Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T21:11:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tavares_MariaCristinaHenrique_M.pdf: 4778346 bytes, checksum: 04124e579018c8ad7639bb9e72002911 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A incidência de morte celular por apoptose bem como de outros fenômenos de resposta celular ao choque hipertérmico de 40°C, por 1 hora, foi pesquisada em túbulos de Malpighi de ninfas de 4Q estadio e adultos machos de Triatoma infestans (Klug). Foram analisados espécimes bem alimentados e espécimes submetidos a jejum moderado 7, 14 e 30 dias pós-choque, bem como respectivos controles. Foram analisadas montagens totais dos órgãos após reação de Feulgen, teste com ApopTagTM (Oncor) e método de concentração crítica de eletrólitos (CEC), usado para evidenciar núcleos apoptóticos. Com a reação de Feulgen foram bem discriminados e quantificados núcleos com diferentes fenótipos nos túbulos de Malpighi. O teste com ApopTagTM se prestou à descrição de fases precoces do fenômeno de apoptose. O método de CEC foi descartado para estudo de frequências de apoptose por particularidades do material. Ao lado de apoptose, com o choque hipertérmico foi detectada morte celular por necrose e fenômenos admitidos como de sobrevivência celular, como fusão nuclear (núcleos gigantes) e descompactação de heterocromatina, além da maior ftequência de núcleos apresentar fenótipo normal (eficiência de hsp?). Os fenômenos de apoptose, necrose e fusão nuclear colaboram para uma redução na ftequência nuclear total e dos fenótipos normais usuais com o choque térmico. Nas ninfas o choque térmico intensifica o processo de apoptose induzido pelo jejum, especialmente 7 dias após o choque. Já o aumento significativo de necroses é posterior ao das apoptoses (14 dias pós-choque). A descompactação de heterocromatina também é elicitada mais tardiamente após o choque (14 dias) em ninfas bem alimentadas, porém quando este fenótipo é elicitado pelo jejum, sua incidência não se altera com o choque de temperatura. A fusão nuclear é elicitada mais por baixa nutrição do que pelo choque de temperatura, podendo se intensificar quando os dois fatores estressantes são associados. Nos adultos não só a incidência de morte celular é mais baixa como mais tardia, além do que a descompactação de heterocromatina e a fusão de núcleos ser bem pouco frequente, o que nos leva a supor que os mecanismos de sobrevivência celular envolvendo as hsp sejam possivelmente mais eficientes. Com relação aos fenômenos de morte celular descritos, estes não afetaram a sobrevivência dos insetos. No caso dos mbulos de Malpighi a morte de uma certa fração de células pode ser talvez compensada pelos fenômenos de sobrevivência celular, e pelo número e tamanho elevado de células que poderiam executar as funções típicas do órgão sem grandes prejuízos. Quanto à variabilidade nuclear individual frente ao choque hipertérmico e/ou jejum, está de acordo com descrições já efetuadas para T. infestans e Panstrongylus megistus, quando se sugeriu a existência de espécimes com diferentes níveis de resistência à ação deletéria de diferentes estressores / Abstract: The incidence of cell death by apoptosis as well as by other cellular response phenomena to hyperthermal shock at 40°C for 1 hour, was studied in the Malpighian tubules of 4th stage nymphs and adults male of Triatoma infestans Klug. Both well fed specimens and specimens submitted to a moderate fasting 7, 14 and 3 O days post -shock, were analysed, as well as their respective controls. Whole mounts of the organs were analyzed after the Feulgen reaction, ApopTagTM (Oncor) test and critical electrolyte concentration method (CEC), used to show up apoptotic nuclei. Using the Feulgen reaction, nuclei in the Malpighian tubules with different phenotypes were well discriminated and quantified. The ApopTagTM test was used to describe early phases of the apoptosis phenomenon. Due to characteristics of the material, the CEC method was discarded for use in the study of the frequency of apoptosis. Besides apoptosis, other results of the hyperthermal shock were detected, such as cellular death by necrosis and phenomena admitted as being results of cellular survival, such as nuclear fusion (giant nuclei) and decompactation of the heterochromatin, as well as a greater frequency of nuclei presenting the normal phenotype (hsp efficiency?). The phenomena of apoptosis, necrosis and nuclear fusion contributed to a reduction in the total nuclear frequency and of the normal phenotypes usually appearing as a result of thermal shock. In the nymphs, the thermal shock intensified the process of apoptosis induced by the fasting, especially 7 days after the shock. However the significant increase in necrosis carne later than the apoptosis (14 days post-shock). In well fed nymphs, decompactation of the heterochromatin also occured later (14 days), although when this phenotype was induced by fasting, the incidence was not altered by the temperature shock. Nuclear fusion was induced more by inadequate nutrition than by temperature shock, although it could intensify as a result of the association of the two stress factors. In the adults, the incidence of cellular death is both lower and later; and both decompactation of the heterochromatin and nuclear fusion are observed very infrequently,from which one can suppose that the cellular survival mechanisms involving hsp are more efficient. The cellular death phenomena described here do not affect insect survival. In the case of the Malpighian tubules, the death of a certain fraction of the cells maybe be compensated by the cellular survival phenomena and by the increase number and size of cells which could carry out the typical functions of this organ with no problems. With respect to the individual nuclear variability as a result of hyperthermal shock and/ or fasting; this is in agreement with the existing descriptions for Triatoma infestans and Panstrongylus megistus, where the existence of specimens with different levels of resistance to the deleterious action of different stress factors was