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Effects of Histone Deacetylase Inhibitors on Vitamin D Activity in Human Breast Cancer CellsSavage, Brooke 01 January 2013 (has links) (PDF)
Breast cancer is one of the leading causes of death in women cancer cases worldwide. Cancer is the result of environmental and genetic factors that contribute to alterations in cellular control, proliferation, differentiation and apoptosis. Vitamin D is emerging as an important nutrient in the prevention and treatment of cancer due to its ability to modulate proliferation and apoptosis in vivo and in vitro. To accomplish this, Vitamin D exerts its biological activity by binding to a specific, high-affinity intracellular vitamin D receptor (VDR). VDR expression is identified in mammary cancer cell lines, but levels are reduced compared to non-cancerous cells, which limits vitamin D-induced gene expression. Our study investigated two compounds with histone deacetylase inhibitor (HDACI) activity, trichostatin A (TSA), and sulforaphane (SFN), and how they influence the expression of vitamin D-induced gene expression. By isolating mRNA to create cDNA, we were able to run RT-PCR to analyze the overall gene expression. The genes investigated were: CYP24A1, CYP27B1, VDR and TRPV6. We found that in MCF-7 breast cancer cells, 1,25(OH)2D3 treatment alone induced the expression of VDR, CYP24A1 and CYP27B1. TRPV6 mRNA expression was not evident. TSA alone increased expression of VDR and CYP24A1, but SFN alone had no effect. Co-treatments of 1,25(OH)2D3 and TSA raised CYP24A1, but not significantly. Co-treatments with SFN seemed to decrease CYP24A1 expression, not significantly. Our findings support further study of the effects of the HDACI TSA in breast cancer, and suggest that this HDACI may be beneficial in augmenting vitamin D cellular responsiveness.
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The development of zebrafish (<i>Danio rerio</i>) as a rapid and efficient model system for therapeutic drug screening for Spinal Muscular AtrophyLindquist, Tera M. 26 September 2011 (has links)
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Estudo da regulação da expressão do gene da proteína prion celular / Cellular prion protein gene expression regulationCabral, Ana Lucia Beirão 26 July 2001 (has links)
A conversão da proteína prion celular normal (PrPc), cuja função ainda esta sob investigação, para a forma infecciosa (PrPsc) é a causa de algumas doenças neurodegenerativas em humanos e animais. Vários estudos têm sido realizados e mostram que PrPc pode participar de processos normais como memória, estresse oxidativo, neuritogênese e outros. Portanto, a elucidação dos processos de regulação de sua expressão é importante tanto para definir uma estratégia para controlar a infecção quanto para entender melhor a função fisiológica de PrPc. Este trabalho tem por objetivo avaliar a expressão do gene de PrPc, a partir da regulação da atividade de seu promotor frente a drogas que foram eleitas de acordo com a composição dos elementos de resposta a fatores de transcrição nele contidos. Para isto o promotor foi clonado em um vetor contendo o gene \"reporter\" de luciferase, células C6 e PC-12 foram transfectadas e clones com expressão estável de luciferase foram selecionados. Os resultados dos tratamentos dos clones celulares mostram que éster de forbol (TPA) e AMPc induzem a atividade do promotor de 1,5 a 3 vezes, ácido retinóico (RA) diminui esta atividade em cerca de 50% enquanto que NGF e Dexametasona não têm efeito. A dependência da conformação da cromatina na regulação deste gene também foi testada utilizando-se Tricostatina A (TSA), esta droga foi capaz de aumentar de 10 a 4.000 vezes a atividade do promotor, o que foi seguida tanto pela indução de expressão do RNAm quanto da proteína PrPc. Este efeito parece não ser generalizado a todos os promotores uma vez que esta droga não alterou expressão de GAPDH e de β-actina. Quando TPA e AMPc foram associados à TSA uma potencialização do efeito indutor destas drogas foi observada e a associação de RA e TSA mostrou que RA reduz a indução gerada por TSA. Estes novos dados indicam que a regulação de PrPc é extremamente dependente da conformação da cromatina. / Conversion of the cellular normal prion protein (PrPc), whose physiological function is still under investigation, to an infectious form called prion is the cause of some neurodegenerative diseases. Therefore, the elucidation of PrPc gene regulation is important both to define a strategy to control the infection and to better understand PrPc function. We cloned the rat PrPc gene promoter region into a luciferase reporter vector, transfected C6 and PC-12 cells and isolated clones with stable luciferase expression. The phorbol ester TPA and cAMP induced promoter activity by 1.5 to 3 times, retinoic acid decreased it by 50% while NGF and dexamethasone had no effect. We also tested the dependence of chromatin conformation for PrPc promoter activity using Trichostatin A (TSA), which was able to highly increase not only promoter activity but also PrPc rnRNA and protein leveIs. Moreover, the TSA effect seems to be restricted since any alteration was observed regarding GAPDH (Glyiceraldehyde 3-phosphate desydrogenase) and β-actin expression. When cAMP, TPA or retinoic acid were associated with TSA a potentiation of their primary effects was observed. These new data indicate that PrPc gene regulation is highly dependent on disruption of chromatin fiber assembly what permits assess of trascription factors.
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Efeitos epigenéticos sobre a diferenciação in vitro de mioblastos e a expressão dos genes CAST e CAPN1 em bovinosOliveira, Alexandre de Lima 20 September 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013-09-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 μM, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 μM, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 μM, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 μM, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 μM, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 μM, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1.
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Estudo da regulação da expressão do gene da proteína prion celular / Cellular prion protein gene expression regulationAna Lucia Beirão Cabral 26 July 2001 (has links)
A conversão da proteína prion celular normal (PrPc), cuja função ainda esta sob investigação, para a forma infecciosa (PrPsc) é a causa de algumas doenças neurodegenerativas em humanos e animais. Vários estudos têm sido realizados e mostram que PrPc pode participar de processos normais como memória, estresse oxidativo, neuritogênese e outros. Portanto, a elucidação dos processos de regulação de sua expressão é importante tanto para definir uma estratégia para controlar a infecção quanto para entender melhor a função fisiológica de PrPc. Este trabalho tem por objetivo avaliar a expressão do gene de PrPc, a partir da regulação da atividade de seu promotor frente a drogas que foram eleitas de acordo com a composição dos elementos de resposta a fatores de transcrição nele contidos. Para isto o promotor foi clonado em um vetor contendo o gene \"reporter\" de luciferase, células C6 e PC-12 foram transfectadas e clones com expressão estável de luciferase foram selecionados. Os resultados dos tratamentos dos clones celulares mostram que éster de forbol (TPA) e AMPc induzem a atividade do promotor de 1,5 a 3 vezes, ácido retinóico (RA) diminui esta atividade em cerca de 50% enquanto que NGF e Dexametasona não têm efeito. A dependência da conformação da cromatina na regulação deste gene também foi testada utilizando-se Tricostatina A (TSA), esta droga foi capaz de aumentar de 10 a 4.000 vezes a atividade do promotor, o que foi seguida tanto pela indução de expressão do RNAm quanto da proteína PrPc. Este efeito parece não ser generalizado a todos os promotores uma vez que esta droga não alterou expressão de GAPDH e de β-actina. Quando TPA e AMPc foram associados à TSA uma potencialização do efeito indutor destas drogas foi observada e a associação de RA e TSA mostrou que RA reduz a indução gerada por TSA. Estes novos dados indicam que a regulação de PrPc é extremamente dependente da conformação da cromatina. / Conversion of the cellular normal prion protein (PrPc), whose physiological function is still under investigation, to an infectious form called prion is the cause of some neurodegenerative diseases. Therefore, the elucidation of PrPc gene regulation is important both to define a strategy to control the infection and to better understand PrPc function. We cloned the rat PrPc gene promoter region into a luciferase reporter vector, transfected C6 and PC-12 cells and isolated clones with stable luciferase expression. The phorbol ester TPA and cAMP induced promoter activity by 1.5 to 3 times, retinoic acid decreased it by 50% while NGF and dexamethasone had no effect. We also tested the dependence of chromatin conformation for PrPc promoter activity using Trichostatin A (TSA), which was able to highly increase not only promoter activity but also PrPc rnRNA and protein leveIs. Moreover, the TSA effect seems to be restricted since any alteration was observed regarding GAPDH (Glyiceraldehyde 3-phosphate desydrogenase) and β-actin expression. When cAMP, TPA or retinoic acid were associated with TSA a potentiation of their primary effects was observed. These new data indicate that PrPc gene regulation is highly dependent on disruption of chromatin fiber assembly what permits assess of trascription factors.
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Uso de agentes modificadores de cromatina na transferência nuclear de células somáticas em bovinos / Use of chromatin modifying agents in bovine somatic cell nuclear transferSangalli, Juliano Rodrigues 13 December 2011 (has links)
Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.
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Uso de agentes modificadores de cromatina na transferência nuclear de células somáticas em bovinos / Use of chromatin modifying agents in bovine somatic cell nuclear transferJuliano Rodrigues Sangalli 13 December 2011 (has links)
Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.
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Imunoterapie nádorů asociovaných s virem HPV16 a regulace protinádorové imunitní odpovědi / Immunotherapy of HPV16 - associated cancers and regulation of antitumour immune responseŠtěpánek, Ivan January 2013 (has links)
The MHC class I status of tumour cells during immunotherapy is often underestimated. It represents one of important tumour escape mechanisms and thus can contribute to the failure of most of the cancer clinical trials that are usually based on the induction of cytotoxic T cell responses. Epigenetic changes in the promoters of genes involved in the MHC class I Ag presentation can result in decreased expression of the cell surface MHC molecules on tumour cells. Thus, epigenetic modifiers can restore an expression of the MHC class I molecules and make tumours visible to the CD8+ effector cells. Besides the epigenetic changes on the tumour cells, epigenetic modulators affect cells of the immune system such as dendritic cells (DC). Tumour cells can escape from the immune response not only by changes in the cancer cells, but also by influencing, expanding and/or activating immunoregulatory cell populations, such as regulatory T cells (Treg). This thesis focuses on the potential of the DC-based vaccines against HPV-16-associated tumours with a different MHC class I expression, on the combination of cancer immunotherapy with the treatment using epigenetic modifiers, with special attention paid to their effects on DC, and, finally, on the impacts of the anti-CD25 antibody (used for Treg elimination) on Treg and NKT...
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