Les récepteurs NMDA sont essentiels à la fonction synaptique. Ils activent diverses cascades de signalisation, dont celle de la calpaïne. Cette protéase peut cliver la sous-unité GluN2B du récepteur NMDA (rNMDA), mais les conséquences d'une telle coupure ne sont pas encore connues. L'objectif de cette étude est de détecter le fragment C-terminal ainsi généré par la calpaϊne et d'étudier ses possibles interactions avec d'autres protéines, telles que la CaMKII, et, par le fait même, son rôle dans la modulation de cascades de signalisation impliquées dans la fonction synaptique. J'ai donc procédé à des études biochimiques par Western Blot sur différentes fractions (nucléaire, cytosolique, densité post-synaptique (PSD), non-PSD) de neurones corticaux en culture âgée de 12 à 15 jours et j'ai observé le clivage de la sous-unité GluN2B en appliquant une stimulation excitotoxique composée de 100µM de glutamate et 10 µM de glycine, qui est reconnue pour activer tous les récepteurs NMDA (synaptique et extrasynaptique) (Papouin et al., 2012). Cette stimulation a généré un fragment de 60 kDa dans la fraction PSD spécifique à la sous-unité GluN2B. J'ai également démontré, par des expériences d'immunoprécipitation, l'interaction de ce fragment C-terminal avec la CaMKII et la PSD95, ce qui n'a jamais été dévoilé par le passé. Enfin, ce fragment pourrait possiblement être en mesure de maintenir l'activité de la CaMKII lors des processus d'excitotoxicité, ce qui engendrerait la mort neuronale et plusieurs pathologies. / NMDA receptors are essential for synaptic function. They activate various signaling cascades, including that of calpain. This protease can cleave the C-terminal tail of the GluN2B subunit of the NMDA receptor (NMDAr), but the consequences of this cleavage, in neuronal functions, is not yet known. The objective of this study is to detect the C-terminal fragment induced by calpain and to study its possible interactions with other proteins, such as CaMKII, and also, its role in the modulation of signaling cascades involved in synaptic function. I therefore performed biochemical studies by Western blot on different fractions (nuclear, cytosolic, postsynaptic density (PSD), non-PSD) of cortical neurons in culture aged 12 to 15 days and observed the cleavage of the GluN2B subunit by applying an excitotoxic stimulation composed of 100 μM glutamate and 10 μM glycine, which is known to activate all NMDA receptors (synaptic and extrasynaptic) (Papouin et al., 2012). This stimulation generated a fragment at 60 kDa in the PSD fraction specific to the GluN2B subunit. I have also demonstrated, through immunoprecipitation experiments, the interactions of this C-terminal fragment with CaMKII and PSD95, which has never been observed in the past. Finally, this fragment could possibly be able to maintain the activity of CaMKII during the excitotoxicity processes and to induce the neuronal death and several pathologies.

