de multiples enzymes pouvant potentiellement moduler ces modifications. Toutes ces modifications ouvrent la porte à de nouvelles avenues de régulation de l'activité de DEPTOR sur mTOR. L'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR de même que la phosphorylation de la tyrosine 289 de DEPTOR se révèlent comme de nouveaux mécanismes régulant l'activité de mTOR pouvant expliquer l'augmentation de l'activité de mTOR dans les cancers où la voie canonique n'est pas affectée. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques qui, combinées à celles déjà existantes, permettra d'offrir des traitements prometteurs lorsque cette voie est dérégulée, notamment dans les gliomes de bas grade. / Dysregulated mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin) is a potent tumor growth inducer known to promote cancer cell proliferation and survival. Its activity can be regulated by numerous factors composing the PTEN/PI3K/AKT canonical pathway, which are often mutated in cancer. However, in a subset of cancer showing a constitutively activated mTOR, there is no alteration within the canonical activation pathway, suggesting different activation mechanisms. Low-grade gliomas harbor mutation on Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1/2) conferring gain-of-function by the production of 2-Hydroxyglutarate (2HG) from α Ketoglutarate (αKG). This leads to a constitutive mTOR activation in a canonical independent manner. An RNAi screen led us to identify KDM4A, a αKG dependant lysine demethylase as a new regulator of mTOR activity. KDM4A interacts with DEPTOR, an endogenous inhibitor of mTOR and member of both mTOR complex. Depletion or inhibition of KDM4A by 2HG decreases DEPTOR stability and thereby increases mTOR activity. We also discovered a new post-translational modification (PTM) on DEPTOR, corresponding to a single phosphorylation event on tyrosine 289. While this modification increases DEPTOR stability, it also promotes its dissociation from mTORC1&2, leading to a rapid and sustain increase in mTORC1&2 activity. To identify the upstream signaling pathway(s) leading to tyrosine 289 phosphorylation, we performed mass spectrometry analysis, as well as a small drug screen of different tyrosine kinase inhibitors. Using these combined methods, we identify SYK (Spleen tyrosine kinase), whose expression levels correlate with levels of tyrosine 289 phosphorylation. We also found that SYK-induced phosphorylation of DEPTOR was regulated by the EPHB2 receptor. We have shown that DEPTOR harbors many other PTM like ubiquitination conjugated on lysine 48 promoting proteasomal degradation and ubiquitination conjugated on lysine 63 whose function is still unknown. The absence of PTM on the last 5 lysines of DEPTOR drastically increases the phosphorylation of tyrosine 289 suggesting that methylation and/or ubiquitination affect this modification. We also found that DEPTOR can be NEDDylated in its N-terminal part on its DEP domains. Mass spectrometry analysis after proximity biotinilation assays led us to discover multiple enzymes that could potentially modulate all these modifications. This open new insight on DEPTOR regulation and function on mTOR. Our findings uncovered new mechanisms regulating DEPTOR activity, which can explain the increased mTOR activity in cancer with unaffected PTEN/PI3K/AKT regulatory pathways. Better understanding of this mTOR/DEPTOR regulatory pathway could allow the development of a new therapeutic approach to inhibit mTOR associated cancer progression.

La plupart des mutations qui ont lieu sur la séquence protéique de FUS et qui lie la protéine à la SLA se trouvent dans le signal de localisation nucléaire (NLS), ce qui rend la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d'autres observations, il est suggéré qu'un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l'origine de la neurodégénérescence. Alors que FUS est principalement une protéine nucléaire impliquée dans les processus de transcriptions, il possède également plusieurs fonctions cytoplasmiques. FUS est impliqué dans l'activité traductionnelle. Son rôle dans la traduction n'est pas encore entièrement compris. Il a été rapporté que FUS à la capacité de se lier au polyribosome pour avoir une action répressive sur la synthèse des protéines. La voie de signalisation mTOR impacte l'association de FUS avec les polyribosomes dans des cellules HEK293T. La SLA étant une maladie qui impacte les neurones du système nerveux central, nous voulons savoir si FUS y sera régulé par cette voie de signalisation. Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont connues pour être impliquées dans l'interaction entre les protéines. L'une des hypothèses est que les PTMs et interactions protéines-protéines sont impliqués dans l'association entre FUS et les polyribosomes. Ainsi, l'objectif de mon étude est de déterminer comment la répression de l'activité traductionnelle par les FUS est régulée en étudiant les PTMs, les protéines et les voies de signalisation provoquant l'association de FUS aux polyribosomes. Mes résultats ont montré que la statut phosphorylation de FUS est impliquée dans sa localisation cytoplasmique et est en corrélation avec l'inhibition de la synthèse protéique. De plus, la voie de signalisation mTOR joue un rôle dans la localisation cytoplasmique de FUS en corrélation avec l'inhibition de la synthèse des protéines montrant le rôle de mTOR sur la modulation de FUS face à l'inhibition traductionnelle. De plus, mes résultats ont montré que le rôle de FUS dans la régulation de la traduction dans les régions éloignées telles que les synapses est influencée par la voie de signalisation mTOR. Par conséquent, des composants protéiques de mTOR serait impliqué dans l'association de FUS et son rôle d'inhibiteur traductionnel. / Most of the mutations that take place on the protein sequence of FUS that links the protein to ALS are in the nuclear localization signal (NLS), which makes the protein abnormally abundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it is suggested that a toxic gain-of-function of FUS in the cytoplasm is the cause of neurodegeneration. While FUS is primarily a nuclear protein involved in transcription processes, it also has several cytoplasmic functions. FUS is involved in translational regulation. Its role in translation is not yet fully understood. FUS has been reported to have the ability to bind to the polyribosome to have a repressive action on protein synthesis. The mTOR signaling pathway impacts the association of FUS with polyribosomes in HEK293T cells. Since ALS is a disease that impacts the neurons of the central nervous system, we want to know if FUS will be regulated by thissignaling pathway. Post-translational modifications (PTMs) are known to be involved in the interaction between proteins. One of the hypotheses is that PTMs and protein-protein interactions are coordinating the association between FUS and polyribosomes. Thus, the objective of my study is to determine how the repression of translational activity by FUS is regulated by studying the PTMs, FUS protein interactions and signaling pathways causing the association of FUS with polyribosomes. My results showed that the phosphorylation status of FUS is involved in its cytoplasmic localization. Moreover, the cytoplasmic localization of FUS correlates with inhibition of protein synthesis. Moreover, the mTOR signaling pathway plays a role in the cytoplasmic localization of FUS correlating with the inhibition of protein synthesis showing the role of mTOR on the modulation of FUS to translational inhibition. Furthermore, my results showed that the role of FUS in regulating translation in remote regions such as the synapse is influenced by the mTOR signaling pathway.

Les récepteurs NMDA sont essentiels à la fonction synaptique. Ils activent diverses cascades de signalisation, dont celle de la calpaïne. Cette protéase peut cliver la sous-unité GluN2B du récepteur NMDA (rNMDA), mais les conséquences d'une telle coupure ne sont pas encore connues. L'objectif de cette étude est de détecter le fragment C-terminal ainsi généré par la calpaϊne et d'étudier ses possibles interactions avec d'autres protéines, telles que la CaMKII, et, par le fait même, son rôle dans la modulation de cascades de signalisation impliquées dans la fonction synaptique. J'ai donc procédé à des études biochimiques par Western Blot sur différentes fractions (nucléaire, cytosolique, densité post-synaptique (PSD), non-PSD) de neurones corticaux en culture âgée de 12 à 15 jours et j'ai observé le clivage de la sous-unité GluN2B en appliquant une stimulation excitotoxique composée de 100µM de glutamate et 10 µM de glycine, qui est reconnue pour activer tous les récepteurs NMDA (synaptique et extrasynaptique) (Papouin et al., 2012). Cette stimulation a généré un fragment de 60 kDa dans la fraction PSD spécifique à la sous-unité GluN2B. J'ai également démontré, par des expériences d'immunoprécipitation, l'interaction de ce fragment C-terminal avec la CaMKII et la PSD95, ce qui n'a jamais été dévoilé par le passé. Enfin, ce fragment pourrait possiblement être en mesure de maintenir l'activité de la CaMKII lors des processus d'excitotoxicité, ce qui engendrerait la mort neuronale et plusieurs pathologies. / NMDA receptors are essential for synaptic function. They activate various signaling cascades, including that of calpain. This protease can cleave the C-terminal tail of the GluN2B subunit of the NMDA receptor (NMDAr), but the consequences of this cleavage, in neuronal functions, is not yet known. The objective of this study is to detect the C-terminal fragment induced by calpain and to study its possible interactions with other proteins, such as CaMKII, and also, its role in the modulation of signaling cascades involved in synaptic function. I therefore performed biochemical studies by Western blot on different fractions (nuclear, cytosolic, postsynaptic density (PSD), non-PSD) of cortical neurons in culture aged 12 to 15 days and observed the cleavage of the GluN2B subunit by applying an excitotoxic stimulation composed of 100 μM glutamate and 10 μM glycine, which is known to activate all NMDA receptors (synaptic and extrasynaptic) (Papouin et al., 2012). This stimulation generated a fragment at 60 kDa in the PSD fraction specific to the GluN2B subunit. I have also demonstrated, through immunoprecipitation experiments, the interactions of this C-terminal fragment with CaMKII and PSD95, which has never been observed in the past. Finally, this fragment could possibly be able to maintain the activity of CaMKII during the excitotoxicity processes and to induce the neuronal death and several pathologies.