suggested. / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T19:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvares-Garcia_RosanadeSouza_M.pdf: 4696925 bytes, checksum: 46eaae84993e7bb3655697b9cc6aad13 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Alterações induzidas por radiação gama em fenótipos nucleares definidos em termos de padrões de organização cromatínicos e de áreas nucleares e de heterocromatina foram estudadas em ninfas machos de 5º estádio de Triatoma infestans Os órgãos escolhidos para análise citológica foram túbulos de Malpighi, musculatura, traquéias e testículos. As doses de radiação gama empregadas para se realizar as análises citológicas foram escolhidas com base na construção de curvas de sobrevivência para as ninfas. Os preparados foram submetidos à reação de Feulgen e banda C e as áreas nucleares foram determinadas por cariometria. As curvas de sobrevivência dos insetos irradiados indicaram que a radiação induz redução na expectativa de vida desses Insetos; a dose de radiação que mais drasticamente afetou a sobrevida dos insetos foi 1220Gy (1220/GOmln) Este decréscimo na expectativa de vida pode ter tido como causa um envelhecimento precoce e o fator físico da radiação, que é a taxa de dose. Os resultados mostraram alterações nos fenótipos nucleares das células analisadas, sendo caracterizado como: vacuolizado, picnótico, de heterocromatina descompactada, com compactação da área eucromatica simultânea ou não à descompactação da heterocromatina, gigante e micronúcleos. Além disso, foram também constatados os fenótipos normais usuais. Com relação as alterações nos fenótipos nucleares encontrados nos insetos irradiados, seriam decorrentes de modificações na própria fisiologia cromatínica e/ou corresponderiam a etapas de um processo necrótico celular associado aos efeitos da radiação. A ação mais drástica observada a nível somático, correspondeu ao aparecimento do fenótipo vacuolizado, que afetou os núcleos poliplóides e foi produzido em condições de radiação que mais reduziram a sobrevivência dos insetos. Na linhagem germinativa, por outro lado, alterações sérias apareceram sob a forma de picnose e micronúcleos, a primeira em condições drásticas ou brandas de radiação e a segunda apenas em condições mais drásticas. As áreas eucromáticas mostraram-se mais susceptíveis aos efeitosda radiação que as áreas heterocromáticas, já que são regiões mais ativas da cromatina. Não se descarta a hipótese de que as alterações aparentemente mais brandas em compactação cromatínica nos vários tipos celulares possam induzir a prazo mais longo, alterações severas na sobrevivência dos insetos / Abstract: Alterations induced by gamma radiation in nuclear phenotypes as defined in terms of chromatin organization patterns and nuclear and heterochromatin areas, were studied in 5th instar male nymphs of Triatoma infestans. Malpighlan tubules, muscles, tracheae and testes were the organs chosen for cytological analyses. The choice of the gamma radiation doses used to carry out the cytological analyses was based on the surv1val curves constructed for the nymphs. The preparations were submitted to the C-banding technique and to the Feulgen reaction. The nuclear areas were determined by karyometry. The survival insects indicated that the radiation induced a decrease in the insect survival was that of 1220Gy (1220Gy/60min). The decrease in life expectant could have been caused by premature ageing and the physical factor of the radiation, which is the rete of dos age. The results showed alterations 1n the nuclear phenotypes of the cells analysed. New fenotypes appeared showing being characterized as: vacuolization, picknosis, unraveling of lhe heterochromatin, condensation of the euchromatin area either simullaneously with the unravellingof the heterochromatin. Giant nuclei and micronuclei were also detected. In addition, the usual normal phenotypas were also faund. With respect to the alterations of the nuclear phenotypes found in the irradtated insects, these would be a result of modifications in the actual chromatin physiology and/or would correspond to stages In a cellular necrotic process associated with the effects of Irradiation. At the somatic level, the most drastic action observed was the appearance at nuclear vacuolization, which affected the polyploid nuclei 8nd was produced under those conditions of radiation which most reduced Insect survival. On the other hand, in the male germinative cell line, serious alterations appeared in the forro of pycknosis and micronuclei, the former under both drastic and mild conditions of radiation and the latter under only the most drastic conditions. The euchromatic areas were shown to be more susceptlble to the effects of radiation than the heterochromatin areas, since the former are the more active chromatin regions. The hypothesis that the apparently milder alterations in ehromatin condensation of the various cellular types could induee severe alterations in insect survival on a long term basic, cannot be neglected. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências

En la actualidad, según la Organización Mundial de la Salud (OMS) 2008, se calcula que existe entre 16 a 18 millones de personas a nivel mundial afectadas por el parásito Trypanosoma cruzi, cuyo vector principal es Triatoma infestans. En nuestro país, la enfermedad se presenta en forma endémica en la región sur afectando principalmente a los departamentos costeros de Ica, Arequipa, Moquegua y Tacna. La falta de conocimiento del vector y la mala implementación de programas para su control, han dado como resultado altos índices de mortandad en la población y la adaptación cada vez mejor del insecto al ambiente doméstico y por ende al ser humano. En el presente trabajo, utilizando individuos nativos de Triatoma infestans pertenecientes a las localidades de Santa Rita de Siguas y Nazca, se confirmo el número cromosómico, y aplicando la técnica del bandeo “C”, utilizada para identificar los bloques de heterocromatina y usarlos como marcadores cromosómicos diferenciando el genoma andino del no andino en las poblaciones en estudio. Mediante la posición de los bloques heterocromáticos se han detectado polimorfismos cromosómicos en número y posición a nivel de los autosomas de los individuos intra e interpoblacionales, y se ha podido determinar el tipo de genoma (andino o no andino) para las poblaciones estudiadas. Por primera vez se evidencia la presencia de población con genoma del grupo andino (población de Ica) que aparece a baja altitud. Palabras clave: Bandeo C, Santa Rita de Siguas, Nazca, polimorfismos cromosómicos, bloques de heterocromatina. / --- Currently, according to the World Health Organization (WHO) 2008, it is estimated that between 16 and 18 million people worldwide are affected by the parasite Trypanosoma cruzi, which main vector is Triatoma infestans. The path vector of disease transmission is the main cause of the high levels of disease and mortality. In our country, the disease occurs endemically in the southern region, mainly affecting the coastal departments of Ica, Arequipa, Moquegua and Tacna. The lack of knowledge of the vector and poor implementation of programs for its control, result in high mortality rates in the population and the best ever adaptation of the insect to the home environment, consequently to humans. In the present work, using native individuals of Triatoma infestans from endemic areas for Chagas disease, belonging to the villages of Santa Rita de Siguas and Nazca, and applying cytogenetic techniques such as squash technique it was confirmed the chromosome number. The C-banding technique was used to determinate heterochromatic zones along the chromosome fiber, which allowed the identification of heterochromatin blocks so that they could be used as chromosomal markers in order to be able to differentiate the Andean genome from the no- Andean one in the populations studied. By the position of heterochromatic blocks, chromosomal polymorphisms were detected at the number and position of the autosomes of individuals within and between populations, and the type of genome has been detected (Andean or no-Andean) for the populations studied. It is shown, for the first time, the presence of population with the Andean group genome (population of Ica) that appears at low altitude. Key words: C banding, Santa Rita de Siguas, Nazca, chromosomal polymorphisms, heterochromatin blocks.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-17T20:14:00Z No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T18:44:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_YannaReisPraça.pdf: 8951084 bytes, checksum: 723a2e6a0e521ef29a7ba1303584bf80 (MD5) / Os triatomíneos são artrópodes hematófagos durante todo o seu ciclo de vida e para garantir o sucesso de seu repasto, desenvolveram estratégias adaptativas que contrapõem o sistema hemostático e imune do hospedeiro, injetando moléculas farmacologicamente ativas durante esse processo. Por possuirem diversas moléculas com interesse farmacológico, a saliva desses artrópodes hematófagos passou a ser alvo de pesquisas. Para ampliar o conhecimento sobre essas moléculas, esse trabalho teve como objetivos: 1) investigar a expressão protéica na saliva de Triatoma dimidiata em diferentes tempos após a alimentação sanguínea, por meio da análise proteômica comparativa por LC-MS/MS, eletroforese bidimensional e análises in silico, e 2) caracterizar in silico a sequência aminoacídica do antígeno 5 salivar de Rhodnius neglectus (RNAV), além da expressão dessa molécula em Escherichia coli. A análise proteômica comparativa da saliva de T. dimidiata levou à identificação de 362 proteínas, das quais 65 eram específicas da amostra de cinco dias após a alimentação sanguínea (dpa) e 79 específicas da amostra de 10 dpa, além de contribuir para validar dados do transcritoma dessa espécie disponível na literatura. A análise in silico do RNAV sugere que a molécula é secretada pela via clássica, que modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação devem ocorrer na proteína, e que existem aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos que podem estar presentes em epítopos lineares para células B. Não foi possível obter o RNAV recombinante. O conhecimento das proteínas salivares do T. dimidiata e sua comparação com as de outras espécies de artrópodes hematófagos pode ser útil para entender processos biológicos fundamentais como sobrevivência, adaptação e as interações desses vetores com seus hospedeiros e com os agentes infecciosos que eles são capazes de transmitir. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Triatomine are bloodsucking arthropods throughout their life cycle and to ensure the success of their meal, they have developed adaptive strategies that counteract the hemostatic and immune system of the host, injecting pharmacologically active molecules during this process. By owning several molecules with pharmacological interest, bloodsucking arthropods saliva has become the subject of various research. To enhance our knowledge about these molecules, this study aimed 1) to investigate the protein expression in Triatoma dimidiata saliva at different times after the blood feeding through comparative proteomic analysis using LC-MS/MS, 2-DE electrophoresis and bioinformatics, and 2) to characterize in silico the salivary antigen 5 of Rhodnius neglectus (RNAV), beyond its expressin in Escherichia coli. The comparative proteomic analysis of T. dimidiata saliva revealed 362 proteins, 65 specific of the sample collected 5 days after feeding and 79 specific of the sample collected 10 days after feeding, and aided to validate available data from T. dimidiata transcriptome. RNAV in silico analysis revealed this protein may be secreted by the classical pathway, phosphorilation and glycosilation sites, and the existence of 25 amino acid residues that may be present in linear epitopes to B cells. Our attempt failed to produce recombinant RNAV. Knowing T. dimidiata salivary proteins and comparison with those from other species of hematophagous arthropods may help to understand fundamental biological processes such as survival, adaptation, vector-host and vector-pathogens interactions.

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Os estudos morfológicos das formas imaturas de insetos são escassos. Vários autores reconhecem a importância destes estudos como suporte para classificação desse grupo de organismos. A subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) é composta atualmente por 141 espécies em 18 gêneros. Os triatomíneos, hematófagos obrigatórios, são bem conhecidos pela capacidade de transmitir a doença de Chagas. Todas as espécies, adultos e ninfas, são potenciais transmissores de Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, que é amplamente distribuído no Novo Mundo. Triatoma dimidiata foi descrito por Latreille em 1811; é uma espécie vetora da doença de Chagas em vários países desde o México no extremo norte de distribuição, em todos os países da América Central, como também na Colômbia, Venezuela, Equador e Peru. Este trabalho descreve a morfologia do ovo e das ninfas de T. dimidiata com o uso de microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura. Os ovos são elipsóides com coloração branco brilhante. Comprimento total médio 2,15 ± 0,05 mm. Largura máxima do ovo 1,28 ± 0,02 mm. Corpo e opérculo apresentam exocório com células poligonais irregulares, justapostas, sendo em sua maioria hexagonais; células sem ornamentações. Os cinco instares de T. dimidiata podem ser distinguidos entre si principalmente, pelo aspecto dorsal dos segmentos torácicos. No 1º instar as setas são eretas e nos demais curvas. A superfície do corpo é revestida por cerdas curtas implantadas em tubérculos, estes sendo mais freqüentes com o desenvolvimento. No 1º instar os olhos apresentam omatídeos globosos afastados entre si conferindo um aspecto de amora; nos demais instares aumenta o número de omatídeos e diminui o espaço entre eles. O sulco estridulatório no 1º instar apresenta-se amorfo com estrias centrais paralelas. Nos demais instares o sulco torna-se, progressivamente, alongado, profundo e afilado posteriormente, com estrias paralelas mais próximas entre si. Todos os instares apresentam tricobótrio dorsal no terço apical do segmento II da antena e abertura da glândula de Brindley na mesopleura. As pernas anteriores das ninfas de 5º instar apresentam ctenídio no ápice da face ventral da tíbia. As áreas glabras dorsais, nos terços laterais do abdome, se dispõem da seguinte maneira: 1º instar nos segmentos II a VII, sendo 1+1 no II e 2+2 do III ao VII; nos demais instares, 3+3 do II ao VII. As áreas brilhantes ovais estão localizadas na região mediana ventral dos segmentos IV a VI; ninfas de 1º instar não possuem áreas brilhantes. As placas quitinosas estão presentes em todos os instares sendo que no 1º a placa é retangular, presente apenas no segmento IX; nos demais instares está presente do VII ao IX segmento, sendo, no VII em forma de sino, no VIII oblonga e no IX ocupa toda extensão basal do urosternito. Este estudo visa contribuir para o reconhecimento da espécie a partir das formas imaturas, bem como, auxiliar no esclarecimento da taxonomia e filogenia do grupo. / Studies about the morphology of immatures of the insects are scarce. Several authors recognized the importance of these studies to propose classifications. The subfamily Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) includes 141 species in 18 genera. The triatomines are obligatory hematophagous, and well known as vectors of Chagas disease. Adults and nymphs of all species are potential vectors of Trypanosoma cruzi, the protozoan parasite that causes the disease, which is widely distributed in the New World. Triatoma dimidiata Latreille, 1811 has a wide distribution and is a vector of the Chagas disease in several countries, from north of Mexico, all countries of Central America, Colombia, Venezuela, Equador and Peru. This work described the morphology of eggs and nymphs of T. dimidiata using optic and scanning eletronic microscopy. Eggs are elliptic with white coloration; medium total length of 2,15 ± 0,05 mm, maximum width of 1,28 ± 0,02 mm. Egg body and operculum with exochorion formed by irregular polygonal cells, juxtaposed; cells without sculptures, the majority of them hexagonal in shape. Five instars of T. dimidiata can be distinguished from each other by characteristics of the pre-, meso- and metanotum. Number of setiferous tubercles increases progressively among instars. First instar has erected setae, second to fifth instars have curved setae. Body surface of nymphs covered by short setae inserted in tubercles, more numerous in late instars. First instar nymphs with globular ommatidea, separated to each other, giving a mullberry-like shape to the eye; from second instar on, the number of ommatidea increases, and distance among them decreases. Sulcus stridulatorium of first instar nymphs amorphous, showing median parallel grooves; from second instar on, the sulcus is, progressively, elongate, deep and posteriorly pointed, with the paralell grooves stretched. All instars have a trichobothrium, placed on apical 1/3 of segment II of the antenna; opening of Brindley’s gland placed on mesopleura. Ventral surface of anterior tibia of fifth instar nymphs with apical ctenidium. Dorsal glabrous patches placed on the lateral 1/3 of abdomen as follow: first instar with 1+1 in segment II and 2+2 from segment III to VII; second to fifth instar with 3+3 patches from segment II to VII. Oval bright patches, placed on ventral median line of abdomen, from segment IV to VI; first instar nymphs lack this patches. Abdominal chitinous plates present from first to fifth instar; first instar with a rectangular plate, in segment IX. From second instar on, plates are present from VII to IX segment, variable in shape: bell-like in segment VII, oblong in segment VIII, and rectangular in segment IX, extended toward lateral margins of urosternite. The results here aim to contribute to the identification of T. dimidiata from the immatures stages, as well as provide information for future studies in taxonomy and phylogeny of the group.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A saliva de artrópodos hematófagos constitui um coquetel farmacológico que atua nos sistemas hemostático, inflamatório e imunológico de seus hospedeiros para auxiliar a aquisição do sangue. O inseto T. infestans, vetor da doença de Chagas, apresenta em sua saliva uma série de moléculas e atividades biológicas já descritas. Dentre elas está a trialisina, uma proteína formadora de poros em bicamadas lipídicas. A trialisina é capaz de lisar/permeabilizar diversos tipos celulares e se propõe que a atividade lítica ocorra pela inserção da porção N-terminal da molécula na membrana das células de tal forma a promover a formação de um poro. A identificação do gene que codifica a trialisina mostrou que além de ter uma seqüência sinal de secreção, a proteína conteria uma região ácida no seu N-terminal. Este domínio está ausente na proteína madura purificada da saliva e poderia inibir a ação da trialisina. O objetivo de nosso trabalho foi estudar o mecanismo de lise da trialisina e como se daria a ativação do precursor da trialisina (pró-trialisina) durante a secreção da glândula salivar até a ejeção da saliva. Para entender o mecanismo de ação da trialisina, já que a expressão heteróloga tanto da pró-trialisina quanto da trialisina apresentou várias dificuldades, utilizamos peptídeos sintéticos baseados na região N-terminal da trialisina madura. Os peptídeos mostraram diferentes especificidades para tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, hemácias humanas e Escherichia coli, mas de modo geral, aqueles que continham a maior parte da primeira hélice anfipática predita na trialisina madura apresentaram maior atividade lítica. Todos os peptídeos adquiriam estrutura secundária (α-hélices) na presença de agentes miméticos de membranas. Determinamos as estruturas tridimensionais em solução por Ressonância Magnética Nuclear dos três peptídeos mais ativos e de um pouco ativo e pudemos observar a importância de segmentos distintos de alguns peptídeos nas especificidades dos alvos. 3 Utilizando um anti-soro gerado contra a porção C-terminal da trialisina recombinante (fragmento não-lítico), identificamos a pró-trialisina em extratos de glândulas salivares contendo APMSF, inibidor da ativação da trialisina. O precursor apresentou menor atividade lítica contra tripomastigotas. Embora fosse previsto que o precursor teria uma porção pró de 33 resíduos, a diferença entre as bandas em SDS-PAGE da pró-trialisina e trialisina foi de cerca de 10-15 aminoácidos. Um peptídeo de fluorescência apagada contendo 12 resíduos da porção pró e 27 do N-terminal da trialisina madura foi sintetizado e observamos que sua atividade lítica era aumentada quando a serino-protease salivar triapsina ou endoproteinase Arg-C eram adicionadas, ao mesmo tempo em que o peptídeo alterava sua estrutura, indicando que a porção acídica é responsável pela inibição da lise. Esses resultados permitiram caracterizar o papel do N-terminal da trialisina no processo de lise, identificar o precursor da trialisina na glândula salivar, verificar sua ativação durante a salivação e melhor elaborar um mecanismo pelo qual a atividade é controlada durante o armazenamento da proteína nas glândulas salivares. / Hematophagous arthropods contain in their saliva a pharmacological cocktail that acts on the hemostatic, inflammatory and immune systems of their hosts facilitating blood acquisition. The saliva of the insect T. infestans, vector of Chagas' disease, contains several described molecules and biological activities, among which lies trialysin, a protein that forms pores in lipid bilayers. Trialysin can lyse/permeabilize different cell types and it is proposed that lytic activity is achieved by insertion of the N-terminal portion of the molecule onto a cell membrane forming a pore. The identification of the gene that codes for trialysin has shown that besides a secretion signal sequence, the protein contains an acidic region upstream the mature sequence that is not present in the N-terminus of trialysin purified from saliva and could inhibit the activity of the molecule. Our goal was to study trialysin lytic mechanism and the activation of its precursor (pro-trialysin) from secretion inside the salivary glands to saliva ejection. To understand trialysin action mechanism, since heterologous expression of either protrialysin or trialysin was mostly unsuccessful, we used synthetic peptides based on the Nterminal region of mature trialysin that presented different specificities against T. cruzi trypomastigotes, human erythrocytes and E. coli, but those that encompassed most of the first predicted amphipathic helix in trialysin were more active. All peptides folded into α-helices in the presence of membrane mimetic agents. We solved the tridimensional solution structures by Nuclear Magnetic Resonance of the three most active peptides and a less lytic one and observed that distinct regions of some peptides determine target specificity. Using an anti-serum against the recombinant C-terminal portion of trialysin (non-lytic fragment), we identified pro-trialysin in salivary glands extracts containing APMSF, inhibitor of trialysin activation. The lytic activity of the precursor against trypomastigotes is reduced. 5 Although it was predicted that the precursor would contain a pro-region 33-amino acids long, the difference between the SDS-PAGE trialysin and pro-trialysin bands was around 10-15 residues. Using a fluorescence resonance emission transfer peptide encompassing 12 proregion amino acids and 27 mature N-terminal residues, after incubation with triapsin or endoproteinase Arg-C, an increase in lytic activity was observed. At the same time, the peptide changed its structure indicating this region can impair lysis inside salivary glands. These results allowed us to characterize the role of trialysin N-terminus in the lysis process, identify the trialysin precursor in the salivary gland, and determine the mechanism of activation and lysis control during storage and saliva release. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