Des conditions hypoxiques surviennent lors de situations environnementales et physiologiques spécifiques, ainsi que dans le contexte de diverses pathologies. En raison de la place cruciale de l’oxygène dans les fonctions biologiques vitales, des mécanismes complexes ont évolué afin d’assurer une adaptation cellulaire adéquate à tout stress hypoxique. Cette adaptation est induite par une réponse transcriptionnelle rapide et hautement contrôlée. L’étude des mécanismes impliqués dans cette réponse est essentielle à la compréhension de ses conséquences, notamment dans le cadre de pathologies associées à des conditions hypoxiques, tel que la progression tumorale. Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF ; hypoxia-inducible factors) sont les médiateurs centraux et essentiels à la réponse transcriptionnelle adaptative à l’hypoxie. Ils sont responsables de l’induction de nombreux gènes régulant les processus physiologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires à cette adaptation. HIF-1 et HIF-2 sont les principaux membres de cette famille de facteurs de transcription, partageant des fonctions communes, distinctes et complémentaires. Leur activité dépend de leur sous-unité HIF-α respective, HIF-1α et HIF-2α. Divers mécanismes convergent afin d’assurer une modulation précise des HIF-α en fonction du niveau d’hypoxie et du contexte cellulaire. Ceci implique autant des mécanismes inducteurs que répresseurs, intervenant de manière coordonnée. L’étude de ces mécanismes est donc d’un intérêt considérable pour la compréhension de l’adaptation cellulaire en conditions hypoxiques. Des évidences suggèrent un rôle de la méthylation d’arginines dans la réponse cellulaire à l’hypoxie. Ainsi, cette thèse se penche sur l’implication de l’arginine méthyltransférase PRMT1 dans la régulation des HIF-α. Nous caractérisons PRMT1 en tant que nouveau répresseur de la transcription des gènes HIF1A et HIF2A. Cette répression résulte de l’inhibition des facteurs de transcription Sp1/3, des régulateurs connus de ces gènes. L’étude du mécanisme impliqué nous permet alors de décrire un nouveau rôle de PRMT1 dans la cascade de signalisation ERK. En effet, nous montrons que PRMT1 interagit avec la GEF DOCK6, réprimant ainsi l’activation des kinases ERK1/2 en aval. Ceci a pour conséquence de réduire la phosphorylation et l’activité de Sp1/3. Finalement, nous révélons une dynamique hypoxique intéressante, où une répression temporellement distincte de HIF1A et HIF2A par PRMT1 survient en hypoxie. Ainsi, cette thèse met en lumière un nouveau mécanisme de régulation des HIF-α et souligne l’importance de la répression de leur transcription dans l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Cette thèse contribue ainsi aux connaissances sur le contexte hautement dynamique et complexe de la régulation des facteurs de transcription HIF, des médiateurs essentiels de l’homéostasie cellulaire. / Hypoxic conditions occur under specific environmental et physiological situations, as well as in different pathological contexts. Due to the crucial requirement of oxygen for vital biological functions, complex mechanisms have evolved to ensure adequate cellular adaptation to hypoxic stress. Such adaptation is induced by a rapid and highly controlled transcriptional response. The study of this response is essential for the comprehension of its consequences, particularly in the context of pathologies associated with hypoxic conditions, such as tumor progression. Hypoxia-inducible factors (HIFs), are central and essential mediators of the adaptive transcriptional response to hypoxic stress. They are responsible for the induction of numerous genes regulating the physiological, cellular and molecular processes necessary for this adaptation. HIF-1 and HIF-2 are the main members of this family of transcription factors and share common, as well as distinct and complementary, fonctions. Their activities are dependent on their respective HIF-α subunits, HIF-1α and HIF-2α. Diverse mechanisms converge in order to allow precise modulation of HIF-α subunits in accordance to hypoxic and cellular contexts. This implicates positive as well as negative regulators, acting in a coordinated fashion. The study of these mechanisms is of considerable interest for the comprehension of cellular adaptation to hypoxia. Studies suggest a role for arginine methylation in the hypoxic stress reponse. Therefore, this thesis aims at evaluating the role of the protein arginine methyltransferase PRMT1 in HIF-α regulation. We characterize PRMT1 as a novel repressor of HIF1A and HIF2A gene transcription. This repression is caused by the inhibition of Sp1/3 transcription factors, known