Des conditions hypoxiques surviennent lors de situations environnementales et physiologiques spécifiques, ainsi que dans le contexte de diverses pathologies. En raison de la place cruciale de l’oxygène dans les fonctions biologiques vitales, des mécanismes complexes ont évolué afin d’assurer une adaptation cellulaire adéquate à tout stress hypoxique. Cette adaptation est induite par une réponse transcriptionnelle rapide et hautement contrôlée. L’étude des mécanismes impliqués dans cette réponse est essentielle à la compréhension de ses conséquences, notamment dans le cadre de pathologies associées à des conditions hypoxiques, tel que la progression tumorale. Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF ; hypoxia-inducible factors) sont les médiateurs centraux et essentiels à la réponse transcriptionnelle adaptative à l’hypoxie. Ils sont responsables de l’induction de nombreux gènes régulant les processus physiologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires à cette adaptation. HIF-1 et HIF-2 sont les principaux membres de cette famille de facteurs de transcription, partageant des fonctions communes, distinctes et complémentaires. Leur activité dépend de leur sous-unité HIF-α respective, HIF-1α et HIF-2α. Divers mécanismes convergent afin d’assurer une modulation précise des HIF-α en fonction du niveau d’hypoxie et du contexte cellulaire. Ceci implique autant des mécanismes inducteurs que répresseurs, intervenant de manière coordonnée. L’étude de ces mécanismes est donc d’un intérêt considérable pour la compréhension de l’adaptation cellulaire en conditions hypoxiques. Des évidences suggèrent un rôle de la méthylation d’arginines dans la réponse cellulaire à l’hypoxie. Ainsi, cette thèse se penche sur l’implication de l’arginine méthyltransférase PRMT1 dans la régulation des HIF-α. Nous caractérisons PRMT1 en tant que nouveau répresseur de la transcription des gènes HIF1A et HIF2A. Cette répression résulte de l’inhibition des facteurs de transcription Sp1/3, des régulateurs connus de ces gènes. L’étude du mécanisme impliqué nous permet alors de décrire un nouveau rôle de PRMT1 dans la cascade de signalisation ERK. En effet, nous montrons que PRMT1 interagit avec la GEF DOCK6, réprimant ainsi l’activation des kinases ERK1/2 en aval. Ceci a pour conséquence de réduire la phosphorylation et l’activité de Sp1/3. Finalement, nous révélons une dynamique hypoxique intéressante, où une répression temporellement distincte de HIF1A et HIF2A par PRMT1 survient en hypoxie. Ainsi, cette thèse met en lumière un nouveau mécanisme de régulation des HIF-α et souligne l’importance de la répression de leur transcription dans l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Cette thèse contribue ainsi aux connaissances sur le contexte hautement dynamique et complexe de la régulation des facteurs de transcription HIF, des médiateurs essentiels de l’homéostasie cellulaire. / Hypoxic conditions occur under specific environmental et physiological situations, as well as in different pathological contexts. Due to the crucial requirement of oxygen for vital biological functions, complex mechanisms have evolved to ensure adequate cellular adaptation to hypoxic stress. Such adaptation is induced by a rapid and highly controlled transcriptional response. The study of this response is essential for the comprehension of its consequences, particularly in the context of pathologies associated with hypoxic conditions, such as tumor progression. Hypoxia-inducible factors (HIFs), are central and essential mediators of the adaptive transcriptional response to hypoxic stress. They are responsible for the induction of numerous genes regulating the physiological, cellular and molecular processes necessary for this adaptation. HIF-1 and HIF-2 are the main members of this family of transcription factors and share common, as well as distinct and complementary, fonctions. Their activities are dependent on their respective HIF-α subunits, HIF-1α and HIF-2α. Diverse mechanisms converge in order to allow precise modulation of HIF-α subunits in accordance to hypoxic and cellular contexts. This implicates positive as well as negative regulators, acting in a coordinated fashion. The study of these mechanisms is of considerable interest for the comprehension of cellular adaptation to hypoxia. Studies suggest a role for arginine methylation in the hypoxic stress reponse. Therefore, this thesis aims at evaluating the role of the protein arginine methyltransferase PRMT1 in HIF-α regulation. We characterize PRMT1 as a novel repressor of HIF1A and HIF2A gene transcription. This repression is caused by the inhibition of Sp1/3 transcription factors, known HIF1A and HIF2A gene regulators. The investigation of the underlining mechanism allowed us to describe a new role for PRMT1 in the ERK signaling cascade. Indeed, we demonstrate that PRMT1 interacts with the Rho GEF DOCK6, repressing downstream ERK1/2 kinases. This results in reduced Sp1/3 phosphorylation and activity. Finally, we reveal an interesting hypoxia-related dynamic, where a distinct temporal repression of HIF1A and HIF2A occurs under hypoxic conditions. This thesis higlights a new regulatory mechanism of HIF-α subunits and underlines the importance of their transcriptional repression in cellular adaptation to hypoxia. This thesis therefore contributes to the knowlegde surrounding the highly dynamic and complex regulation of HIF transcription factors, essential mediators of cellular homeostasis.

Thèse en cotutelle : « Université Laval, Québec, Canada, Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Carthage, Tunis, Tunisie » / Depuis des décennies, l'hormone synthétisée et sécrétée naturellement par la glande pinéale appelée « mélatonine » a fait son entrée dans le monde scientifique. Les études ont montré que le rythme de sécrétion de la mélatonine dépend de la photopériode, cette dernière étant influencée par la saison. Chez les petits ruminants, la mise en veilleuse de la fonction de reproduction pour une période de l'année est désignée par la reproduction saisonnée. L'information photopériodique est traduite en termes de variation de la durée de sécrétion de la mélatonine. Chez l'espèce ovine, des études ont montré que la mélatonine régule indirectement l'axe gonadotrope en modulant la sécrétion de GnRH. Cette modulation se fait à travers les récepteurs spécifiques à la mélatonine MT1 et MT2. Cependant, il existe des variations considérables dans la densité et l'emplacement de l'expression des récepteurs de la mélatonine entre les espèces. Chez les animaux saisonniers, la mélatonine est impliquée dans la fonction ovarienne en activant des récepteurs multiples et des voies de signalisation de différents types de cellules cibles, en particulier les cellules de la thèque et de granulosa. La confirmation de la présence de cette hormone avec des quantités plus élevées au niveau du liquide folliculaire que dans le plasma a encouragé les chercheurs à tester son rôle spécifiquement au niveau du follicule ovarien. Dans un premier temps, cette thèse s'intéresse à comprendre l'effet de la mélatonine sur une culture de cellules de granulosa à travers une prédiction des principales voies de signalisation impliquées par la mélatonine dans la manipulation des signaux métaboliques au sein des follicules ovariens au stade antrale. L'objectif étant d'étudier la réponse folliculaire à la mélatonine au niveau de l'expression des gènes en utilisant l'outil de séquençage à haut débit. Nous avons constaté une image transcriptomique différente pour la culture des cellules de granulosa traitées avec de la mélatonine comparée à la culture non traitée. De plus, l'analyse des gènes différentiellement exprimés et des principales voies biologiques y étant associée nous ont démontré que cette hormone agit à travers la voie PKB/mTOR pour reprogrammer le métabolisme des cellules de granulosa afin de maintenir une lente croissance et différenciation ainsi que de prévenir l'atrésie folliculaire. Dans un second temps, cette thèse s'intéresse à la caractérisation des voies de signalisation activées, via les récepteurs spécifiques MT1 et MT2, dans la médiation de l'effet de la mélatonine au niveau des cellules de granulosa humaines. En utilisant des agonistes et des antagonistes spécifiques aux deux récepteurs, cette étude a permis de mettre en évidence un rôle clair du récepteur MT1 dans la médiation de l'effet antiproliférative de la mélatonine, via la voie PKB. Dans un troisième temps, cette thèse s'intéresse aussi à comprendre l'effet de la mélatonine à travers son récepteur MT1 sur le cycle reproductif chez les petits ruminants. Cette étude consiste à établir le lien entre les polymorphismes existants au niveau du récepteur MT1 et la saisonnalité de reproduction chez 77 brebis de deux races ovines locales en Tunisie, la Barbarine (B) et la Queue Fine de l'Ouest (QFO). Cette étude nous a permis de trouver certaines mutations au niveau du gène de récepteur à la mélatonine MT1 chez ces brebis, spécifiquement les SNPs liés au caractère saisonnier de la reproduction chez d'autres races ovines dans le monde. Les analyses statistiques nous ont prouvé que les brebis de la race B de génotype G/G et G/A qui sont les moins sensibles à la photopériode et répondent rapidement à l'effet bélier que les brebis de génotype A/A, ce qui nous laisse conclure que les brebis de la race (B) ont un anœstrus moins profond que les brebis de la race QFO. Globalement, les résultats de ces études suggèrent un aperçu global de l'action de la mélatonine au niveau des cellules de granulosa humaine tout en améliorant les connaissances sur le rôle de ses récepteurs spécifiques MT1 et MT2 ainsi que les principaux réseaux de signalisation impliqués à la suite de leur activation. Cette thèse permet de mettre en lumière les différents polymorphismes au niveau du gène de récepteur MT1 chez deux races ovines et révèle également une certaine sensibilité d'une race plus que l'autre à la photopériode. Ces résultats servent à optimiser les programmes d'amélioration génétique de reproduction et à éclaircir la réponse génomique des cellules de la granulosa humaine sur l'échelle transcriptomique. / For decades, the hormone synthesized and secreted naturally by the pineal gland called melatonin has entered the scientific world. This sleep hormone, which was discovered in 1960, has attracted the attention of researchers who have begun to explore more and more about its effects on animals. Studies have shown that the melatonin secretion rate depends on the photoperiod, which is influenced by the season. In nature, the seasonal variation in climate and food availability are important parameters in which, different animal species must adapt to survive well. In small ruminants, the dormancy of the reproductive function for a period of the year is referred to as the seasonal breeding. The photoperiod information is translated in terms of variation during the secretion of melatonin. In sheep, melatonin indirectly regulates the gonadotropic axis by modulating GnRH secretion. This modulation is done through melatonin-specific receptors MT1 and MT2. However, there are considerable variations in the density and location of melatonin receptor expression among species. In seasonal animals, melatonin is involved in ovarian function by activating multiple receptors and signaling pathways of different types of target cells, especially theca and granulosa cells. Confirmation of the higher amount of this hormone in the follicular fluid than in the plasma encouraged the researchers to test its role specifically on the ovarian follicle. First, this thesis is interested in understanding the effect of melatonin on a culture of human granulosa cells. It is also intended to predict the main signaling pathways involved with melatonin in the manipulation of metabolic signals within the antral ovarian follicles. The objective of this study is to understand the follicular response to melatonin in terms of gene expression and epigenetic adaptation while using the high-throughput sequencing tool. This relatively simple system could allow exploring the molecular mechanism that acts across generations, it allows the production of a global image of the activated pathways in the presence of melatonin. The foundation of different transcriptomic images for the culture of granulosa cells treated with melatonin than untreated culture. In addition, the analysis of differentially expressed genes and the main biological pathways associated with them showed that this hormone may act through the PKB/mTOR pathway to reprogram granulosa cell metabolism to maintain slow growth and differentiation as well as prevent follicular atresia. In the second stage, this thesis focuses on the characterization of activated signaling pathways, via specific receptors MT1 and MT2, in the mediation of the effect of melatonin in human granulosa cells. The aim was to identify which receptor is most involved in the effect of melatonin using specific agonists and antagonists to the two receptors. This study demonstrated a clear role of the MT1 receptor in mediating the antiproliferative effect of melatonin via PKB pathway by reprogramming the metabolism of human granulosa cells. To understand the effect of melatonin through its MT1 receptor on the reproductive cycle in small ruminants, the third chapter consists in establishing the link between the existing polymorphisms on MT1 receptor gene and the seasonal reproduction of 77 ewes of two local sheep breeds in Tunisia, the Barbarine and the Queue Fine de l'Ouest (QFO). This study allowed us to find certain mutations in the MT1 melatonin receptor gene in ewes of both breeds, specifically, SNPs related to the seasonality of reproduction in other sheep breeds worldwide. Statistical analyses have shown us that the Barbarine ewes with G/G and G/A genotypes are less sensitive to the photoperiod and spread rapidly to the ram effect than ewes with A/A genotype. This leads us to conclude that the Barbarine breed showed to be ready to resume reproductive activity earlier than the QFO ewes at the ram introduction. Overall, the results of these studies suggest a global overview of the melatonin action on human granulosa cells while improving our knowledge on the role of its specific MT1 and MT2 receptors as well as the main signaling networks involved following their activation. This thesis allows us to highlight the different polymorphisms at the level of the MT1 receptor gene in two Tunisian sheep breeds and reveals a certain sensitivity of one breed more than the other to the photoperiod. These results serve to optimize genetic breeding improvement programs and to clarify the genomic response of human granulosa cells on the transcriptomic scale.

La réponse cellulaire aux stimuli extracellulaires est souvent médiée par des voies de signalisation qui agissent en aval des récepteurs transmembranaires, comme les récepteurs tyrosine kinases (RTK). Avec quatorze membres, la famille des récepteurs Eph représente la plus grande famille de RTK chez l'humain. Contrairement aux autres RTK, les ligands des récepteurs Eph, les éphrines, sont des protéines associées à la membrane cellulaire. La signalisation Eph-éprhines est donc principalement impliquée dans des événements de communication qui impliquent des contacts cellule-cellule comme la migration cellulaire, la répulsion et l'adhésion cellule-cellule. Ces événements sont cruciaux pour certains processus biologiques tels le guidage axonal et l'organisation tissulaire dans l'organisme en développement et chez l'adulte. Les récepteurs Eph sont fréquemment surexprimés ou dérégulés dans divers cancers, en particulier dans les plus agressifs et mortels. Récemment, la signalisation Eph-éphrines est devenue une nouvelle cible émergente pour le traitement du cancer. Bien que les fonctions biologiques des récepteurs Eph aient été largement étudiées, notre compréhension des mécanismes moléculaires grâce auxquels les récepteurs Eph régulent des phénotypes cellulaires précis demeure incomplète. Pour mieux comprendre le système de signalisation impliquant les Eph, mes travaux ont porté sur l'identification de nouvelles protéines effectrices en aval des récepteurs Eph et sur l'étude de leurs implications dans les fonctions régulées par les récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les complexes de signalisation associés aux récepteurs Eph dans des conditions natives, j'ai appliqué une approche basée sur la spectrométrie de masse (MS), le marquage de proximité BioID. Cela m'a permis de surmonter les limites de l'utilisation d'approches conventionnelles de purification par affinité pour cartographier les interactions protéine-protéine liées aux récepteurs transmembranaires. J'ai obtenu un réseau de signalisation dépendant des récepteurs EphA4, - B2, -B3 et -B4, qui comprend 395 protéines, dont la plupart n'avaient jamais été liées à la signalisation Eph-dépendante. Pour tester la pertinence biologique des partenaires identifiés, j'ai examiné la contribution de 17 candidats en utilisant une approche de perte de fonction dans une expérience de tri cellulaire dépendante des récepteurs Eph. J'ai pu montrer que la déplétion de quelques candidats, incluant la protéine Par3, bloque le tri des cellules. En utilisant la purification par affinité combinée à la MS, j'ai aussi identifié un complexe de signalisation impliquant la kinase C-terminal SRC (CSK), dont le recrutement aux complexes Par3 dépend des signaux des récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les interactions protéiques suivant la liaison Eph-éphrine, j'ai effectué des expériences de TurboID. Ces études m'ont permis d'identifier des complexes protéiques associés au récepteur EphA4 lorsqu'il est lié à l'éphrine-B2. J'ai également étudié les interactions protéine-protéine dépendantes de la liaison du récepteur EphB2 aux éphrines-B1 et -B2. Pour explorer si l'interaction d'EphB2 avec ces deux ligands peut mener à une réponse de signalisation inverse différente, j'ai identifié les partenaires de des ephrin-B1/-B2 lorsque stimulés par EphB2. Enfin, j'ai cartographié les réseaux de signalisation dépendants des récepteurs EphA4 et EphB2 sauvages ou kinase-inactifs, ce qui m'a permis de conclure que la perte de leur activité catalytique a conduit à des changements majeurs dans les interactomes dépendants de ces récepteurs. L'ensemble de mes résultats a permis de mieux définir les complexes protéiques dépendants des récepteurs Eph. Mes études ont mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux récepteurs Eph et de leur contribution dans le processus de délimitation des tissus, un processus souvent perturbé dans des maladies comme le cancer. / The cellular response to extracellular stimuli is often mediated by signaling pathways that act downstream of transmembrane receptors, such as receptor tyrosine kinases (RTKs). With fourteen members, the Eph family of RTKs is the largest in humans. In contrast to other RTKs, Eph receptor cognate ligands, ephrins, are tethered to the cell surface. This results in Eph receptor-ephrin signaling being mainly involved in short-range cell-cell communication events that regulate cell migration, repulsion and cell-cell adhesion. These events are crucial in biological processes such as axon guidance and tissue boundary formation in the developing and adult organisms. Eph receptors are frequently overexpressed or deregulated in a variety of human tumors, especially in the more aggressive and lethal ones. In recent years, the Eph-ephrin signaling system became an emerging new target for cancer treatment. Although a plethora of Eph receptor biological functions have been extensively studied, we still have a vague idea on the molecular mechanisms of Eph receptor signal transduction, underlying how Eph receptors regulate precise cellular phenotypes. To better understand the Eph receptor signaling system, my studies focused on the identification of novel Eph receptor downstream effector proteins and the determination of their requirement for Eph receptor-regulated functions. To unravel Eph receptor-associated signaling complexes under native conditions, I applied a mass spectrometry (MS)-based approach, namely BioID proximity labeling. This allowed me to overcome the limitations of conventional affinity purification approaches for mapping protein-protein interactions of transmembrane receptors. I obtained a composite signaling network from EphA4, -B2, -B3 and -B4 receptors that comprises 395 proteins, most of which not previously linked to Eph signaling. To test the biological relevance of the identified Eph receptor proximity interactors, I examined the contribution of 17 candidates using a loss-of-function approach in an Eph receptor-dependent cell sorting assay. I showed that depletion of a few candidates, including the signaling scaffold Par3, blocks Eph receptordependent cell sorting. Using affinity purification combined with MS, I further delineated a signaling complex involving C-terminal SRC kinase (CSK), whose recruitment to Par3 complexes is dependent on Eph receptor signals. To further elucidate Eph receptor-centric signaling complexes that are formed upon ephrin binding and are affected by Eph receptor catalytic activity I performed TurboID experiments. I systematically mapped ligand stimulation-dependent signaling networks downstream of EphA4 and EphB2 receptors. I dissected the impact of ephrin-B2 stimulation on the formation of EphA4- nucleated proximal protein complexes. Moreover, I showed the differential recruitment of EphB2 partners upon receptor binding to the same subclass of ligands, ephrin-B1 and ephrin-B2. To explore whether the EphB2 interactions with these two ephrin-B ligands elicit different reverse signaling responses, I delineated ephrin-B1/-B2 proximity partners recruited upon EphB2 stimulation. I also determined that the kinase domain of EphA4/-B2 plays a major role in determining the composition of signaling networks around the receptors, as a loss of catalytic activity led to a drastic decrease in a number of interactors with the receptors. Collectively, my definition of Eph receptor signaling networks sheds light on physiologically relevant Eph receptor-centered protein complexes that occur in living cells. These studies will lead to a better understanding of the mechanisms by which Eph receptors transmit signals at the membrane and give insight into how Eph receptor-mediated signaling pathways contribute to boundary formation, a process often disrupted in diseases like cancer.