BEZERRA, Claudia Mendonça. Hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de Trypanosoma cruzi pelo Triatoma brasiliensis em área de caatinga no município de Tauá – CE. 2013. 147 f. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-08-02T12:56:23Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Traditionally, the control of human transmission of Trypanosoma cruzi is accomplished by the application of insecticides with residual action. However, knowledge about the role of hosts domestic and wild outdoor environments are critical for determining the maintenance and / or dispersion of T. cruzi. This study aimed to characterize the importance of domestic reservoirs, wild and peridomestic transmission of T. cruzi in the rural municipality of Taua (EC), inserted in Caatinga area, with emphasis on environments colonized by Triatoma brasiliensis. Among the animals household and neighbors were considered dogs, cats, pigs, goats and sheep 83 housing units (DUs). In the wild capture and examination was performed on small mammals at three sites with different degrees of antropofização, and also the capture of insects. The survey of domiciliary infestation by triatomines was performed in 251 DUs. Direct parasitological examinations were performed in insects and mammals, animals in serologic household and neighbors, Multiplex PCR on wild reservoirs and research of wild food source for insects. The proportion of infection of pigs was 6% (2/34), ovine 1% (1/102), cats 2.4% (1/41) dogs 38% (20/53). We captured nine species among rodents and marsupials. The Trichomys laurentius, with 74% (83/112), was the most abundant and widely distributed in the wild, followed by rock Kerodon 10% (11/112) and Didelphis albiventris 3.5% (4/112). 749 triatomines were captured in the household survey, with 369 (49.3%) of T. brasiliensis and 377 (50.3%) of Triatoma pseudomaculata. Only specimens of T. brasiliensis were infected with T. cruzi (25, 12.8%). Of these 3 (5.9%) were inside the home and 22 (14%) outside the home. Of the 166 triatomines captured, 132 (79%) were nymphs and other 35 (21%) adults. These, a fifth instar nymph and one male were infected with T. cruzi. The T. brasiliensis sharing the natural environment with T. laurentius, K. rock, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. and M. semistriatus musculus (captured animals) and G. spixii, K. cave, T. oreadicus and T. merianae (identified via food source), and animals observed during the catch (Athene cuniculariae and Felis catus) and confirmed via food source (C. hircus and G. gallus). The movement of the T. cruzi between sylvatic, peridomestic household in mammals and insects emphasizes the possibility of cases of Chagas disease in the studied region, as well as the difficulty and real necessity for its control in semi-arid areas in Northeast Brazil. / Tradicionalmente o controle da transmissão humana do Trypanosoma cruzi é realizado pela aplicação de inseticidas de ação residual. Entretanto, o conhecimento sobre o papel desempenhado por hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres são fundamentais para a determinação da manutenção e/ou dispersão do T. cruzi. Esta pesquisa teve por objetivo caracterizar a importância dos reservatórios domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de T. cruzi na zona rural do município de Tauá (CE), inserido em área de Caatinga, com ênfase nos ambientes colonizados por Triatoma brasiliensis. Dentre os animais domiciliares e peridomiciliares foram considerados cães, gatos, suínos, caprinos e ovinos de 83 unidades domiciliares (UDs). No ambiente silvestre foi realizada captura e exame de pequenos mamíferos em três locais, com diferentes graus de antropofização, e também a captura de triatomíneos. A pesquisa de infestação domiciliar por triatomíneos foi realizada em 251 UDs. Foram realizados exames parasitológicos diretos em insetos e mamíferos, sorológicos em animais domiciliares e peridomiciliares, PCR Multiplex em reservatórios silvestres e pesquisa de fonte alimentar em insetos silvestres. A proporção de infecção para os suínos foi de 6% (2/34), ovinos 1% (1/102), gatos 2,4% (1/41), cães 38% (20/53). Foram capturados nove espécies dentre roedores e marsupiais. O Trichomys laurentius, com 74% (83/112), foi a mais abundante e amplamente distribuída no ambiente silvestre, seguida por Kerodon rupestres 10% (11/112) e Didelphis albiventris 3,5% (4/112). Foram capturados 749 triatomíneos na pesquisa domiciliar, sendo 369 (49,3%) de T. brasiliensis e 377 (50,3%) de Triatoma pseudomaculata. Apenas espécimes de T. brasiliensis estavam infectados por T. cruzi (25, 12,8%). Destes 3 (5,9%) estavam no intradomicílio e 22 (14%) no peridomicílio. Dos 166 triatomíneos silvestres capturados, 132 (79%) eram ninfas e outros 35 (21%) adultos. Destes, uma ninfa de 5º estádio e um macho encontravam-se infectados pelo T. cruzi. O T. brasiliensis partilha o ambiente natural com T. laurentius, K. rupestres, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. semistriatus e M. musculus (animais capturados) e com G. spixii, K. rupestres, T. oreadicus e T. merianae (identificados via fonte alimentar), além de animais observados durante as capturas (Athene cuniculariae e Felis catus) e confirmados via fonte alimentar (C. hircus e G. gallus). A circulação do T. cruzi entre o ambiente silvestre, peridomiciliar e intradomiciliar em mamíferos e insetos enfatiza a possibilidade de ocorrência de casos da doença de Chagas na região estudada, bem como a dificuldade e real necessidade de seu controle em áreas do semiárido no Nordeste Brasileiro.

Os estudos morfológicos das formas imaturas de insetos são escassos. Vários autores reconhecem a importância destes estudos como suporte para classificação desse grupo de organismos. A subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) é composta atualmente por 141 espécies em 18 gêneros. Os triatomíneos, hematófagos obrigatórios, são bem conhecidos pela capacidade de transmitir a doença de Chagas. Todas as espécies, adultos e ninfas, são potenciais transmissores de Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, que é amplamente distribuído no Novo Mundo. Triatoma dimidiata foi descrito por Latreille em 1811; é uma espécie vetora da doença de Chagas em vários países desde o México no extremo norte de distribuição, em todos os países da América Central, como também na Colômbia, Venezuela, Equador e Peru. Este trabalho descreve a morfologia do ovo e das ninfas de T. dimidiata com o uso de microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura. Os ovos são elipsóides com coloração branco brilhante. Comprimento total médio 2,15 ± 0,05 mm. Largura máxima do ovo 1,28 ± 0,02 mm. Corpo e opérculo apresentam exocório com células poligonais irregulares, justapostas, sendo em sua maioria hexagonais; células sem ornamentações. Os cinco instares de T. dimidiata podem ser distinguidos entre si principalmente, pelo aspecto dorsal dos segmentos torácicos. No 1º instar as setas são eretas e nos demais curvas. A superfície do corpo é revestida por cerdas curtas implantadas em tubérculos, estes sendo mais freqüentes com o desenvolvimento. No 1º instar os olhos apresentam omatídeos globosos afastados entre si conferindo um aspecto de amora; nos demais instares aumenta o número de omatídeos e diminui o espaço entre eles. O sulco estridulatório no 1º instar apresenta-se amorfo com estrias centrais paralelas. Nos demais instares o sulco torna-se, progressivamente, alongado, profundo e afilado posteriormente, com estrias paralelas mais próximas entre si. Todos os instares apresentam tricobótrio dorsal no terço apical do segmento II da antena e abertura da glândula de Brindley na mesopleura. As pernas anteriores das ninfas de 5º instar apresentam ctenídio no ápice da face ventral da tíbia. As áreas glabras dorsais, nos terços laterais do abdome, se dispõem da seguinte maneira: 1º instar nos segmentos II a VII, sendo 1+1 no II e 2+2 do III ao VII; nos demais instares, 3+3 do II ao VII. As áreas brilhantes ovais estão localizadas na região mediana ventral dos segmentos IV a VI; ninfas de 1º instar não possuem áreas brilhantes. As placas quitinosas estão presentes em todos os instares sendo que no 1º a placa é retangular, presente apenas no segmento IX; nos demais instares está presente do VII ao IX segmento, sendo, no VII em forma de sino, no VIII oblonga e no IX ocupa toda extensão basal do urosternito. Este estudo visa contribuir para o reconhecimento da espécie a partir das formas imaturas, bem como, auxiliar no esclarecimento da taxonomia e filogenia do grupo. / Studies about the morphology of immatures of the insects are scarce. Several authors recognized the importance of these studies to propose classifications. The subfamily Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) includes 141 species in 18 genera. The triatomines are obligatory hematophagous, and well known as vectors of Chagas disease. Adults and nymphs of all species are potential vectors of Trypanosoma cruzi, the protozoan parasite that causes the disease, which is widely distributed in the New World. Triatoma dimidiata Latreille, 1811 has a wide distribution and is a vector of the Chagas disease in several countries, from north of Mexico, all countries of Central America, Colombia, Venezuela, Equador and Peru. This work described the morphology of eggs and nymphs of T. dimidiata using optic and scanning eletronic microscopy. Eggs are elliptic with white coloration; medium total length of 2,15 ± 0,05 mm, maximum width of 1,28 ± 0,02 mm. Egg body and operculum with exochorion formed by irregular polygonal cells, juxtaposed; cells without sculptures, the majority of them hexagonal in shape. Five instars of T. dimidiata can be distinguished from each other by characteristics of the pre-, meso- and metanotum. Number of setiferous tubercles increases progressively among instars. First instar has erected setae, second to fifth instars have curved setae. Body surface of nymphs covered by short setae inserted in tubercles, more numerous in late instars. First instar nymphs with globular ommatidea, separated to each other, giving a mullberry-like shape to the eye; from second instar on, the number of ommatidea increases, and distance among them decreases. Sulcus stridulatorium of first instar nymphs amorphous, showing median parallel grooves; from second instar on, the sulcus is, progressively, elongate, deep and posteriorly pointed, with the paralell grooves stretched. All instars have a trichobothrium, placed on apical 1/3 of segment II of the antenna; opening of Brindley’s gland placed on mesopleura. Ventral surface of anterior tibia of fifth instar nymphs with apical ctenidium. Dorsal glabrous patches placed on the lateral 1/3 of abdomen as follow: first instar with 1+1 in segment II and 2+2 from segment III to VII; second to fifth instar with 3+3 patches from segment II to VII. Oval bright patches, placed on ventral median line of abdomen, from segment IV to VI; first instar nymphs lack this patches. Abdominal chitinous plates present from first to fifth instar; first instar with a rectangular plate, in segment IX. From second instar on, plates are present from VII to IX segment, variable in shape: bell-like in segment VII, oblong in segment VIII, and rectangular in segment IX, extended toward lateral margins of urosternite. The results here aim to contribute to the identification of T. dimidiata from the immatures stages, as well as provide information for future studies in taxonomy and phylogeny of the group.

Os estudos morfológicos das formas imaturas de insetos são escassos. Vários autores reconhecem a importância destes estudos como suporte para classificação desse grupo de organismos. A subfamília Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) é composta atualmente por 141 espécies em 18 gêneros. Os triatomíneos, hematófagos obrigatórios, são bem conhecidos pela capacidade de transmitir a doença de Chagas. Todas as espécies, adultos e ninfas, são potenciais transmissores de Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, que é amplamente distribuído no Novo Mundo. Triatoma dimidiata foi descrito por Latreille em 1811; é uma espécie vetora da doença de Chagas em vários países desde o México no extremo norte de distribuição, em todos os países da América Central, como também na Colômbia, Venezuela, Equador e Peru. Este trabalho descreve a morfologia do ovo e das ninfas de T. dimidiata com o uso de microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura. Os ovos são elipsóides com coloração branco brilhante. Comprimento total médio 2,15 ± 0,05 mm. Largura máxima do ovo 1,28 ± 0,02 mm. Corpo e opérculo apresentam exocório com células poligonais irregulares, justapostas, sendo em sua maioria hexagonais; células sem ornamentações. Os cinco instares de T. dimidiata podem ser distinguidos entre si principalmente, pelo aspecto dorsal dos segmentos torácicos. No 1º instar as setas são eretas e nos demais curvas. A superfície do corpo é revestida por cerdas curtas implantadas em tubérculos, estes sendo mais freqüentes com o desenvolvimento. No 1º instar os olhos apresentam omatídeos globosos afastados entre si conferindo um aspecto de amora; nos demais instares aumenta o número de omatídeos e diminui o espaço entre eles. O sulco estridulatório no 1º instar apresenta-se amorfo com estrias centrais paralelas. Nos demais instares o sulco torna-se, progressivamente, alongado, profundo e afilado posteriormente, com estrias paralelas mais próximas entre si. Todos os instares apresentam tricobótrio dorsal no terço apical do segmento II da antena e abertura da glândula de Brindley na mesopleura. As pernas anteriores das ninfas de 5º instar apresentam ctenídio no ápice da face ventral da tíbia. As áreas glabras dorsais, nos terços laterais do abdome, se dispõem da seguinte maneira: 1º instar nos segmentos II a VII, sendo 1+1 no II e 2+2 do III ao VII; nos demais instares, 3+3 do II ao VII. As áreas brilhantes ovais estão localizadas na região mediana ventral dos segmentos IV a VI; ninfas de 1º instar não possuem áreas brilhantes. As placas quitinosas estão presentes em todos os instares sendo que no 1º a placa é retangular, presente apenas no segmento IX; nos demais instares está presente do VII ao IX segmento, sendo, no VII em forma de sino, no VIII oblonga e no IX ocupa toda extensão basal do urosternito. Este estudo visa contribuir para o reconhecimento da espécie a partir das formas imaturas, bem como, auxiliar no esclarecimento da taxonomia e filogenia do grupo. / Studies about the morphology of immatures of the insects are scarce. Several authors recognized the importance of these studies to propose classifications. The subfamily Triatominae (Hemiptera, Reduviidae) includes 141 species in 18 genera. The triatomines are obligatory hematophagous, and well known as vectors of Chagas disease. Adults and nymphs of all species are potential vectors of Trypanosoma cruzi, the protozoan parasite that causes the disease, which is widely distributed in the New World. Triatoma dimidiata Latreille, 1811 has a wide distribution and is a vector of the Chagas disease in several countries, from north of Mexico, all countries of Central America, Colombia, Venezuela, Equador and Peru. This work described the morphology of eggs and nymphs of T. dimidiata using optic and scanning eletronic microscopy. Eggs are elliptic with white coloration; medium total length of 2,15 ± 0,05 mm, maximum width of 1,28 ± 0,02 mm. Egg body and operculum with exochorion formed by irregular polygonal cells, juxtaposed; cells without sculptures, the majority of them hexagonal in shape. Five instars of T. dimidiata can be distinguished from each other by characteristics of the pre-, meso- and metanotum. Number of setiferous tubercles increases progressively among instars. First instar has erected setae, second to fifth instars have curved setae. Body surface of nymphs covered by short setae inserted in tubercles, more numerous in late instars. First instar nymphs with globular ommatidea, separated to each other, giving a mullberry-like shape to the eye; from second instar on, the number of ommatidea increases, and distance among them decreases. Sulcus stridulatorium of first instar nymphs amorphous, showing median parallel grooves; from second instar on, the sulcus is, progressively, elongate, deep and posteriorly pointed, with the paralell grooves stretched. All instars have a trichobothrium, placed on apical 1/3 of segment II of the antenna; opening of Brindley’s gland placed on mesopleura. Ventral surface of anterior tibia of fifth instar nymphs with apical ctenidium. Dorsal glabrous patches placed on the lateral 1/3 of abdomen as follow: first instar with 1+1 in segment II and 2+2 from segment III to VII; second to fifth instar with 3+3 patches from segment II to VII. Oval bright patches, placed on ventral median line of abdomen, from segment IV to VI; first instar nymphs lack this patches. Abdominal chitinous plates present from first to fifth instar; first instar with a rectangular plate, in segment IX. From second instar on, plates are present from VII to IX segment, variable in shape: bell-like in segment VII, oblong in segment VIII, and rectangular in segment IX, extended toward lateral margins of urosternite. The results here aim to contribute to the identification of T. dimidiata from the immatures stages, as well as provide information for future studies in taxonomy and phylogeny of the group.