HIF1A and HIF2A gene regulators. The investigation of the underlining mechanism allowed us to describe a new role for PRMT1 in the ERK signaling cascade. Indeed, we demonstrate that PRMT1 interacts with the Rho GEF DOCK6, repressing downstream ERK1/2 kinases. This results in reduced Sp1/3 phosphorylation and activity. Finally, we reveal an interesting hypoxia-related dynamic, where a distinct temporal repression of HIF1A and HIF2A occurs under hypoxic conditions. This thesis higlights a new regulatory mechanism of HIF-α subunits and underlines the importance of their transcriptional repression in cellular adaptation to hypoxia. This thesis therefore contributes to the knowlegde surrounding the highly dynamic and complex regulation of HIF transcription factors, essential mediators of cellular homeostasis.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le maintien d'une homéostasie redox intracellulaire est essentielle à la survie de la cellule. Pour cela, la cellule doit réguler la concentration intracellulaire en intermédiaires réactifs de l'oxygène (ou IRO), sous-produits de la respiration. La connaissance que nous avons des mécanismes de contrôle de l'homéostasie redox repose principalement sur des données obtenues chez la bactérie. Nous avons donc choisi un eucaryote comme modèle d'étude, la levure S. cerevisiae. Le facteur de transcription Yap1 contrôle l'expression d'anti-oxydants, responsables en particulier de la réduction du peroxyde d'hydrogène (H2O2) et de l'ion superoxyde (O2.-). L'activité de Yap1 est régulée par sa localisation subcellulaire. Nous avons montré qu'in vivo, l'activation de Yap1 par le H2O2 repose sur la formation d'un pont disulfure intramoléculaire. Cette oxydation est responsable de l'accumulation nucléaire du régulateur et permet la production des anti-oxydants. L'oxydation de Yap1 par le H2O2 n'est pas directe mais elle est relayée par une peroxydase, Gpx3. L'oxydation de Gpx3 par le H2O2 entraîne la formation d'un pont disulfure intermoléculaire entre Yap1 et Gpx3, rapidement transformé en pont intramoléculaire dans Yap1. Ainsi, Gpx3 détecte et transmet spécifiquement le signal H2O2 à Yap1 par le transfert d'une modification redox. La description de ce mode d'activation assimile Gpx3 à un récepteur des peroxydes. L'ensemble de ces données nous ont conduit à renommer Gpx3 en Orp1 pour " Oxidant Receptor Peroxidase ". Après correction de la perturbation redox, Yap1 est désactivé par réduction, vraisemblablement par les thiorédoxines, dont Yap1 contrôle l'expression. La levure possède donc un système de surveillance de la concentration en peroxydes rétrocontrôlé.

La dérégulation des facteurs NF-κB, impliqués dans la survie cellulaire et l'inflammation, peut entraîner des pathologies inflammatoires chroniques et des cancers. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier des régulateurs négatifs des voies NF-κB conservées au cours de l'évolution, Toll et Imd, chez la drosophile. De nombreux éléments de ces voies sont régulés par ubiquitination. Les « Ubiquitine Specific Proteases » (USPs) constituent ainsi un nouveau champ d'investigation pour rechercher des régulateurs de ces voies. J'ai réalisé le crible d'une collection d'ARN interférents permettant l'inactivation des 21 USPs de drosophile en cellules S2. Ce crible a mis en évidence trois régulateurs négatifs de la voie Imd, dont un montre également une activité sur la voie Toll. Parmi ces candidats, dUSP36, un homologue de la protéine humaine USP36, avait été préalablement sélectionné par un crible génétique au laboratoire. Des études de l'équipe auxquelles j'ai contribué, montrent son rôle in vivo dans la régulation négative de la protéine adaptatrice Imd via son activité catalytique. Afin de caractériser la fonction des deux autres USPs, j'ai mené des expériences de transgénèse chez la drosophile qui prouvent que ces deux USPs répriment la voie Imd en cas d'infection et qu'elles sont requises pour maintenir l'état inactif de la voie Imd en l'absence d'infection. J'ai également entrepris de caractériser l'activité catalytique des deux USPs in vitro. L'originalité de mon travail a consisté à limiter le crible à une famille de gènes, ce qui a permis de détecter de nouveaux régulateurs qui n'avaient pas été mis en évidence dans des cribles antérieurs.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biosciences végétales : Toulouse 3 : 2008. / Titre provenant de l'é215-232.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences de la Vie et de la Santé : Lille 1 : 2005. / N° d'ordre (Lille 1) : 3677. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. p. 185-215.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal